Summary
هنا، يمكننا وصف أسلوب ثقافة المشارك في المختبر إلى بشكل متكرر التحدي المستهدفة لورم خلايا تي، الذي يسمح بتحليل النشاط انتيتومور تي خلية المظهرية والوظيفية.
Abstract
ميدان العلاج خلايا تي مستقبلات (السيارات) مستضد تشيميريك تتقدم سريعاً مع إدخال تحسينات على تصميم السيارات، ونهج هندسة الجينات والتصنيع لتحسين الأداء. ومع ذلك، تحديا لجهود التنمية، وهذه قد إنشاء فحوصات في المختبر التي يمكن أن تبلغ قوة مختارة منتجات الخلية "تي السيارة" المثلى للنجاح العلاجي المجراة. فحوصات الأورام في المختبر القياسية-تحلل غالباً ما لا تعكس الإمكانيات الحقيقية انتيتومور الخلايا T السيارة بسبب الوقت ثقافة المشارك قصيرة نسبيا وارتفاع الخلية تي إلى نسبة الورم. هنا، يمكننا وصف أسلوب ثقافة المشارك في المختبر لتقييم العودية خلية T السيارة مما أسفر عن مصرع المحتملة في الأحمال خلية الورم عالية. في هذا التحليل، وظيفة السامة للخلايا طويلة الأجل والتكاثري قدرة خلايا "تي السيارة" فحص في المختبر على مدى 7 أيام مع أهداف إضافية الورم يدار بثقافة المشارك كل يوم. يمكن أن يقترن هذا التحليل إلى التنميط تي خلية التنشيط واستنفاد وتعمل الذاكرة. استخدام هذا الفحص، ونحن قد ميزت بنجاح الاختلافات الوظيفية والمظهرية بين خلايا CD4+ و CD8+ "سيارة تي" الخلايا ضد جليوبلاستوما الخلايا (GBM)، مما يعكس نشاطهم انتيتومور المجراة في فرق في أورثوتوبيك نماذج إكسينوجرافت. يوفر هذا الأسلوب نهجاً سهلة لتقييم فاعلية الخلية T السيارة وتوضيح الاختلافات الوظيفية عبر منتجات الخلية T سيارات مختلفة.
Introduction
العلاج المناعي باستخدام مستقبلات مستضد تشيميريك (سيارة)-المهندسة تي الخلايا شهد نتائج واعدة ضد خلية بالاورام الخبيثة1،2،3،4، مع إمكانية استهداف الأورام الأخرى لا تزال قيد التحقيق الدقيق5،،من67. وقد أحرز تقدم كبير لتحسين بناء السيارة، وعملية التصنيع وأنظمة قبل ضخ المريض6،،من78، والبيولوجيا التركيبية رواية النهج من المتوقع أن تزيد هذه الثبات والسلامة والورم خصوصية9،10. ومع ذلك، كان صعباً وكثيفة العمالة على نحو ملائم تقييم إمكانية العلاجية للخلايا T السيارة من أجل توجيه أفضل خيار للترجمة السريرية. النموذج الأكثر رسوخا حتى الآن لتقييم الدالة الخلية T السيارة في الفئران العوز واضعة تكثيفها الأورام البشرية، حيث درست لفعالية انتيتومور خلايا "تي السيارة" ومقارنة في الخلية معاير جرعات11،12 , 13 , 14 , 15-هذه الدراسات المجراة في مورين كثيفة العمالة وتستغرق وقتاً طويلاً، لا سيما عند فحص عدد كبير من المعلمات. يمكن ضبط النفس الدراسات المجراة في أخرى، ومن إمكانية الحصول على سلالات الماوس ومرافق رعاية الحيوان وتقنيات معالجة الحيوان. ولذلك، هناك حاجة إلى وضع أكثر ملاءمة فحوصات في المختبر يسمح بقراءات سريعة للنشاط المستجيب، والتي تعكس أيضا إخلاص الدالة انتيتومور المجراة في هذه الخلايا T.
