Summary
Aqui, descrevemos um método in vitro co-cultura para recursivamente desafio tumor-alvo as células T, que permite a análise fenotípica e funcional da atividade antitumoral de célula T.
Abstract
O campo da terapia de células T antígeno quimérico do receptor (carro) está a avançar rapidamente com melhorias no projeto do carro, abordagens de gene-engenharia e fabricação otimizações. Um desafio para estes esforços de desenvolvimento, no entanto, tem sido o estabelecimento de ensaios in vitro que robustamente pode informar a seleção dos produtos célula T carro ideais para o sucesso terapêutico em vivo. Ensaios in vitro padrão do tumor-lise frequentemente não reflectem o verdadeiro potencial antitumoral das células T de carro devido ao tempo relativamente curto co-cultura e pilha de T elevada à relação do tumor. Aqui, descrevemos um método de cultura in vitro de co para avaliar recursiva de célula T de carro matando potencial em cargas de célula de tumor elevado. Neste ensaio, a longo prazo função citotóxica e capacidade proliferativa de células T de carro é examinado em vitro durante 7 dias com alvos adicionais tumor administrados à cultura co todos os dias. Este ensaio pode ser acoplado a ativação de célula T de perfil, o cansaço e fenótipos de memória. Usando este ensaio, termos distintos com êxito as diferenças funcionais e fenotípicas entre CD4+ e CD8+ carro T células contra glioblastoma (GBM), reflectindo a sua actividade antitumoral in vivo diferencial em ortotópico modelos de enxerto. Este método fornece uma abordagem superficial para avaliar a potência de célula T de carro e para elucidar as variações funcionais em diferentes produtos de célula T de carro.
Introduction
Imunoterapia usando o receptor de antígeno Quimérico (carro)-Engenharia de células T tem visto resultados promissores contra células B malignidades1,2,3,4, enquanto o potencial de atingir outros tumores continua a estar sob investigação rigorosa5,6,7. Grande progresso tem sido feito para otimizar a construção do carro, processo de fabricação e paciente pré-infusão de regimes6,7,8, e abordagens de biologia sintética romance são esperadas para aumentar sua persistência, segurança e tumor especificidade9,10. No entanto, tem sido difícil e trabalhoso para avaliar adequadamente o potencial terapêutico de células T do carro para orientar a melhor escolha para tradução clínica. O modelo mais estabelecido até agora para avaliar a função de célula T de carro é em camundongos imunodeficientes rolamento xenografts tumor humano, no qual células T de carro são examinadas para eficácia antitumoral e comparadas às células titulada doses11,12 , 13 , 14 , 15. estes estudos murino in vivo são trabalhosa e demorada, especialmente quando um grande número de parâmetros de rastreio. Estudos in vivo, mais podem ser contidos pela acessibilidade de cepas de rato, instalações de cuidados com animais e técnicas de manipulação de animais. Portanto, há uma necessidade de desenvolver mais convenientes ensaios in vitro, permitindo a rápida leituras de atividade efetoras, que reflectem também fielmente a função antitumoral in vivo destas células T.
Métodos convencionais para determinar a citotoxicidade das células T in vitro centraram-se na detecção de degranulação, produção de citocinas e a capacidade de lyse pilhas radioisótopo-etiquetadas do alvo (ou seja, ensaios de liberação de cromo). Enquanto estes ensaios são informativos para definir a especificidade de célula T de carro e redirecionada alvo de reconhecimento, eles muitas vezes não reflectem o potencial antitumoral in vivo de engenharia T células12,13,16. Em certos casos, em vitro matar atividade em ensaios de curto prazo mostrou uma correlação inversa com função antitumoral in vivo16. Tal inconsistência é provavelmente o resultado de rácios de alta effector: alvo (E:T) usado nestes ensaios in vitro e, portanto, a incapacidade para diferenciar produtos de célula T de carro que são propensos a exaustão17. Por outro lado, durante a erradicação do tumor em vivo T células geralmente respondem contra sobrecargas de tumor grande, que exige várias rodadas de matar e posteriormente dirigir a célula T diferenciação e exaustão18,19, 20, que é uma das principais barreiras contra afastamento de tumor eficaz por carro T células12,13. Enquanto isso, mais a curto prazo ensaios in vitro de matança também fazer não leitura diferenças na proliferação de células T, Considerando que em carro T célula Tratado pacientes a capacidade de expansão de célula T de carro é fortemente correlacionada com respostas clínicas4. Assim, o ensaio in vitro apropriado seria necessário para recapitular as condições de carga alta tumor, indução de células T de exaustão e permite a leitura de expansão de células T.
