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Cancer Research

चिमेरिक antigen रिसेप्टर टी सेल एंटीट्यूमर समारोह के भविष्य कहनेवाला मूल्यांकन के लिए विट्रो ट्यूमर सेल rechallenge में

Published: February 27, 2019 doi: 10.3791/59275
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, *1, *1
1Department of Hematology & Hematopoietic Cell Transplantation, T Cell Therapeutics Research Laboratory, City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center, 2Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences, City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक में विट्रो सह संस्कृति विधि का वर्णन करने के लिए आवर्ती चुनौती ट्यूमर-लक्षित टी कोशिकाओं, जो लक्षणप्ररूपी और कार्यात्मक एंटीट्यूमर टी सेल गतिविधि के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है ।

Abstract

चिमेरिक antigen रिसेप्टर (कार) टी सेल थेरेपी के क्षेत्र तेजी से कार डिजाइन, जीन इंजीनियरिंग दृष्टिकोण और विनिर्माण अनुकूलन में सुधार के साथ आगे बढ़ रहा है । इन विकास के प्रयासों के लिए एक चुनौती है, तथापि, विट्रो assays में की स्थापना की है कि robustly vivo चिकित्सीय सफलता के लिए इष्टतम कार टी सेल उत्पादों के चयन को सूचित कर सकते हैं । मानक इन विट्रो ट्यूमर-lysis assays अक्सर के लिए कार टी कोशिकाओं के सच अर्बुदरोधी क्षमता अपेक्षाकृत कम सह संस्कृति समय और उच्च टी सेल ट्यूमर अनुपात करने के लिए कारण को प्रतिबिंबित करने में विफल । यहां, हम एक में विट्रो सह संस्कृति विधि का वर्णन करने के लिए उच्च ट्यूमर सेल लोड पर कार टी सेल आवर्ती हत्या की क्षमता का मूल्यांकन । इस परख में, लंबी अवधि साइटोटोक्सिक समारोह और कार टी कोशिकाओं के प्रफलन क्षमता अतिरिक्त ट्यूमर को सह संस्कृति हर दूसरे दिन के लिए प्रशासित लक्ष्यों के साथ 7 दिनों में विट्रो में जांच की है । इस परख की रूपरेखा टी सेल सक्रियकरण, थकावट और स्मृति phenotypes के साथ युग्मित किया जा सकता है । इस परख का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक सीडी 4 के बीच कार्यात्मक और लक्षणप्ररूपी मतभेदों को प्रतिष्ठित किया है+ और सीडी 8+ ग्लोब्लास्टोमा (gbm) कोशिकाओं के खिलाफ कार टी कोशिकाओं, vivo में उनके अंतर को दर्शाती है orthotopic में एंटीट्यूमर गतिविधि xenograft मॉडल । इस विधि कार टी सेल शक्ति का आकलन करने के लिए और विभिन्न कार टी सेल उत्पादों भर में कार्यात्मक विविधताओं को स्पष्ट करने के लिए एक सतही दृष्टिकोण प्रदान करता है ।

Introduction

immunotherapy चिमेरिक antigen रिसेप्टर का उपयोग कर (कार)-इंजीनियर टी कोशिकाओं बी सेल द्रोह के खिलाफ आशाजनक परिणाम देखा है1,2,3,4, जबकि अन्य ट्यूमर को लक्षित करने की क्षमता 5,6,7के तहत कठोर जांच जारी है । महान प्रगति के लिए कार का निर्माण, विनिर्माण प्रक्रिया और रोगी पूर्व अर्क regimens6,7,8अनुकूलन किया गया है, और उपंयास सिंथेटिक जीव विज्ञान दृष्टिकोण को बढ़ाने की उंमीद कर रहे है उनके हठ, सुरक्षा और ट्यूमर विशिष्टता9,10। हालांकि, यह मुश्किल है और श्रम-गहन उचित रूप से नैदानिक अनुवाद के लिए सबसे अच्छा विकल्प गाइड करने के लिए कार टी कोशिकाओं की चिकित्सीय क्षमता का आकलन करने के लिए किया गया है । इस प्रकार अब तक कार टी सेल समारोह का मूल्यांकन करने के लिए सबसे स्थापित मॉडल immunoकी कमी मानव ट्यूमर xenografts असर चूहों में है, जिससे कार टी कोशिकाओं को एंटीट्यूमर प्रभावकारिता के लिए जांच कर रहे है और titrated सेल खुराक11,12 की तुलना में , 13 , 14 , 15. ये विवो में murine अध्ययन श्रम गहन और समय लेने वाली हैं, खासकर जब मापदंडों की बड़ी संख्या स्क्रीनिंग । इसके अलावा, विवो अध्ययनों में माउस उपभेदों, पशु देखभाल सुविधाओं और पशु-हैंडलिंग तकनीकों की पहुंच से रोका जा सकता है । इसलिए, एक की जरूरत है विट्रो में और अधिक सुविधाजनक विकसित करने के लिए effector गतिविधि के त्वरित readouts के लिए अनुमति assays, जो भी ईमानदारी से इन टी कोशिकाओं के vivo अर्बुदरोधी समारोह में प्रतिबिंबित.