الأساليب التقليدية لتحديد سيتوتوكسيسيتي تي الخلايا في المختبر ركزت على كشف تحبب وإنتاج سيتوكين والقدرة على الخلايا الهدف المسمى النظائر المشعة (أي فحوصات الإفراج عن الكروم). في حين مفيدة لتحديد الخلية "تي سيارة" خصوصية والاعتراف بهدف توجيه هذه الاختبارات، أنهم كثيرا ما تعجز تعكس إمكانات انتيتومور المجراة في هندستها تي الخلايا12،،من1316. وفي بعض الحالات، في المختبر قتل النشاط في المدى القصير فحوصات أظهرت علاقة عكسية مع الدالة انتيتومور المجراة في16. وهذا التضارب من المرجح نتيجة لنسب عالية المستجيب: الهدف (E:T) المستخدمة في هذه الاختبارات في المختبر، ومن ثم عدم القدرة على التفريق بين منتجات الخلية T السيارة التي عرضه لاستنفاد17. على النقيض من ذلك، أثناء استئصال الورم المجراة في تي الخلايا عادة الاستجابة ضد أعباء كبيرة الورم، مما يتطلب جولات متعددة من قتل وبعد ذلك يقود خلية T التمايز واستنفاد18،19، 20، واحد العوائق الرئيسية ضد إزالة الورم فعالة من T سيارات خلايا12،13. وفي الوقت نفسه، أقصرها قتل في المختبر فحوصات كما تفعل لا قراءات الاختلافات في تكاثر الخلايا T، بينما في "سيارة تي" خلية معاملة المرضى القدرة على توسيع الخلية T السيارة يرتبط بقوة مع الردود السريرية4. وهكذا، الفحص في المختبر المناسب سيحتاج إلى إيجاز أوضاع العبء الورم عالية، تنظيم دورات تعريفية لاستنفاد الخلايا T، ويسمح بقراءات توسيع الخلية T.
هنا يصف لنا استراتيجية لتقييم الخلايا T السيارة للورم المتكررة مما أسفر عن مصرع المحتملة، مع مقايسة بسيطة ثقافة المشارك في المختبر. يمكن فحص خلية T مختلفة المستجيب معلمات النشاط في وقت واحد، بما في ذلك قتل الخلية المستهدفة وتوسيع الخلية T السيارة وتعمل الذاكرة أو استنفاد المرتبطة. النتائج التي تم إنشاؤها من هذا التحليل ترتبط أيضا بتأثير انتيتومور المجراة في خلايا "تي السيارة"، ويمكن أن تستغل لتقييم فاعلية منتجات الخلية T السيارة. بينما يصف لنا تحليل تقييم الخلايا المستهدفة IL13Ra2 "تي سيارة" ضد خطوط الخليج للحاسبات الآلية الأساسية21، أنه يمكن سهولة تكييفها لأي منصة خلية T السيارة.
Protocol
لدينا مجلس الهجرة واللاجئين لا تتطلب مراجعة لهذا البروتوكول. نحن تلقي عينات الورم جليوبلاستوما الطازجة المهملة من "المدينة من الأمل في الباثولوجيا الإدارة" التي يتم ترميز، وأن معملنا لا يمكن الوصول إلى المفتاح. أننا نتلقى العينات مع البيانات فقط في حالة العلاج والأمراض السابقة في وقت خزعة/بتر، مع أية بيانات تعريف.
1-إعداد وسائط الإعلام
- تحضير الوسائط العصبية من الخلايا الجذعية لاستزراع خطوط الخلايا الأولية في الخليج للحاسبات الآلية: DMEM:F12، 01:50 B27، 5 ميكروغرام/مل الهيبارين، و 2 ملمول/لتر لتر-الجلوتامين؛ وتستكمل مع 20 عامل نمو البشرة من نانوغرام/مليلتر (مماثلة) و 20 عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية نانوغرام/مليلتر (صندوق الأجيال القادمة) مرتين في أسبوع (انظر الجدول للمواد).
- تحضير الوسائط خلية T: 15 س-فيفو التي تحتوي على 10% مصل العجل الجنين (FCS)؛ وتستكمل مع رحيل-2، و 0.5 نانوغرام/مليلتر 70 وحدة دولية/مل رحيل-15 كل 48 ساعة (انظر الجدول للمواد).
- تعد وسائل الإعلام ثقافة المشارك: اتخاذ وسائط الخلايا الجذعية العصبية دون تكملة مماثلة وصندوق الأجيال القادمة، وإضافة 10% FCS.
- إعداد نظام مراقبة الأصول الميدانية تلطيخ الحل (FSS): هبس، 2% سفح المنحدر القاري، نان3 (0.5 غ/500 مل).
2-إعداد الخلايا السرطانية GBM
- حصاد منخفضة-مرور الخليج للحاسبات الآلية الورم المجالات (TSs) بالطرد المركزي في 300 x ز لمدة 4 دقائق وتجاهل المادة طافية.
ملاحظة: ورم الخليج للحاسبات الآلية في مجالات (TSs) يتم إنشاؤها من مستأصل الأورام كما هو موضح سابقا22،،من2324، والاحتفاظ بها في وسائل الإعلام الخلايا الجذعية العصبية، في حضانات مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية. - وسائط الثقافة المشارك قبل الحارة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- إضافة 1 مل أككوتاسي الباردة "خدمات الدعم التقني في الخليج للحاسبات الآلية" وننأى بخدمات الدعم التقني التي بيبيتينج عن 30-60 ثانية ووقف التفكك بإضافة 5 مل وسائط الثقافة المشارك الحارة.