Aqui nós descrevemos uma estratégia para avaliar as pilhas de T do carro para tumor repetitiva matando potencial, com um ensaio simples co-cultura in-vitro. Parâmetros de atividade diferentes células T efetoras podem ser examinados simultaneamente, incluindo a morte de célula de destino, expansão de célula T de carro e fenótipos associados a memória ou exaustão. Os resultados gerados a partir deste ensaio se correlacionam bem com o efeito antitumoral in vivo de células T de carro e podem ser explorados para avaliar a potência dos produtos de célula T de carro. Enquanto nós descrevemos um ensaio para avaliar as células T de carro IL13Ra2-alvo contra primário GBM linhas21, pode ser facilmente adaptado para qualquer plataforma de célula T de carro.
Protocol
Nossa IRB não exige a revisão do presente protocolo. Recebemos amostras de tumor glioblastoma fresco descartados da cidade de Hope departamento de patologia que são codificados, e o nosso laboratório não consegue ter acesso à chave. Nós recebemos os espécimes com dados somente em estado de doença e tratamento prévio no momento da biópsia/ressecção, sem dados de identificação.
1. preparação de mídia
- Preparar a mídia de células-tronco neurais para cultivo de linhas de células GBM primárias: DMEM:F12, 01:50 B27, 5 µ g/mL heparina e 2 mmol/L, L-glutamina; suplementado com ng/mL 20 fator de crescimento epidérmico (EGF) e fator de crescimento de fibroblastos básico de ng/mL 20 (FGF) duas vezes por semana (ver Tabela de materiais).
- Preparar a mídia de célula T: 15 X-VIVO contendo 10% de soro fetal bezerro (FCS); suplementado com 70 UI/mL rhIL-2 e 0,5 ng/mL rhIL-15 cada 48 h (ver a Tabela de materiais).
- Preparar meios de cultura co: levar células-tronco neurais mídias sem suplemento de EGF e FGF, e adicionar 10% FCS.
- Preparar FACS coloração solução (FSS): HBSS, 2% FCS, NaN3 (0,5 g/500 mL).
2. preparação de células de Tumor GBM
- Colheita de esferas de tumor GBM baixa passagem (TSs) por centrifugação a 300 x g durante 4 min e descartar o sobrenadante.
Nota: Tumor GBM esferas (TSs) são geradas a partir ressecados tumores conforme descrito anteriormente,22,23,24e mantidos em meios de comunicação de células-tronco neurais, em incubadoras com 5% CO2 a 37 ° C. - Meios de cultura co pre-aquecido em banho maria a 37 ° C.
- Adicionar 1 mL de accutase frio para GBM TSs, dissociar TSs pipetando para 30-60 s e parar de dissociação pela adição de 5 mL de meios de cultura co quente.
Nota: GBM TSs não devem ser mantidos em accutase por mais de 5 min. - Colheita de células GBM por centrifugação a 300 x g durante 4 min, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 mL de meios de cultura co.
- Determine a concentração de células usando um contador de viabilidade celular.
Nota: Viabilidade celular deve ser > 70%.
3. preparação de células T de carro
- Menos de 24 horas antes do ensaio, ter 100 µ l de células T de carro cultivadas em um tubo de citometria de fluxo e adicionar 2 mL de FSS.
Nota: As pilhas de T do carro foram geradas conforme descrito anteriormente,11,21 e cultivadas em meios de célula T. - Centrifugação a 300 x g durante 4 min e descarte sobrenadante.