विट्रो में टी कोशिकाओं के cytotoxicity निर्धारित करने के लिए पारंपरिक तरीकों degranulation का पता लगाने पर ध्यान केंद्रित किया है, cytotoxicity उत्पादन और रेडियोआइसोटोप-लेबल लक्ष्य कोशिकाओं (यानी, क्रोमियम रिहाई assays) लाइसे करने की क्षमता. हालांकि इन assays कार टी सेल विशिष्टता और निर्देशित लक्ष्य पहचान को परिभाषित करने के लिए जानकारीपूर्ण रहे हैं, वे अक्सर इंजीनियर टी कोशिकाओं12,13,16के vivo अर्बुदरोधी क्षमता में प्रतिबिंबित करने में विफल । कुछ मामलों में, लघु अवधि में विट्रो हत्या गतिविधि में vivo एंटीट्यूमर समारोह में16के साथ एक व्युत्क्रम सहसंबंध दिखाया । ऐसी विसंगति की संभावना उच्च effector का परिणाम है: लक्ष्य (e:t) इन विट्रो assays में इस्तेमाल किया अनुपात, और इसलिए कार टी सेल उत्पादों है कि17थकावट के लिए प्रवण हैं अंतर करने में असमर्थता. इसके विपरीत, वीवो ट्यूमर उन्मूलन टी कोशिकाओं के दौरान आम तौर पर बड़े ट्यूमर बोझ के खिलाफ प्रतिक्रिया, जिससे हत्या के कई दौर की आवश्यकता होती है और बाद में टी सेल भेदभाव और थकावट18,19, ड्राइविंग 20, जो कार टी कोशिकाओं12,13द्वारा प्रभावी ट्यूमर निकासी के खिलाफ प्रमुख बाधाओं में से एक है । इस बीच, सबसे अल्पकालिक विट्रो में हत्या assays भी टी सेल प्रसार में मतभेद readout नहीं है, जबकि कार टी सेल में रोगियों का इलाज कार टी सेल विस्तार के लिए क्षमता नैदानिक प्रतिक्रियाओं के साथ दृढ़ता से सहसंबद्ध है4। इस प्रकार, विट्रो परख में उपयुक्त उच्च ट्यूमर बोझ, टी सेल थकावट के प्रेरण की शर्तों दोहराऊंगा की आवश्यकता होगी, और टी सेल विस्तार के readout के लिए अनुमति देता है ।

यहां हम एक रणनीति का वर्णन दोहराव ट्यूमर की हत्या क्षमता के लिए कार टी कोशिकाओं का मूल्यांकन, विट्रो सह में एक सरल संस्कृति परख के साथ । अलग टी सेल effector गतिविधि मापदंडों लक्ष्य सेल की हत्या, कार टी सेल विस्तार और स्मृति-या थकावट से जुड़े phenotypes सहित, एक साथ जांच की जा सकती है. इस परख से उत्पंन परिणाम कार टी कोशिकाओं के vivo अर्बुदरोधी प्रभाव में के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित है, और कार टी सेल उत्पादों की शक्ति का आकलन किया जा सकता है शोषण । जब तक हम एक परख का वर्णन करने के लिए प्राथमिक gbm लाइनों21के खिलाफ IL13Ra2-लक्षित कार टी कोशिकाओं का मूल्यांकन, यह आसानी से किसी भी कार टी सेल मंच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Protocol

हमारे irb इस प्रोटोकॉल की समीक्षा की आवश्यकता नहीं है । हम कोडित कर रहे हैं कि आशा पैथोलॉजी विभाग के शहर से खारिज ताजा ग्लॉब्लास्टोमा ट्यूमर के नमूने प्राप्त करते हैं, और हमारी प्रयोगशाला कुंजी के लिए पहुँच प्राप्त नहीं कर सकते । हम किसी भी पहचान डेटा के साथ, बायोप्सी के समय केवल पूर्व उपचार और रोग राज्य पर डेटा के साथ नमूने प्राप्त करते हैं ।

1. मीडिया तैयारी

  1. तैयार तंत्रिका स्टेम सेल मीडिया के लिए संवर्धन प्राथमिक जीबीएम सेल लाइंस: dmem: F12, 1:50 B27, 5 μg/एमएल हेपरिन, और 2 mmol/एल एल-glutamine; 20 एनजी/एमएल एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (egf) और 20 एनजी/एमएल बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (fgf) सप्ताह में दो बार के साथ पूरक ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  2. टी सेल मीडिया तैयार करें: एक्स-वीवो 15 जिसमें 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS); ७० IU के साथ पूरक/एमएल rhil-2 और ०.५ एनजी/एमएल rhil-15 हर ४८ एच ( सामग्री तालिकादेखें) ।
  3. सह संस्कृति मीडिया तैयार: egf और fgf अनुपूरक के बिना तंत्रिका स्टेम सेल मीडिया ले लो, और 10% FCS जोड़ें ।
  4. तैयार facs धुंधला समाधान (fss): एचबीएसएस, 2% FCS, नेन3 (०.५ g/500 mL) ।