ملاحظة: لا ينبغي أن تظل "خدمات الخليج للحاسبات الآلية" في أككوتاسي لأكثر من 5 دقائق. - حصاد الخلايا الخليج للحاسبات الآلية باستخدام الطرد المركزي في 300 x غ لمدة 4 دقائق وتجاهل المادة طافية ريسوسبيند الخلايا في 2 مل وسائط الثقافة المشتركة.
- تحديد تركيز الخلية باستخدام عداد بقاء خلية.
ملاحظة: يجب أن تكون صلاحية الخلية > 70%.
3-إعداد الخلايا T السيارة
- أقل من 24 ساعة قبل الفحص، تأخذ 100 ميليلتر من خلايا "تي سيارة" مثقف في أنبوب تدفق الخلوي وإضافة 2 مل الوكالة.
ملاحظة: سيارة تي الخلايا المتولدة كما هو موضح سابقا11،21 ومثقف في الخلية تي وسائل الإعلام. - الطرد المركزي في 300 x ز 4 دقيقة وتجاهل المادة طافية.
- إضافة 2 مل من قسم الدعم المالي لغسل الخلايا، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x غ ل 4 دقيقة، وتجاهل المادة طافية.
- وصمة عار في الخلايا التي تحتوي على الأجسام المضادة المناسبة للإشارة إلى تعبير السيارة عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان وصف سيارة استهدفت IL13Rα2 سابقا25 يستخدم، ثم وصمة عار مع الأجسام المضادة IL13. - تغسل مرتين مع 2 مل من قسم الدعم المالي وتحليل اكسن سيارة استخدام cytometer تدفق.
- تحديد % سيارة في خلايا تي استخدام استراتيجية النابضة هو مبين في الشكل 1ب.
- في يوم الثقافة المشارك، حصاد جميع خلايا "تي السيارة" بالطرد المركزي في 300 x غ لمدة 4 دقائق وتجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 2 مل وسائط الثقافة المشتركة.
- تحديد تركيز الخلية باستخدام عداد بقاء خلية.
ملاحظة: يجب أن تكون صلاحية الخلية > 70%.
4-إعداد الورم – زراعة الخلايا T المشارك
- تمييع الخلايا السرطانية إلى تركز 0.16 مليون/مل مع وسائل الإعلام ثقافة المشارك.
- استناداً إلى سيارة %، تضعف خلايا "تي السيارة" إلى تركيز 0.04 مليون سيارة+ خلايا/مل مع وسائل الإعلام ثقافة المشارك.
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كانت السيارة هي 50% وتركيز خلية T 0.4 مليون/ملليلتر، ثم جعل إضعاف 1:5 للحصول على تركيز 0.04 مليون سيارة+ خلايا/مل النهائي. - "الماصة؛" 100 ميليلتر من الخلايا السرطانية المخفف في كل من لوحة زراعة الأنسجة 96-جيدا مسطحة القاع جيدا.
- "الماصة؛" 100 ميليلتر من خلايا "تي سيارة" مخففة في كل بئر يحتوي على خلايا الورم ومزيج جيد.
ملاحظة: وسيتم تحليل كل خلية الورم-T ثقافة المشارك في نقاط زمنية 4. 4-6 replicates قد تكون مطلوبة في كل مرة نقطة استناداً إلى تحليل مختلف، ولكن < لا ينصح replicates 3 كل مرة نقطة؛ انظر الجدول 1 بلاتيماب ممثل. - الحفاظ على اللوحة في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة.
5-ورم الخلايا ريتشالينجي
ملاحظة: ويجري ريتشالينجي في 2 و 4 و 6 أيام بعد الإعداد الأولى ثقافة المشارك (الشكل 1أ).
- الحصاد وفصل "خدمات الخليج للحاسبات الآلية" كما هو موضح أعلاه (خطوات 2.1-2.6).
- ريسوسبيند GBM الخلايا بتركيز 0.64 مليون/مل.
- تحديد الآبار الثقافة المشتركة التي تحتاج إلى ريتشالينجي (انظر الجدول 1) وإزالة 50 ميليلتر الإعلام بعناية من الجزء العلوي من كل بئر.
- إضافة 50 ميليلتر من تعليق خلية في الخليج للحاسبات الآلية في كل بئر وتخلط جيدا، ثم وضع اللوحة إلى 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة.
6-حصاد العينات وتحليل سيتوميتريك تدفق
ملاحظة: وسوف تحصد عينات في آخر أيام 1، 3، 5 و 7 تقريب الإعداد الأولية ثقافة المشارك، مع 1، 2، 3 و 4 من الورم والتحدي، على التوالي.
- الحل يدتا التربسين 0.05% قبل الحارة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- تحديد الآبار التي تحتاج إلى تجميع وتحويل وسائل الإعلام إلى لوحة 96-جيدا أسفل الجولة جديدة.
- "الماصة؛" 50 ميليلتر من التربسين أدتا إلى الآبار لهضم الخلايا السرطانية المتبقية في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- تحت مجهر، تأكيد فصل الخلايا من القاعدة إلى القمة.