- Adicionar 2 mL de FSS para lavar as células, centrifugar x 300 g por 4 min e descartar o sobrenadante.
- Manche as células com anticorpo adequado para indicar a expressão carro a 4 ° C por 30 min.
Nota: Por exemplo, se um carro IL13Rα2-alvo descrito anteriormente25 é usado, então mancha com anticorpo anti-IL13. - Lave duas vezes com 2 mL de FSS e analisar carro exn usando um citômetro de fluxo.
- Determine a % de carro em células T, usando a estratégia associada mostrada na Figura 1B.
- No dia da co-cultura, recolher todas as pilhas de T de carro por centrifugação a 300 x g durante 4 min, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 mL de meios de cultura co.
- Determine a concentração de células usando um contador de viabilidade celular.
Nota: Viabilidade celular deve ser > 70%.
4. configurar o tumor — co-cultura de células T
- Dilua as células do tumor para uma concentração de 0,16 milhões/mL, com meios de cultura co.
- Baseado no carro %, diluir as células T de carro a uma concentração de 0,04 milhões carro+ células/mL com meios de cultura co.
Nota: Por exemplo, se o carro é de 50% e a concentração de células T é 0,4 milhões/mL, em seguida, fazer uma diluição de 1:5 para obter a concentração final de 0,04 milhões carro+ células/mL. - Pipete 100 µ l de células tumorais diluídos para cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços de fundo plano.
- Pipete 100 µ l de células de carro T diluídas em cada poço que contém células de tumor e mistura bem.
Nota: Cada co-cultura de células de tumor-T será analisada em 4 pontos de tempo. 4-6 repetições podem ser necessárias em cada vez ponto com base na análise de diferente, mas < 3 repetições por ponto de tempo não é recomendado; consulte a tabela 1 para um representante platemap. - Manter a placa em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora.
5. tumor Cell reexposição
Nota: Reexposição ocorre em 2, 4 e 6 dias posto o setup inicial co-cultura (Figura 1A).
- Colheita e dissociar GBM TSs, como descrito acima (passos 2.1-2.6).
- Ressuspender as células GBM em uma concentração de 0,64 milhões/mL.
- Determinar os poços de co-cultura que precisam reexposição (ver tabela 1) e remova cuidadosamente os meios de comunicação 50 social µ l da parte superior de cada poço.
- Adicionar 50 µ l de suspensão de células GBM em cada poço e misture bem e, em seguida, volte a colocar a placa na 37 ° C, 5% CO2 incubadora.
6. colheita de amostras e fluxo Cytometric Analysis
Nota: Amostras de irão ser colhidas no posto de 1, 3, 5 e 7 dias, que a configuração inicial co-cultura, com 1, 2, 3 e 4 rodadas de desafio de tumor, respectivamente.
- Pré-aquecer a solução de tripsina-EDTA 0,05% em banho-maria 37 ° C.
- Determine os poços que precisam da colheita e transferir os meios de comunicação para uma nova placa de 96 poços de fundo redondo.
- Pipete 50 µ l de tripsina-EDTA para os poços a digerir as células remanescentes do tumor a 37 ° C por 5 min.
- Sob um microscópio, confirme que as células têm destacado do fundo.
- Pipetar em torno do bem fundo para Ressuspender desanexada de células e, em seguida, transferir do trypsin-EDTA contendo células desanexadas o correspondente aos poços da placa de 96 poços de fundo redondo.
- Centrifugar a placa de 96 poços de fundo redondo a 300 x g, 4 ° C por 4 min, depois descartar o sobrenadante.
- Adicionar 200 µ l/poço de FSS para lavar as células, centrifugação a 300 x g, 4 ° C por 4 min, em seguida, descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 100 µ l/poço FSS contendo anticorpos (ver Tabela de materiais), células e e mancha a 4 ° C por 30 min.
- Adicionar 100 µ l/poço FSS às células, centrifugar a 300 x g, 4 ° C por 4 min, então descarte sobrenadante.