2. जीबीएम ट्यूमर कोशिकाओं की तैयारी

  1. हार्वेस्ट कम-मार्ग जीबीएम ट्यूमर क्षेत्रों (tss) ३०० एक्स जी में सेंटिगेशन द्वारा 4 मिनट के लिए और supernatant त्यागें ।
    नोट: जीबीएम ट्यूमर क्षेत्रों (टीएसएस) उच्छेदन ट्यूमर से उत्पन्न कर रहे हैं के रूप में पहले वर्णित22,23,24, और न्यूरल स्टेम सेल मीडिया में बनाए रखा, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% सह2 के साथ इनसेबेटर में.
  2. पूर्व गर्म सह संस्कृति मीडिया में एक ३७ ° c पानी स्नान ।
  3. gbm tss करने के लिए ठंडा accutase के 1 मिलीलीटर जोड़ें, 30-60 s के लिए पिके द्वारा अलग करना tss, और गर्म सह संस्कृति मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़कर अलग करना बंद करो ।
    नोट: जीबीएम टीएसएस को 5 मिनट से अधिक समय तक accutase पर नहीं रखना चाहिए ।
  4. ३०० एक्स जी में 4 मिनट के लिए अपकेंद्रीकरण द्वारा जीबीएम कोशिकाओं को हार्वेस्ट करें, सुपरनाटंट छोड़ें, और सह-संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं को पुनर्जीवित करें ।
  5. सेल व्यवहार्यता काउंटर का उपयोग कर सेल एकाग्रता का निर्धारण ।
    नोट: सेल व्यवहार्यता > 70% होना चाहिए ।

3. कार टी कोशिकाओं की तैयारी

  1. परख से पहले 24 एच से कम, एक प्रवाह cytometry ट्यूब में सुसंस्कृत कार टी कोशिकाओं के १०० μl ले लो और fss के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: कार टी कोशिकाओं के रूप में पहले11,21 और टी सेल मीडिया में सुसंस्कृत वर्णित उत्पंन किया गया ।
  2. 4 मिनट के लिए ३०० एक्स जी पर अपकेंद्रीकरण और supernatant त्यागें ।
  3. कोशिकाओं को धोने के लिए fss के 2 मिलीलीटर जोड़ें, 4 मिनट के लिए ३०० एक्स जी पर अपकेंद्रिका, और supernatant त्यागें ।
  4. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कार अभिव्यक्ति का संकेत करने के लिए उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को दाग ।
    नोट: उदाहरण के लिए, यदि कोई IL13Rα2-लक्षित कार पहले वर्णित25 का उपयोग किया जाता है, तो एंटी-IL13 एंटीबॉडी के साथ दाग ।
  5. fss के 2 मिलीलीटर के साथ दो बार धो लें और एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग कर कार exn का विश्लेषण करें ।
  6. चित्रा 1बीमें दिखाया गेटिंग रणनीति का उपयोग कर टी कोशिकाओं पर कार% निर्धारित करें ।
  7. सह संस्कृति के दिन, सभी कार टी कोशिकाओं को ३०० एक्स जी में 4 मिनट के लिए अपकेंद्रीकरण से फसल, supernatant त्यागें, और सह संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend ।
  8. सेल व्यवहार्यता काउंटर का उपयोग कर सेल एकाग्रता का निर्धारण ।
    नोट: सेल व्यवहार्यता > 70% होना चाहिए ।

4. ट्यूमर सेट-टी सेल सह संस्कृति

  1. सह संस्कृति मीडिया के साथ ०.१६ मिलियन/एमएल की एकाग्रता के लिए ट्यूमर कोशिकाओं को पतला ।
  2. कार% के आधार पर, कार टी कोशिकाओं को पतला करने के लिए ४०००० कार की एकाग्रता+ कोशिकाओं को सह संस्कृति मीडिया के साथ/
    नोट: उदाहरण के लिए, यदि कार ५०% है और टी सेल एकाग्रता ०.४ मिलियन/एमएल है, तो ४०००० कार+ कोशिकाओं की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एक 1:5 कमजोर पड़ने के लिए करें ।
  3. एक ९६-अच्छी तरह से फ्लैट-नीचे ऊतक संस्कृति प्लेट की एक अच्छी तरह से पतला ट्यूमर कोशिकाओं के pipette १०० μl ।
  4. पिपेट एक अच्छी तरह से है कि ट्यूमर कोशिकाओं में शामिल है और अच्छी तरह से मिश्रण में पतला कार टी कोशिकाओं के १०० μl ।
    नोट: प्रत्येक ट्यूमर टी सेल सह संस्कृति 4 समय अंक पर विश्लेषण किया जाएगा । 4-6 प्रतिकृति अलग विश्लेषण पर आधारित हर समय बिंदु पर आवश्यक हो सकता है, लेकिन < 3 प्रति समय बिंदु प्रतिकृति अनुशंसित नहीं है; एक प्रतिनिधि platemap के लिए तालिका 1 देखें ।
  5. एक ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2 इनकोबेटर में थाली बनाए रखें ।