- "الماصة؛" حول الجزء السفلي جيدا ريسوسبيند خلايا منفصلة، ثم نقل التربسين-يدتا التي تحتوي على خلايا منفصلة للآبار المقابلة للجولة-أسفل لوحة 96-جيدا.
- أجهزة الطرد المركزي الجولة-أسفل لوحة 96-جيدا في 300 x غ، 4 درجة مئوية لمدة دقيقة 4، ثم تجاهل المادة طافية.
- إضافة من قسم الدعم المالي لغسل في الخلايا، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x غ، 4 درجة مئوية لمدة دقيقة 4 200 ميليلتر/جيدا، ثم تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر/بئر FSS تحتوي على الأجسام المضادة (انظر الجدول للمواد)، ووصمة عار الخلايا عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إضافة 100 ميليلتر/بئر الوكالة إلى الخلايا، والطرد المركزي في 300 x غ، 4 درجة مئوية لمدة دقيقة 4، ثم تجاهل المادة طافية.
- إضافة من قسم الدعم المالي لغسل في الخلايا، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x غ، 4 درجة مئوية لمدة دقيقة 4 200 ميليلتر/جيدا، ثم تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند الخلايا التي تحتوي على 100-200 ميليلتر/جيدا من الوكالة مع 500 نانوغرام/مليلتر DAPI، ثم تحليل العينات بالتدفق الخلوي.
7-الوظيفية وتحليل أوتيبيك فينو لخلايا تي السيارة
- استرداد ملفات البيانات من تدفق سيتوميتير، وبوابة كل حية (DAPI) خلايا (الشكل 1ج).
- تحديد الخلايا السرطانية النابضة CD45– السكان وخلايا "تي السيارة" قبل النابضة CD45+، سيارة + السكان (الشكل 1ج).
ملاحظة: إذا كان التعبير عن ورم الخلايا CD45 (مثل خلايا الأورام اللمفاوية راجي)، تلطيخ المضادة CD3 يمكن استخدامها للتفريق بين الخلايا T من الخلايا السرطانية. - ارسم ورم الخلية وعدد الخلايا T سيارات خلال الوقت.
- تحديد الخلية تي التنشيط بالتعبير المشارك 4-1BB و CD69.
ملاحظة: يمكن استخدام هذه العلامات السطحية لتحليل الخلية تي التنشيط ح 6-24 وظيفة الأولى ثقافة المشارك. - تحديد استنفاد الخلايا T بالتعبير عن PD-1، 3-تأخر وتيم-3.
- تحديد حالة الذاكرة خلية T بالتعبير عن CD45RO و CD62L.
Representative Results
استخدام التحليل الوارد وصفها أعلاه، أننا قد ميزت فاعلية المستجيب التفاضلية وقتل ديناميات توسط CD4+ و CD8+ "سيارة تي" الخلايا. النتائج المعروضة هنا توضيح الفرق بين خلايا CD4+ و CD8+ "سيارة تي" الخلايا، المتولدة من مانح صحية مستقلة لدينا المنشور السابق21.
من خلال مقايسة تحبب قياسية، استطعنا أن نلاحظ أن كلا CD4+ و CD8+ "تي السيارة" أصبح على قدم المساواة بتنشيط خلايا ضد الخلايا الخليج للحاسبات الآلية التي تعبر عن مستضد المستهدفة، كما هو مبين بالتعبير عن CD107a وسيتوكين داخل الخلايا (الشكل 2أ). ومع ذلك، باستخدام مقايسة التحدي الورم المتكررة، وجدنا أن خلايا CD4+ لكن لا CD8+ "تي سيارة" الخلايا أظهرت القدرة على قتل متعددة-الجولة (الشكل 2ب). خلايا CD4 خلايا+ "تي السيارة" أيضا حققت التوسع أفضل بالمقارنة مع CD8 + الخلايا أثناء هذا الفحص (الشكل 2-ج). اختلاف التوسع بين مجموعات فرعية خلية T السيارة فقط لوحظت من D3 بعد جولتين من ورم التحدي (1:12 E:T)، في حين لوحظ اختلاف سيتوتوكسيسيتي بداية في الخلية D5 بعد ثلاث جولات من ورم التحدي (20 1: E:T)، مما يدل على أن فشل الاختبارات القصيرة الأجل توضيح الفروق في فاعلية منتجات الخلية T سيارات مختلفة. متى 1:1 مختلطة CD4+ و CD8+ "تي سيارة" الخلايا تطبق على هذا التحليل، أن وجدوا أن يتفوق CD8+ لكن لا CD4 الخلايا+ "تي السيارة" على المدى الطويل سيتوتوكسيسيتي (الشكل 2ب). توسيع CD8+ "تي سيارة" حملت الخلايا بخلايا CD4 التطبيقية شارك+ الخلايا، بينما خلايا CD4+ توسيع الخلية "تي سيارة" كانت تحول دون حضور CD8+ الخلايا (الشكل 2-ج).