- Adicionar 200 µ l/poço de FSS para lavar as células, centrifugação a 300 x g, 4 ° C por 4 min, em seguida, descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células com 100-200 µ l/poço de FSS com DAPI de 500 ng/mL e, em seguida, analisar amostras por citometria de fluxo.
7. funcional e análise de Otypic Phen de células T de carro
- Recuperar os arquivos de dados do citômetro de fluxo e portão todas ao vivo (DAPI) células (Figura 1C).
- Quantificar células tumorais pelo gating a CD45 população– e células T de carro pelo gating a CD45+, carro + população (Figura 1C).
Nota: Se as células tumorais expressam CD45 (por exemplo, células do linfoma Ribeiro), anti-CD3 a coloração pode ser usada para diferenciar as células T de células tumorais. - Lote celular do tumor e número de células T de carro através do curso do tempo.
- Identifica a ativação de célula T pela expressão co de 4-1BB e CD69.
Nota: Estes marcadores de superfície podem ser usados para analisar a célula T ativação 6-24 h post inicial co-cultura. - Identifica a célula T exaustão pela expressão de PD-1, 3-LAG e TIM-3.
- Identifica o status da memória de célula T pela expressão de CD45RO e CD62L.
Representative Results
Usando o ensaio descrito acima, termos distintos a potência diferencial efetoras e matar dinâmica mediada por CD4+ e CD8+ carro T células. Os resultados aqui apresentados ilustram a diferença entre CD4+ e CD8+ carro T células, geradas a partir de um doador saudável independente da nossa anterior publicação21.
Através de um ensaio de degranulação padrão, pudemos observar que ambos CD4+ e CD8+ carro T células tornou-se igualmente ativadas contra células GBM que expressam o antígeno alvo, conforme indicado pela expressão de CD107a e citocinas intracelulares (Figura 2). No entanto, usando o ensaio de desafio de tumor repetitivos, descobrimos que CD4+ mas não CD8+ carro T células expostas a capacidade de matar múltiplo-redonda (Figura 2B). CD4+ carro T células também expansão melhor alcançado em comparação com células CD8 + durante este ensaio (Figura 2C). A diferença de expansão entre subconjuntos de célula T de carro só foram observados de D3 após duas rodadas de desafio de tumor (1:12 E:T), enquanto a diferença de citotoxicidade foi observada após três rodadas de desafio de tumor (1:20 E:T) com início em D5, indicando que ensaios de curto prazo não conseguiram elucidar as diferenças na potência de diferentes produtos de célula T de carro. Quando o 1:1 misturado CD4+ e CD8+ carro T células foram aplicadas a este ensaio, foram encontrados outperform o CD8+ mas não CD4+ carro T células na citotoxicidade de longo prazo (Figura 2B). A expansão de CD8+ carro T células foi induzido pelo CD4 co aplicada+ células, enquanto CD4+ expansão de célula T de carro foi inibida em presença de CD8+ células (Figura 2C).
Para explicar o mecanismo que distingue a atividade efetora entre CD4+ e CD8+ carro T células, primeiro confirmamos que 24 h após inicial cultura co, ambos CD4+ e CD8+ carro T células foram comparàvel ativado (Figura 3 A). Entretanto, como indicado pela expressão CD45RO e CD62L, ambos CD4+ e CD8+ carro T células mostraram uma transição de memória central (CD45RO+, CD62L+) de memória efetoras (CD45RO+, CD62L–) fenótipo durante o desafio repetitivo do tumor (Figura 3B). Em seguida, caracteriza as células em D3 deste teste, um tempo antes que os subconjuntos de célula T do carro começaram a exibir a diferença funcional. Exaustão de células t foi marcado pela expressão co dos receptores inibitórios PD-1, 3-LAG e TIM-315,,21, que mostrou que CD8+ carro T células eram mais propensas à exaustão em comparação com CD4+ carro T células ( Figura 3 C). Além disso, nenhuma diferença foi vista na CD8+ exaustão de célula T de carro na presença/ausência de CD4 co aplicada+ células (Figura 3C), indicando que induzida por CD4 CD8+ expansão de célula T de carro não é associado com uma melhor função efetora.