5. ट्यूमर सेल पुनः चुनौती

नोट: rechallenge 2, 4 और 6 दिनों में जगह लेता है प्रारंभिक सह संस्कृति सेटअप (1 चित्राएक) के बाद ।

  1. हार्वेस्ट और अलग gbm tss के रूप में ऊपर वर्णित (कदम 2.1-2.6) ।
  2. ०.६४ मिलियन/एमएल की सांद्रता पर जीबीएम कोशिकाओं को पुनर्सपींड करते हैं ।
  3. rechallenge की जरूरत है कि सह संस्कृति कुओं का निर्धारण ( तालिका 1देखें) और ध्यान से एक अच्छी तरह से ऊपर से ५० μl मीडिया को हटा दें ।
  4. जीबीएम सेल सस्पेंशन के ५० μl को एक अच्छी तरह से जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं, फिर प्लेट को ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2 इनकोबेटर में डाल दें ।

6. फसल नमूने और प्रवाह cytometric विश्लेषण

नोट: नमूने 1, 3, 5 और 7 दिनों में काटा जाएगा प्रारंभिक सह संस्कृति सेटअप के बाद, 1, 2, 3 और 4 ट्यूमर चैलेंज के दौर, क्रमशः के साथ ।

  1. ३७ डिग्री सेल्सियस वॉटरबाथ में प्री-उष्ण ०.०५% ट्रिप्सिन-edta समाधान ।
  2. कुओं कि संचयन की जरूरत है और एक नए दौर में मीडिया हस्तांतरण-नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली निर्धारित करें ।
  3. 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर शेष ट्यूमर कोशिकाओं को पचाने के लिए कुओं में ट्रिप्सिन-edta के पिपेट ५० μl ।
  4. एक खुर्दबीन के तहत, की पुष्टि करें कोशिकाओं नीचे से अलग है ।
  5. अलग कोशिकाओं resuspend करने के लिए अच्छी तरह से नीचे के आसपास पिपेट, तो दौर के अनुरूप कुओं के लिए अलग कोशिकाओं युक्त ट्रिप्सिन-edta हस्तांतरण-नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली.
  6. ९६-३०० एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 5 ° c पर, फिर supernatant छंटे
  7. कोशिकाओं को धोने के लिए fss के २०० μl/well जोड़ें, ३०० एक्स जी, 4 ° c के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रिण, तो supernatant त्यागें ।
  8. १०० μl/अच्छी तरह से fss जिसमें एंटीबॉडी ( सामग्री तालिकादेखें), और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर दाग कोशिकाओं में resuspend कोशिकाओं ।
  9. कोशिकाओं के लिए १०० μl/अच्छी तरह से fss जोड़ें, ३०० एक्स जी, 4 ° c के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रितों, तो supernatant त्यागें ।
  10. कोशिकाओं को धोने के लिए fss के २०० μl/well जोड़ें, ३०० एक्स जी, 4 ° c के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रिण, तो supernatant त्यागें ।
  11. ५०० एनजी/एमएल dapi के साथ fss के 100-200 μl/अच्छी तरह के साथ resuspend कोशिकाओं, तो प्रवाह cytometry द्वारा नमूनों का विश्लेषण ।

7. कार्यात्मक और कार टी कोशिकाओं के phen otypic विश्लेषण

  1. प्रवाह cytometer से डेटा फ़ाइलों को पुनः प्राप्त, और गेट सभी लाइव (dapi-) कोशिकाओं (चित्रा 1सी) ।
  2. CD45+, कार + जनसंख्या (चित्रा 1सी) को gating द्वारा CD45- जनसंख्या और कार टी कोशिकाओं को gating द्वारा quantify ट्यूमर कोशिकाओं ।
    नोट: यदि ट्यूमर कोशिकाओं को व्यक्त CD45 (जैसे कि राजी लिंफोमा कोशिकाओं), विरोधी CD3 धुंधला ट्यूमर कोशिकाओं से टी कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. समय पाठ्यक्रम के माध्यम से प्लॉट ट्यूमर सेल और कार टी सेल नंबर ।
  4. 4-1bb और CD69 की सह-व्यंजक द्वारा T cell सक्रियण पहचानें ।
    नोट: इन सतह मार्कर टी सेल सक्रियकरण 6-24 h पोस्ट प्रारंभिक सह संस्कृति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  5. पीडी-1, अंतराल-3 और टिम-3 की अभिव्यक्ति द्वारा टी सेल थकावट की पहचान करें ।
  6. CD45RO और CD62L की अभिव्यक्ति द्वारा T कक्ष स्मृति स्थिति की पहचान करें ।

Representative Results

ऊपर वर्णित परख का उपयोग करना, हम अंतर effector शक्ति और हत्या गतिशीलता द्वारा प्रतिष्ठित है सीडी 4+ और सीडी 8+ कार टी कोशिकाओं । यहां प्रस्तुत परिणाम सीडी 4+ और सीडी 8+ कार टी कोशिकाओं, एक स्वस्थ हमारे पिछले प्रकाशन21से स्वतंत्र दाता से उत्पंन के बीच अंतर उदाहरण देकर स्पष्ट करना ।