لشرح الآلية التي تميز نشاط المستجيب بين خلايا CD4+ و CD8 الخلايا+ "تي السيارة"، نؤكد أولاً أن ح 24 بعد الأولى شارك الثقافة، سواء CD4+ و CD8+ "تي سيارة" كانت خلايا نشطة نسبيا (رقم 3 A). ومن ناحية أخرى، كما يتضح من التعبير CD45RO و CD62L، سواء CD4+ و CD8+ "تي سيارة" الخلايا أظهرت تحولاً من الذاكرة المركزية (CD45RO+، CD62L+) إلى ذاكرة المستجيب (CD45RO+، CD62L–) النمط الظاهري خلال التحدي الورم المتكررة (الشكل 3ب). ثم أننا تتميز الخلايا في D3 من هذا التحليل، وقتاً قبل بدء مجموعات فرعية خلية T السيارة عرض الفرق الفنية. اتسم استنفاد الخلايا t بالتعبير المشترك عن المستقبلات المثبطة PD-1, 3 متخلفة وتيم-315،21، التي أظهرت أن CD8+ "تي سيارة" كانوا أكثر عرضه لاستنفاد مقارنة مع خلايا CD4 خلايا+ "سيارة تي" الخلايا ( الشكل 3 ج). علاوة على ذلك، كان ينظر لا فرق في CD8+ استنفاد خلية T السيارة في حضور/الغياب CD4 التطبيقية شارك الخلايا+ (الشكل 3ج)، مما يشير إلى أن CD8 CD4 المستحثة+ توسيع الخلية T السيارة ليست المرتبطة بوظيفة أفضل من المستجيب.
معا، حددت النتائج من هذا التحليل أن CD4+ T سيارات خلايا CD8 فاق+ الخلايا على وجه التحديد في سيتوتوكسيسيتي طويلة الأجل. على الرغم من سيتوتوكسيسيتي قصيرة مماثلة (1-3 أيام، مرة واحدة ريتشالينجيد)، خلايا CD4 خلايا+ "تي سيارة" وظيفة المستجيب المطرد على التحدي الورم المتكررة، بينما CD8+ أصبح استنفاد الخلايا وفشل في السيطرة على نمو الخلايا السرطانية. عندما كانت مختلطة مجموعات فرعية اثنين، خلايا CD4+ T سيارات خلايا تيسير التوسع في CD8 الخلايا+ "تي السيارة"، لكن حالة استنفاد CD8+ لا تحسن الخلايا، أدى إلى عدم وجود تأثير تآزري بين المجموعتين. فرق مماثلة بين خلايا CD4+ و CD8+ "تي السيارة" شوهد في نموذج المجراة في الخلايا كما هو موضح سابقا21. في الواقع، CD8+ T سيارات خلايا كانت قادرة على التوسط من أجل إزالة ورم قصيرة الأجل لكن المتبع مع تكرار مستضد إيجابي؛ وفي المقابل، خلايا CD4+ "تي السيارة" خلية العلاج أدى طويلة الأجل استئصال الورم21، ويذكرنا بامكاناتهم القتل المتكررة باستخدام مقايسة ريتشالينجي في المختبر.
الشكل 1 : استراتيجية المخطط وتحليل لتحليل التحديات المتكررة. مخطط (أ) والجدول الزمني للمقايسة التحدي الورم المتكررة. لكل بئر، مثقف يشترك مع خلايا GBM PBT030-2 (4,000 سيارة + الخلايا والخلايا السرطانية 16,000) خلايا "تي السيارة" أولاً وإعادة الطعن مع الخلايا السرطانية 32,000 كل يوم (D2، D4 ودال/6). يتم إجراء تحليل لخلية الورم وعدد الخلايا T السيارة، فضلا عن "سيارة تي" خلية النمط الظاهري في D1، D3، D5 و D7. (ب) النابضة استراتيجية لتحديد السيارة % في تي الخلايا قبل إعداد ثقافة المشارك. (ج) النابضة استراتيجية الخلايا الحية والخلايا السرطانية وخلايا "تي السيارة" من الفحص التحدي المتكررة. (د) ورم الخلايا عدد في أوقات مختلفة للفحص ريتشالينجي، شارك مثقف مع خلايا تي أونترانسدوسيد. أشرطة الخطأ = ±SEM. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تحدي المتكررة التحليل يكشف عن الفروق في فاعلية القتل والتكاثري بين خلايا CD4+ و CD8+ "تي سيارة" الخلايا. تحبب (A) وتلطيخ سيتوكين داخل الخلايا من خلايا CD4+ و CD8 الخلايا+ "تي السيارة" بعد ح 5 الثقافة المشارك مع الخلايا الخليج للحاسبات الآلية (E:T = 1:1). (ب) خلايا CD4+، CD8+ أو مختلطة (CD4:CD8 = 1:1) خلايا "تي سيارة" طبقت المقايسة التحدي المتكرر، وتم قياس كمية الخلايا السرطانية قادرة على البقاء. ف < 0.05، * *ف < 0.01، * * *ف < 0.001 بالمقارنة مع خلايا CD4+، استخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع "اختبارات" في بونفيروني المقارنة متعددة. (ج) خلايا CD4+ و CD8+ توسيع الخلية "تي سيارة" خلال المقايسة التحدي الورم المتكررة. مقارنة بين (اليسار إلى اليمين) CD4+ مقابل CD8+، مجموعة فرعية واحدة؛ خلايا CD4+ مقابل CD8+، ضمن مجموعة "مختلطة"؛ خلايا CD4+، واحد مقابل مختلطة؛ CD8+، واحد مقابل مختلطة. ف < 0.05، * *ف < 0.01، * * *ف < 0.001 باستخدام اختبار t الطالب مزاوج. أشرطة الخطأ = ±SEM. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تحليل لخلية تي النمط الظاهري خلال المقايسة التحدي المتكررة. (أ) 4-1BB وتلطيخ CD69 في خلايا "تي السيارة" في D1 المقايسة. (ب) CD45RO و CD62L تلطيخ الخلايا T السيارة قبل تطبيق ريتشالينجي المقايسة (المدخلات)، وفي D3 و D7 المقايسة. التعبير المشارك (ج) PD-1، تأخر-3 وتيم-3 في خلايا "تي السيارة" في D3 المقايسة. (أعلى) النابضة استراتيجيات لتحديد الخلايا T معربا عن المستقبلات المثبطة 1 أو 2 أو 3. (أسفل) مقارنة بين: CD4+ الخلايا (مجموعة فرعية واحدة)، CD8+ الخلايا (مجموعة فرعية واحدة)، CD8 الخلايا+ (ضمن مجموعة "المختلطة"). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: خريطة لوحة تمثيلية للإعداد ريتشالينجي.
Discussion
يوفر هذا التحليل التحدي خلية الورم المتكررة نهج مناسب لتقييم "تي السيارة" خلية الفاعلية الوظيفية، إعداد في المختبر الذي يجمل عبء الورم المرتفعة المرتبطة بورم المجراة في النماذج باستخدام. أثناء هذا الفحص 7 أيام، تخضع خلايا "تي سيارة" أربع جولات من التحدي الورم (ثقافة المشاركة الأولى و 3 x ريتشالينجي)، خلق بيئة حيث استنفدت تي الخلايا قد تفقد قدرتها على الاستجابة للتحدي الورم على الرغم من استجابة أولية قوية. القضاء على خلايا الورم وتوسيع الخلية T السيارة تمثل اثنين من قراءات الأساسية التي يمكن الحصول عليها من هذا التحليل، في حين تعمل الخلايا T السيارة يمكن تحليلها بسهولة تلطيخ العلامات السطحية أو داخل الخلايا التي تشير إلى الخلية تي التنشيط، استنفاد و/أو الذاكرة. هذا التحليل أيضا مناسبة للجمع بين التحليل غير منحاز الترنسكربيتوم خلايا "تي السيارة" والبروتين أو البروتين الفوسفور21،26وخلية تي بوليفونكتيوناليتي الذي تم اعتماده للتنبؤ بالاستجابات السريرية27. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا اختبار الخلايا السرطانية لهذه الاستجابة التكيفية ضد الحصانة خلية T مثل سيتوكين إفراز28. منذ العينات يتم حصادها في نقاط زمنية متعددة، يسمح هذا الفحص لثابت، بل وأيضا التحليل الديناميكي لسلوك الخلية T السيارة عند الاستجابة للعدد الزائد من الخلايا السرطانية.
المقايسة قوية بشكل خاص في مقارنة فاعلية المستجيب للخلايا T السيارة استهداف مستضد نفس ولكن مع تصاميم مختلفة و/أو عمليات التصنيع. وقد استخدمنا هذا التحليل إلى تحديد تلك CD4+ "تي سيارة" الخلايا كانت قادرة على التوسط متفوقة الدالة المستجيب طويلة الأجل من CD8 الخلايا+ 21. وتبين أيضا أن فعالية المجراة في سيارة كان يرتبط مع سيتوتوكسيسيتي في وقت لاحق النقاط (D5-D7) أثناء هذا الفحص، كذلك تسليط الضوء على ضرورة استخدام التحدي الورم المتكررة لتقييم خلية T السيارة في المختبر. على الرغم من أن الخلايا GBM استخدمت كمثال الخلايا الهدف هنا، يمكن اعتماد هذا التحليل بسهولة إلى تركيبة ورم تي خلية مختلفة. جدير بالذكر أن سلوك الخلية "تي سيارة" يمكن أن تختلف أيضا عند مستضد مختلف الكثافات وهندسة الخلايا السرطانية للتعبير عن مستويات مختلفة من المستضدات المستهدفة تقدم الأداة للتحقيق في الأحداث الجزيئية متسلسلة على سيارة الاعتراف29. ولذلك، يمكن أيضا استغلالها هذا التحليل لدراسة نمط تنشيط خلايا "تي سيارة" معينة ضد أهداف مختلفة.