Juntos, os resultados do presente ensaio identificaram esse CD4+ carro T células CD8 superou+ especificamente em longo prazo citotoxidade de células. Apesar da citotoxidade de curto prazo semelhante (1-3 dias, uma vez rechallenged), CD4+ carro T células efetoras sustentado função após desafio repetitivo do tumor, enquanto CD8+ células tornou-se exausto e não conseguiram controlar o crescimento de células de tumor. Quando os dois subconjuntos foram misturadas, CD4+ carro T células facilitaram a expansão do CD8+ carro T células, mas o status de exaustão de CD8+ células não foram amenizadas, resultando na falta de efeito sinérgico entre os dois grupos. Diferença semelhante entre CD4+ e CD8+ carro T células foi visto em um modelo in vivo como descrito anteriormente,21. Com efeito, CD8+ carro T células foram capazes de mediar a curto prazo afastamento do tumor mas seguido com recorrência de antígeno-positivo; em contraste, CD4+ tratamento de célula T de carro resultou em longo prazo da erradicação do tumor21, que é uma reminiscência do seu potencial de matar repetitivas usando o ensaio in vitro de reexposição.
Figura 1 : Estratégia de esquema e análise do ensaio de desafio repetitivo. (A) esquema e cronograma de ensaio de desafio de tumor repetitivas. Para cada poço, células T de carro foram primeiro co cultivadas com células de GBM PBT030-2 (4.000 carro + células, 16.000 células tumorais) e re-desafiadas com 32.000 células tumorais cada outro dia (D2, D4 e D6). Análise de células do tumor e número de célula T de carro, bem como o fenótipo de células T de carro é realizada em D1, D3, D5 e D7. (B) Gating estratégia para determinar a % de carro em T células antes de configurar a co-cultura. (C) Gating estratégia de células vivas, células tumorais e células T de carro desde o ensaio de desafio repetitivo. (D) Tumor células número em diferentes momentos do ensaio reexposição, co cultivadas com as pilhas de T untransduced. Barras de erro = ±SEM. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Desafio repetitivo ensaio revela diferenças de potência proliferativa e mortes entre CD4+ e CD8+ carro T células. (A) degranulação e coloração de citocinas intracelulares de CD4+ e CD8+ carro T células após 5h de co-cultura com células GBM (E:T = 1:1). CD4 (B)+, CD8+ ou mista (CD4:CD8 = 1:1) células T de carro foram aplicadas ao ensaio de desafio repetitivo, e células tumorais viáveis foram quantificadas. p < 0.05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001 comparado com CD4+, usando o One-Way ANOVA com testes de comparação múltipla de Bonferroni. CD4 (C)+ e CD8+ expansão de célula T de carro durante o ensaio de desafio de tumor repetitivas. Comparação de (esquerda para a direita) CD4+ vs CD8+, único subconjunto; CD4+ vs CD8+, dentro do grupo "misto"; CD4+, single vs misturados; CD8+, single vs misturados. p < 0.05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001 usando um unpaired t de Student. Barras de erro = ±SEM. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Análise do fenótipo de células T durante o ensaio de desafio repetitivo. (A) 4-1BB e CD69 coloração sobre as pilhas de T do carro no D1 do ensaio. (B) CD45RO e CD62L coloração de células T do carro antes de aplicar para reexposição do ensaio (de entrada) e em D3 e D7 do ensaio. (C) expressão co de PD-1, 3-LAG e TIM-3 em células T de carro em D3 do ensaio. (Topo) Retenção de estratégias para identificar células T expressando 1, 2 ou 3 receptores inibitórios. (Parte inferior) Comparação de: CD4+ células (único subconjunto), CD8+ células (único subconjunto), CD8+ células (dentro do grupo "misto"). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Mapa de placa representativa da instalação de reexposição.