एक मानक विकणीकरण परख के माध्यम से, हम निरीक्षण करने में सक्षम थे कि दोनों सीडी 4+ और सीडी 8+ कार टी कोशिकाओं समान रूप से gbm कोशिकाओं है कि लक्षित antigen व्यक्त के खिलाफ सक्रिय हो गया, के रूप में CD107a की अभिव्यक्ति और इंट्रासेलुलर साइटोकाइन द्वारा संकेत (चित्रा 2ए) । हालांकि, दोहराव ट्यूमर चुनौती परख का उपयोग कर, हमने पाया कि सीडी 4+ लेकिन नहीं सीडी 8+ कार टी कोशिकाओं को कई दौर की हत्या (चित्रा 2बी) की क्षमता का प्रदर्शन किया । सीडी 4+ कार टी कोशिकाओं को भी इस परख (चित्रा 2सी) के दौरान सीडी 8 + कोशिकाओं की तुलना में बेहतर विस्तार हासिल की । कार टी सेल सबसेट के बीच विस्तार का अंतर केवल 3 ट्यूमर चैलेंज (1:12 e:t) के दौर के बाद D3 से मनाया गया है, जबकि cytotoxicity के अंतर के तीन दौर के बाद D5 पर शुरुआत मनाया गया ट्यूमर चैलेंज (1:20 e:t), का संकेत है कि अल्पकालिक assays अलग कार टी सेल उत्पादों की शक्ति में मतभेद स्पष्ट करने में विफल रहे । जब 1:1 मिश्रित सीडी 4+ और सीडी 8+ कार टी कोशिकाओं को इस परख के लिए लागू किया गया, वे सीडी 8 मात पाया गया+ लेकिन नहीं सीडी 4+ लंबी अवधि cytotoxicity पर कार टी कोशिकाओं (चित्रा 2बी) । सीडी 8+ कार टी कोशिकाओं के विस्तार को सह-एप्लाइड सीडी 4+ कोशिकाओं द्वारा प्रेरित किया गया था, जबकि सी4+ कार टी सेल विस्तार सीडी 8+ कोशिकाओं (चित्रा 2सी) की उपस्थिति में हिचकते थे ।

प्रणाली है कि सीडी 4+ और सीडी 8+ कार टी कोशिकाओं के बीच effector गतिविधि अलग समझाने के लिए, हम पहले की पुष्टि करें कि प्रारंभिक सह संस्कृति के बाद 24 ज, दोनों सीडी 5+ और सीडी 8+ कार टी कोशिकाओं comparably सक्रिय थे (चित्रा 3 क). इस बीच, के रूप में CD45RO और CD62L अभिव्यक्ति द्वारा संकेत, दोनों सीडी 4+ और सीडी 8+ कार टी कोशिकाओं केंद्रीय स्मृति से एक संक्रमण दिखाया (CD45RO+, CD62L+) effector स्मृति के लिए (CD45RO+, CD62L-) phenotype दोहराव ट्यूमर चैलेंज के दौरान (चित्रा 3बी) । फिर हम इस परख के D3 पर कोशिकाओं की विशेषता, एक समय पहले कार टी सेल सबसेट कार्यात्मक अंतर प्रदर्शित करने के लिए शुरू कर दिया । टी सेल थकावट निरोधात्मक रिसेप्टर्स के सह-अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित किया गया था पीडी-1, अंतराल-3 और टिम-315,21, जो पता चला है कि सीडी 8+ कार टी कोशिकाओं को थकावट के लिए अधिक प्रवण थे सीडी 4+ कार टी कोशिकाओं के साथ तुलना में ( चित्रा 3 C). इसके अलावा, कोई अंतर नहीं सीडी 8 पर देखा गया था+ कार टी सेल थकावट की उपस्थिति में/अनुपस्थिति में सीओ-एप्लाइड सीडी 4+ कोशिकाओं (चित्रा 3सी), यह दर्शाता है कि सीडी 2-प्रेरित सीडी 8+ कार टी सेल विस्तार नहीं है एक बेहतर effector समारोह के साथ जुड़े.

एक साथ, इस परख से परिणाम की पहचान की है कि सीडी 4+ कार टी कोशिकाओं सीडी 8+ कोशिकाओं को विशेष रूप से लंबी अवधि cytotoxicity में बेहतर प्रदर्शन किया । समान अल्पकालिक cytotoxicity के बावजूद (1-3 दिन, एक बार rechallenged), सीडी 4+ कार टी कोशिकाओं दोहराए ट्यूमर चुनौती पर effector समारोह, जबकि सीडी 8+ कोशिकाओं थक गया और ट्यूमर सेल विकास को नियंत्रित करने में विफल हो गया । जब दो उपसेट मिश्रित थे, सीडी 4+ कार टी कोशिकाओं सीडी 8+ कार टी कोशिकाओं के विस्तार में मदद की, लेकिन सीडी 8+ कोशिकाओं की थकावट स्थिति को ameliorated नहीं थे, दो समूहों के बीच synergistic प्रभाव के अभाव में जिसके परिणामस्वरूप । इसी तरह के बीच अंतर सीडी 4+ और सीडी 8+ कार टी कोशिकाओं में एक vivo मॉडल में देखा गया था के रूप में पहले21वर्णित है । दरअसल, सीडी 8+ कार टी कोशिकाओं अल्पकालिक ट्यूमर निकासी मध्यस्थता करने में सक्षम थे, लेकिन antigen-सकारात्मक पुनरावृत्ति के साथ पीछा किया; इसके विपरीत, सीडी 4+ कार के उपचार के परिणामस्वरूप लंबी अवधि के ट्यूमर उंमूलन21, जो उनके दोहराव हत्या क्षमता की याद ताजा करती है में विट्रो rechallenge परख का उपयोग ।