نظراً لبقاء الخلية المستهدفة وتوسيع الخلية "تي سيارة" اثنين قراءات مقدما لهذا التحليل، من الأهمية بمكان أن جميع الثقافات المشتركة تبدأ قابلة للتطبيق (> 70%) الورم والخلايا T. عند إجراء عمليات ريتشالينجي، ينبغي عدم الإزعاج عمل وسائل الإعلام يسفط (الخطوة 5، 3) خلايا تي في الجزء السفلي من الآبار، كي لا يعرض الاختلافات لا لزوم لها من التهم الخلايا والورم. عند إجراء هذا الفحص على تعليق خطوط الخلية المستهدفة، من المستحسن لحصاد الخلايا المتبقية بالطرد المركزي قبل ورم الخلايا ريتشالينجي.
واحد الحد من هذا التحليل أن معلمات الإعداد (نسب E:T الثقافة المشتركة الأولى وريتشالينجي) يحتاج إلى تعديلها استناداً إلى تركيبات مختلفة من ورم في السيارة. على سبيل المثال، إذا كانت الخلايا السرطانية أعرب قدرا كبيرا من الجزيئات المناعية المثبطة (مثلاً PD-L1)، أعلى نسبة E:T المستحسن نظراً لأن الشاملة مما أسفر عن مصرع الكفاءة ضعف مقارنة مع الخلايا السرطانية PD-L1-منخفض. قبل تطبيق المقايسة على تركيبات الورم سيارة جديدة، ينصح دراسة تجريبية لتحديد الشروط المثلى، التي عادة ما يسمح الخلايا T سيارات أقوى اختبار في مقايسة للقضاء على > 80% خلايا السرطانية عند نقطة النهاية. نظراً للاتصال المباشر خلية-خلية المسبق للخلية T بوساطة قتلت سيارة، إذا كانت الخلايا السرطانية المسمى الأسفار، ثم لوحة لتحليل تدفق سيتوميتريك يجب تعديلها تبعاً لذلك (مثلاً إذا كانت الخلايا السرطانية المسمى بروتينات فلورية خضراء، ثم أي مترافق فيتك الأجسام المضادة ينبغي عدم استخدامها).
نشاط الخلايا T سيارات ضد الأورام الخبيثة خلية بالسريريه أدى إلى اثنين من المخدرات وافقت إدارة الأغذية والعقاقير. ومع ذلك، أظهرت الاستجابة اختلاف كبير عبر مختلف المرضى27،،من3031، التي تم توضيحها ترتبط بالخصائص المظهرية ل منتجات السيارات30. هذا التحليل التحدي الورم المتكررة في المختبر كذلك توفر نهجاً لاختبار فاعلية سيارات المستجيب بالإضافة إلى الأوصاف المظهرية وإنتاج سيتوكين بوليفونكتيوناليتي وظيفيا، ويسمح لفرز أعلى من الناتج منتجات الإكلينيكية مقارنة بالنماذج الحية في الورم مع الحفاظ على الدقة التنبؤية. عموما، يمكن استخدام هذا التحليل للخلية T اختبار وظيفي "سيارة تي" خلية تصميم وتطوير ما قبل السريرية والسريرية.