Discussion
Este ensaio de desafio de células de tumor repetitivas fornece uma abordagem conveniente para avaliar potência funcional célula T de carro, usando uma configuração in vitro que recapitula a carga alta tumor associada com modelos de tumor in vivo. Durante este ensaio de 7 dias, as células T de carro passam por quatro rodadas de desafio de tumor (co-cultura inicial e reexposição de x 3), criando um ambiente onde esgotado as células T podem perder sua capacidade de responder ao desafio de tumor, apesar de uma potente resposta inicial. Eliminação de células do tumor e expansão de células T de carro representam duas leituras fundamentais que podem ser adquiridas a partir deste ensaio, enquanto os fenótipos de células T de carro podem ser facilmente analisados pela coloração de marcadores de superfície ou intracelulares que indicam a ativação de células T, exaustão e/ou memória. Este ensaio também é conveniente para combinar com a análise de não-tendencioso de carro T células transcriptome proteome ou fósforo-proteome21,26e polyfunctionality de células T que foi aprovada para prever respostas clínicas27. Além disso, as células do tumor também podem ser testadas para sua resposta adaptável contra células T imunidade como a secreção de citocinas28. Desde que as amostras são colhidas em vários pontos do tempo, este ensaio permite não só estática, mas também a análise dinâmica do comportamento de célula T de carro quando responder ao excesso número de células tumorais.
O ensaio é particularmente poderoso nos comparando a potência efetoras de células T de carro visando o mesmo antígeno, mas com projetos diferentes e/ou processos de fabricação. Nós usamos este ensaio para identificar esse CD4+ carro T células foram capazes de mediar a função de efetor superior a longo prazo do que CD8+ células21. Foi também demonstrado que eficácia in vivo de carro foi correlacionada com a citotoxicidade em pontos de tempo posteriores (D7-D5) durante este ensaio, destacando ainda mais a necessidade de utilizar o desafio de tumor repetitivas para avaliação de célula T de carro in vitro. Apesar de células GBM foram usadas como o exemplo das células alvo aqui, este ensaio poderia ser facilmente adotado para uma combinação de diferentes células T-tumor. Nomeadamente, comportamento de célula T de carro também pode variar com antigénios diferentes densidades e engenharia células cancerosas para expressar a vários níveis de antígenos alvo fornecidos a ferramenta para investigar eventos moleculares sequenciais em cima do carro de reconhecimento29. Portanto, este ensaio também pode ser explorado para examinar o padrão de ativação de certas células T carro contra alvos diferentes.
Uma vez que a viabilidade celular de destino e a expansão de células T de carro são duas leituras iniciais deste teste, é fundamental que todas as culturas co começarcom com viável (> 70%) tumor e as células T. Ao realizar os processos de reexposição, a ação dos meios de comunicação de aspiração (etapa 5.3) não deve incomodar tumor e as células T no fundo dos poços, a fim de não apresentar variações desnecessárias das contagens de células. Ao executar este ensaio em linhas de células alvo de suspensão, é aconselhável colher células restantes por centrifugação antes reexposição de células do tumor.
Uma limitação deste teste é que os parâmetros de configuração (E:T rácios de co-cultura inicial e reexposição) precisa ser ajustado com base em diferentes combinações de carro-tumor. Por exemplo, se as células tumorais expressam um nível considerável de moléculas imuno-inibitórios (por exemplo, PD-L1), uma maior taxa de E:T é recomendada tendo em conta que o total matar eficiência é prejudicada em comparação com as células do tumor PD-L1-baixo. Antes de aplicar o ensaio de novas combinações de carro-tumor, um estudo piloto é recomendável para determinar as condições ideais, que geralmente permite que as células T de carro mais potentes, testadas no ensaio para eliminar > 80% de células tumorais no ponto final. Desde que o contato direto celular é necessária por carro mediada por células T matar, se as células de tumor foram rotulados de fluorescência, então o painel de análise de fluxo cytometric deve ser ajustado em conformidade (por exemplo, se as pilhas do tumor eram GFP-rotulados, então qualquer FITC-conjugados os anticorpos não devem ser usados).