Figure 1
चित्रा 1 : दोहराव चुनौती परख की स्कीमा और विश्लेषण रणनीति । (क) स्कीमा और दोहराव ट्यूमर चुनौती परख की समयरेखा । एक अच्छी तरह के लिए, कार टी कोशिकाओं को पहले PBT030-2 जीबीएम कोशिकाओं (४,००० कार + कोशिकाओं, १६,००० ट्यूमर कोशिकाओं) के साथ सह-सभ्य थे और ३२,००० ट्यूमर कोशिकाओं के साथ फिर से चुनौती दी हर दूसरे दिन (D2, D4 और D6) । ट्यूमर सेल और कार टी सेल नंबर, साथ ही कार टी सेल phenotype का विश्लेषण D1, D3, D5 और D7 पर किया जाता है । (ख) को-संस्कृति को स्थापित करने से पहले टी कोशिकाओं में कार% निर्धारित करने की रणनीति गेटिंग । (ग) दोहराव चुनौती परख से लाइव कोशिकाओं, ट्यूमर कोशिकाओं और कार टी कोशिकाओं की रणनीति Gating । (घ) rechallenge परख के विभिंन समय में ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या, सह untransduced टी कोशिकाओं के साथ संवर्धित । त्रुटि पट्टियां = ± SEM. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : दोहराव चुनौती परख की हत्या में मतभेद का पता चलता है और सीडी 4 के बीच प्रफलन शक्ति+ और सीडी 8+ कार टी कोशिकाओं । (क) डीग्युलेशन और इंट्रासेलर साइटोकाइन का धुंधला होना सीडी 4+ और सीडी 8+ कार टी कोशिकाओं के 5 एच के बाद जीबीएम कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति (e:t = 1:1) । (B) सीडी 4+, सीडी 8+ या मिश्रित (सीडी 2: सीडी 8 = 1:1) कार टी कोशिकाओं दोहराव चुनौती परख करने के लिए लागू किया गया था, और व्यवहार्य ट्यूमर कोशिकाओं quantified थे । *पी < ०.०५, * *पी < ०.०१, * * *पी < ०.००१ सीडी 4 के साथ तुलना में+, bonferroni के कई तुलना परीक्षणों के साथ एक तरफा anova का उपयोग. (ग) सीडी 4+ और दोहराव ट्यूमर चुनौती परख के दौरान सीडी 8+ कार टी सेल विस्तार । की तुलना (बाएं से दाएं) सीडी 4+ बनाम सीडी 8+, एकल सबसेट; सीडी 4+ बनाम सीडी 8+, "मिश्रित" समूह के भीतर; सीडी 4+, एकल बनाम मिश्रित; सीडी 8+, एकल बनाम मिश्रित । *पी < ०.०५, * *पी < ०.०१, * * *पी < ०.००१ एक अयुग्मित छात्र की टी परीक्षण का उपयोग कर । त्रुटि पट्टियां = ± SEM. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : दोहराव चुनौती परख के दौरान टी सेल phenotype का विश्लेषण । (क) 4-1bb और CD69 की परख के D1 पर कार टी कोशिकाओं पर धुंधला । (ख) CD45RO और CD62L rechallenge परख (इनपुट) को लागू करने से पहले कार टी कोशिकाओं के दाग, और D3 और D7 परख के । (ग) पीडी की सह-अभिव्यक्ति-1, अंतराल-3 और टिम-3 पर कार टी कोशिकाओं पर D3 की परख. शीर्ष 1, 2 या 3 निरोधात्मक रिसेप्टर्स व्यक्त टी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए रणनीतियों Gating. नीचे की तुलना: सीडी 4+ कोशिकाओं (एकल सबसेट), सीडी 8+ कोशिकाओं (सिंगल सबसेट), सीडी 8+ कोशिकाओं ("मिश्रित" समूह के भीतर) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Table 1
तालिका 1: पुनर्चुनौती सेटअप के प्रतिनिधि प्लेट नक्शा.