Disclosures
تم الترخيص في بناء السيارة الموصوفة في هذا العمل بالفرس بيو., Inc.، التي S.J.F.، ويصبح الحصول على مدفوعات الإتاوات. أن تعلن جميع المؤلفين الآخرين لا تضارب محتمل في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل منح مقدمة من معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (سيرم) منحة TR3-05641 والمعاهد الوطنية للصحة منح P30 CA33572 (النوى). جاف معتمد من قبل لجنة التحقيق الوطنية زمالة 1F99CA234923-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS without Calcium and Magnesium | Corning | MT25051CI | |
| 1 M Hepes | Irvine Scientific | 9319 | |
| 200 mM L-Glutamine | Cambrex Bio Science | 17-605E | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) - FluoroPure grade | Invitrogen | D21490 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Aldesleukin Proleukin (rhIL-2) | Novartis Oncology | NDC 0078-0495-61 | |
| Anti-CD137, PE | BD Biosciences | 555956 | 4B4-1 |
| Anti-CD19, PE-Cy7 | BD Biosciences | 557835 | SJ25C1 |
| Anti-CD3, PERCP | BD Biosciences | 340663 | SK7 |
| Anti-CD4, FITC | BD Biosciences | 340133 | SK3 |
| Anti-CD45, PERCP | BD Biosciences | 340665 | 2D1 |
| Anti-CD45RO, PE | BD Biosciences | 561137 | UCHL1 |
| Anti-CD62L, APC | BD Biosciences | 559772 | DREG-56 |
| Anti-CD69, APC | BD Biosciences | 340560 | L78 |
| Anti-CD8, APC-Cy7 | BD Biosciences | 348793 | SK1 |
| Anti-IL-13, PE | BD Biosciences | 340508 | JES10-5A2 |
| Anti-LAG-3, PE | eBiosciences | 12-2239-41 | 3DS223H |
| Anti-PD-1, APC-Cy7 | BioLegend | 329921 | EH12.2H7 |
| Anti-TIM-3, APC | eBiosciences | 17-3109-42 | F38-2E2 |
| B-27 Serum-Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596) | Corning Life Sciences | 3596 | |
| Defined fetal bovine serum,HI IR | Hyclone Labs | SH30070.03IH | |
| DMEM F-12 50:50 (1x) without Glutamine | MediaTech, Inc. | 15-090-CV | |
| DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L | Invitrogen | 11960051 | |
| DMEM-Ham's F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES | Fisher Scientific | MT10092CV | |
| HBSS | Irvine Scientific | 9224 | |
| Heat-Inactivated FCS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Heparin Sodium(1,000 U/mL) | American Pharmaceutical | 401811B | |
| MACSQuant | Milteni Biotech Inc. | BIS013220 | |
| PBS 1x W/CA & MG | Irvine Scientific | 9236 | |
| PBS with 1 mM EDTA (No Ca2+ or Mg2+) | VWR Scientific Products | PB15009A | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG-200 | |
| Recombinant human FGF | R&D Systems | 233-FB | |
| rhIL-15 Working Dilution (10 ng/µL) | CellGenix, US Operations | tF0297 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S8032 | |
| Sorvall ST40R | Thermo Scientific | 41693700 | |
| TC-HEPES BUFFER (1 M) SOLN 100ML | IRVINE SCIENTIFIC CORP | 6472 | |
| Tecnol Procedure Mask | Kimberly-Clark | 47117 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BW04-744Q |
References
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Lee, D. W., et al. T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial. The Lancet. 385 (9967), 517-528 (2015).
- Yong, C. S. M., et al. CAR T-cell therapy of solid tumors. Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).
- Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric antigen receptor therapy for cancer. Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).
- Priceman, S. J., Forman, S. J., Brown, C. E. Smart CARs engineered for cancer immunotherapy. Current Opinion in Oncology. 27 (6), 466-474 (2015).
- Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 566-581 (2016).
- Esensten, J. H., Bluestone, J. A., Lim, W. A. Engineering Therapeutic T Cells: From Synthetic Biology to Clinical Trials. Annual Review of Pathology. 12, 305-330 (2017).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
- Brown, C. E., et al. Optimization of IL13Ralpha2-Targeted Chimeric Antigen Receptor T Cells for Improved Anti-tumor Efficacy against Glioblastoma. Molecular Therapy. , (2017).
- Long, A. H., et al. 4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors. Nature Medicine. 21 (6), 581-590 (2015).
- Cherkassky, L., et al. Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition. The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3130-3144 (2016).
- Priceman, S. J., et al. Co-stimulatory signaling determines tumor antigen sensitivity and persistence of CAR T cells targeting PSCA+ metastatic prostate cancer. Oncoimmunology. 7 (2), 1380764 (2018).
- Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
- Gattinoni, L., et al. Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).
- Malandro, N., et al. Clonal Abundance of Tumor-Specific CD4(+) T Cells Potentiates Efficacy and Alters Susceptibility to Exhaustion. Immunity. 44 (1), 179-193 (2016).
- Gattinoni, L., et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).
- Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
- Gattinoni, L., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell. Nature Reviews Cancer. 12 (10), 671-684 (2012).
- Wang, D., et al. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), (2018).
- Kahlon, K. S., et al. Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells. Cancer Research. 64 (24), 9160-9166 (2004).
- Brown, C. E., et al. Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells. Cancer Research. 69 (23), 8886-8893 (2009).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
- Salter, A. I., et al. Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function. Science Signaling. 11 (544), (2018).
- Rossi, J., et al. Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL. Blood. 132 (8), 804-814 (2018).
- Garcia-Diaz, A., et al. Interferon Receptor Signaling Pathways Regulating PD-L1 and PD-L2 Expression. Cell Reports. 19 (6), 1189-1201 (2017).
- Walker, A. J., et al. Tumor Antigen and Receptor Densities Regulate Efficacy of a Chimeric Antigen Receptor Targeting Anaplastic Lymphoma Kinase. Molecular Therapy. 25 (9), 2189-2201 (2017).
- Fraietta, J. A., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
- Fraietta, J. A., et al. Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells. Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).