A atividade clínica de células T de carro contra tumores malignos de células B tem levado a dois medicamentos aprovados pela FDA. No entanto, a resposta tem mostrado uma variação substancial entre pacientes diferentes27,30,31, que foi elucidado para correlacionar com as propriedades fenotípicas do carro produtos30. Este ensaio de desafio de tumor repetitivas in-vitro ainda fornece uma abordagem para testar funcionalmente a potência de efetor do carro além da Caracterização fenotípica e a produção de citocinas polyfunctionality e permite o rastreio de uma taxa de transferência de produtos clínicos em comparação com modelos de tumor em vivo, mantendo a fidelidade de preditiva. Em geral, este ensaio poderia ser usado para teste funcional de células T para desenho de célula T de carro, desenvolvimento pré-clínicos e clínico.
Disclosures
A construção do carro descrita neste trabalho ter sido aprovados pela Mustang Bio., Inc., para os quais S.J.F. e C.E.B recebem pagamentos de royalties. Todos os outros autores declaram não potenciais conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações da Califórnia Instituto de medicina regenerativa (CIRM) grant TR3-05641 e bolsas NIH P30 CA33572 (núcleos). D.W. é suportado pelo NCI comunhão 1F99CA234923-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS without Calcium and Magnesium | Corning | MT25051CI | |
| 1 M Hepes | Irvine Scientific | 9319 | |
| 200 mM L-Glutamine | Cambrex Bio Science | 17-605E | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) - FluoroPure grade | Invitrogen | D21490 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Aldesleukin Proleukin (rhIL-2) | Novartis Oncology | NDC 0078-0495-61 | |
| Anti-CD137, PE | BD Biosciences | 555956 | 4B4-1 |
| Anti-CD19, PE-Cy7 | BD Biosciences | 557835 | SJ25C1 |
| Anti-CD3, PERCP | BD Biosciences | 340663 | SK7 |
| Anti-CD4, FITC | BD Biosciences | 340133 | SK3 |
| Anti-CD45, PERCP | BD Biosciences | 340665 | 2D1 |
| Anti-CD45RO, PE | BD Biosciences | 561137 | UCHL1 |
| Anti-CD62L, APC | BD Biosciences | 559772 | DREG-56 |
| Anti-CD69, APC | BD Biosciences | 340560 | L78 |
| Anti-CD8, APC-Cy7 | BD Biosciences | 348793 | SK1 |
| Anti-IL-13, PE | BD Biosciences | 340508 | JES10-5A2 |
| Anti-LAG-3, PE | eBiosciences | 12-2239-41 | 3DS223H |
| Anti-PD-1, APC-Cy7 | BioLegend | 329921 | EH12.2H7 |
| Anti-TIM-3, APC | eBiosciences | 17-3109-42 | F38-2E2 |
| B-27 Serum-Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596) | Corning Life Sciences | 3596 | |
| Defined fetal bovine serum,HI IR | Hyclone Labs | SH30070.03IH | |
| DMEM F-12 50:50 (1x) without Glutamine | MediaTech, Inc. | 15-090-CV | |
| DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L | Invitrogen | 11960051 | |
| DMEM-Ham's F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES | Fisher Scientific | MT10092CV | |
| HBSS | Irvine Scientific | 9224 | |
| Heat-Inactivated FCS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Heparin Sodium(1,000 U/mL) | American Pharmaceutical | 401811B | |
| MACSQuant | Milteni Biotech Inc. | BIS013220 | |
| PBS 1x W/CA & MG | Irvine Scientific | 9236 | |
| PBS with 1 mM EDTA (No Ca2+ or Mg2+) | VWR Scientific Products | PB15009A | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG-200 | |
| Recombinant human FGF | R&D Systems | 233-FB | |
| rhIL-15 Working Dilution (10 ng/µL) | CellGenix, US Operations | tF0297 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S8032 | |
| Sorvall ST40R | Thermo Scientific | 41693700 | |
| TC-HEPES BUFFER (1 M) SOLN 100ML | IRVINE SCIENTIFIC CORP | 6472 | |
| Tecnol Procedure Mask | Kimberly-Clark | 47117 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BW04-744Q |
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