Discussion

इस दोहराव ट्यूमर सेल चैलेंज परख कार टी सेल कार्यात्मक शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए एक सुविधाजनक दृष्टिकोण प्रदान करता है, विट्रो सेटअप में एक का उपयोग कर कि उच्च ट्यूमर vivo में साथ जुड़े बोझ recapitulates ट्यूमर मॉडल । इस 7 दिन की परख के दौरान, कार टी कोशिकाओं ट्यूमर चैलेंज के चार दौर से गुजरना (प्रारंभिक सह संस्कृति और 3x rechallenge), एक वातावरण बनाने जहां थक टी कोशिकाओं को अपनी क्षमता के लिए एक शक्तिशाली प्रारंभिक प्रतिक्रिया के बावजूद ट्यूमर चुनौती का जवाब खो सकते हैं । ट्यूमर सेल उन्मूलन और कार टी सेल विस्तार दो मौलिक readouts कि इस परख से प्राप्त किया जा सकता का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि कार टी कोशिकाओं के phenotypes आसानी से धुंधला सतह या इंट्रासेलर मार्कर कि टी सेल सक्रियण संकेत द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, थकावट और/ इस परख भी गैर-कार टी कोशिकाओं transcriptome, proteome या भास्वर-proteome21,26, और टी सेल polyfunctionality जो नैदानिक प्रतिक्रियाओं27भविष्यवाणी अपनाया गया है के पक्षपातपूर्ण विश्लेषण के साथ गठबंधन करने के लिए सुविधाजनक है । इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं को भी इस तरह के साइटोकाइन स्राव28के रूप में टी सेल प्रतिरक्षा के खिलाफ अपने अनुकूली प्रतिक्रिया के लिए परीक्षण किया जा सकता है । के बाद से नमूने कई समय बिंदुओं पर काटा जाता है, इस परख न केवल स्थिर के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी कार टी सेल व्यवहार के गतिशील विश्लेषण जब ट्यूमर कोशिकाओं की अधिक संख्या का जवाब ।

परख विशेष रूप से एक ही antigen लक्ष्यीकरण लेकिन विभिंन डिजाइनों और/या विनिर्माण प्रक्रियाओं के साथ कार टी कोशिकाओं की effector शक्ति की तुलना में शक्तिशाली है । हम इस परख का इस्तेमाल किया है की पहचान है कि सीडी 4+ कार टी कोशिकाओं सीडी 8+ कोशिकाओं21से बेहतर दीर्घकालिक effector समारोह मध्यस्थता करने में सक्षम थे । यह भी दिखाया गया है कि वीवो कार प्रभावकारिता में cytotoxicity के साथ सहसंबद्ध था बाद में समय अंक (D5-D7) इस परख के दौरान, आगे के लिए दोहराव ट्यूमर चुनौती का उपयोग करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला विट्रो कार टी सेल मूल्यांकन में । हालांकि gbm कोशिकाओं को लक्षित कोशिकाओं के उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया यहां, इस परख आसानी से एक अलग टी सेल ट्यूमर संयोजन को अपनाया जा सकता है । विशेष रूप से, कार टी सेल व्यवहार भी अलग antigen घनत्व और इंजीनियरिंग कैंसर की कोशिकाओं पर भिंन हो सकते है लक्षित एंटीजन के विभिंन स्तरों को व्यक्त करने के लिए कार की पहचान29पर अनुक्रमिक आणविक घटनाओं की जांच उपकरण प्रदान की । इसलिए, इस परख भी विभिंन लक्ष्यों के खिलाफ कुछ कार टी कोशिकाओं के सक्रियकरण पैटर्न की जांच का दोहन किया जा सकता है ।

लक्ष्य सेल व्यवहार्यता और कार टी सेल विस्तार के बाद से इस परख के दो अग्रिम readouts हैं, यह महत्वपूर्ण है कि सभी सह संस्कृतियों व्यवहार्य के साथ शुरू (> 70%) ट्यूमर और टी कोशिकाओं । जब rechallenge प्रक्रियाओं प्रदर्शन, मीडिया की aspirating की कार्रवाई (चरण ५.३) के लिए कुओं के नीचे में ट्यूमर और टी कोशिकाओं को परेशान नहीं करना चाहिए, क्रम में कोशिकाओं की संख्या में अनावश्यक बदलाव का परिचय नहीं है । जब निलंबन लक्ष्य सेल लाइनों पर इस परख प्रदर्शन, यह ट्यूमर सेल rechallenge से पहले centrifugation द्वारा शेष कोशिकाओं फसल की सिफारिश की है ।

इस परख की एक सीमा है कि सेटअप मानकों (प्रारंभिक सह संस्कृति और rechallenge के e:t अनुपात) अलग कार के आधार पर समायोजित किया जा करने के लिए-ट्यूमर संयोजन की जरूरत है । उदाहरण के लिए, यदि ट्यूमर कोशिकाओं immuno-निरोधात्मक अणुओं (उदा पीडी-l1) के एक काफी स्तर को व्यक्त, एक उच्च e:t अनुपात दिया है कि समग्र हत्या दक्षता पीडी-L1-कम ट्यूमर कोशिकाओं की तुलना में बिगड़ा हुआ है की सिफारिश की है. नई कार के लिए परख लगाने से पहले-ट्यूमर युग्म, एक प्रायोगिक अध्ययन के लिए इष्टतम स्थितियों है, जो आम तौर पर सबसे शक्तिशाली कार टी कोशिकाओं को परख में परीक्षण के अंत बिंदु पर ट्यूमर कोशिकाओं के > 80% को खत्म करने की अनुमति देता है निर्धारित करने की सिफारिश की है । चूंकि प्रत्यक्ष सेल सेल संपर्क कार टी सेल के लिए आवश्यक है मध्यस्थता की हत्या, यदि ट्यूमर कोशिकाओं प्रतिदीप्ति थे-लेबल, तो प्रवाह cytometric विश्लेषण के पैनल तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए अगर ट्यूमर कोशिकाओं gfp थे लेबल, तो किसी भी fitc-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए) ।

बी कोशिका दुर्मताओं के खिलाफ कार टी कोशिकाओं की नैदानिक गतिविधि दो एफडीए को मंजूरी दे दी दवाओं के लिए नेतृत्व किया गया है. हालांकि, प्रतिक्रिया में विभिन्न रोगियों में पर्याप्त भिन्नता दिखाई गई है27,30,31, जो कार उत्पादों के लक्षणप्ररूपी गुणों के साथ सहसंबंधित करने के लिए आविर्भाव किया गया था30. इस में विट्रो दोहराव ट्यूमर चैलेंज परख आगे कार्यात्मक लक्षणप्ररूपी विशिष्टताएँ और polyfunctionality साइटोकाइन उत्पादन के अलावा कार effector शक्ति परीक्षण करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है, और उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है भविष्यसूचक निष्ठा को बनाए रखते हुए विवो ट्यूमर मॉडल की तुलना में नैदानिक उत्पादों । कुल मिलाकर, इस परख कार टी सेल डिजाइन, पूर्व नैदानिक और नैदानिक विकास के लिए टी सेल कार्यात्मक परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Disclosures

इस काम में वर्णित कार का निर्माण घोड़ा बायो., इंक द्वारा लाइसेंस दिया गया है, जिसके लिए s.j.f. और c.e.b. रॉयल्टी भुगतान प्राप्त करते हैं । अंय सभी लेखकों ब्याज की कोई संभावित टकराव की घोषणा ।

Acknowledgments

इस काम के लिए अनुदान द्वारा समर्थित था कैलिफोर्निया संस्थान पुनर्योजी चिकित्सा के लिए (cirm) अनुदान TR3-05641 और nih अनुदान P30 CA33572 (कोर). d.w. nci फैलोशिप 1f99ca234923-01 द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS without Calcium and Magnesium Corning MT25051CI
1 M Hepes Irvine Scientific 9319
200 mM L-Glutamine Cambrex Bio Science 17-605E
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) - FluoroPure grade Invitrogen D21490
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Aldesleukin Proleukin (rhIL-2) Novartis Oncology NDC 0078-0495-61
Anti-CD137, PE BD Biosciences 555956 4B4-1
Anti-CD19, PE-Cy7 BD Biosciences 557835 SJ25C1
Anti-CD3, PERCP BD Biosciences 340663 SK7
Anti-CD4, FITC BD Biosciences 340133 SK3
Anti-CD45, PERCP BD Biosciences 340665 2D1
Anti-CD45RO, PE BD Biosciences 561137 UCHL1
Anti-CD62L, APC BD Biosciences 559772 DREG-56
Anti-CD69, APC BD Biosciences 340560 L78
Anti-CD8, APC-Cy7 BD Biosciences 348793 SK1
Anti-IL-13, PE BD Biosciences 340508 JES10-5A2
Anti-LAG-3, PE eBiosciences 12-2239-41 3DS223H
Anti-PD-1, APC-Cy7 BioLegend 329921 EH12.2H7
Anti-TIM-3, APC eBiosciences 17-3109-42 F38-2E2
B-27 Serum-Free Supplement (50x) Invitrogen 17504-044
Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596) Corning Life Sciences 3596
Defined fetal bovine serum,HI IR Hyclone Labs SH30070.03IH
DMEM F-12 50:50 (1x) without Glutamine MediaTech, Inc. 15-090-CV
DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L Invitrogen 11960051
DMEM-Ham's F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES Fisher Scientific MT10092CV
HBSS Irvine Scientific 9224
Heat-Inactivated FCS Hyclone SH30070.03
Heparin Sodium(1,000 U/mL) American Pharmaceutical 401811B
MACSQuant Milteni Biotech Inc. BIS013220 
PBS 1x W/CA & MG Irvine Scientific 9236
PBS with 1 mM EDTA (No Ca2+ or Mg2+) VWR Scientific Products PB15009A
Recombinant human EGF R&D Systems 236-EG-200
Recombinant human FGF R&D Systems 233-FB
rhIL-15 Working Dilution (10 ng/µL) CellGenix, US Operations tF0297
Sodium Azide (NaN3) Sigma S8032
Sorvall ST40R Thermo Scientific 41693700
TC-HEPES BUFFER (1 M) SOLN 100ML  IRVINE SCIENTIFIC CORP 6472
Tecnol Procedure Mask Kimberly-Clark 47117
X-VIVO 15 Lonza BW04-744Q

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References

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Wang, D., Starr, R., Alizadeh, D., Yang, X., Forman, S. J., Brown, C. E. In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function. J. Vis. Exp. (144), e59275, doi:10.3791/59275 (2019).

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