Summary
여기, 생체 외에서 공동 문화 메서드를 재귀적으로 도전 종양 표적으로 T 세포, antitumor T 세포 활동의 phenotypic 및 기능 분석에 대 한 수 있습니다 설명 합니다.
Abstract
공상 항 원 수용 체 (자동차) T 세포 치료 분야는 자동차 디자인, 유전자 공학 접근 및 제조 최적화 개선 급속 하 게 전진 된다. 그러나 이러한 개발 노력에 대 한 하나의 도전, 튼튼하게 vivo에서 치료 성공 위한 최적의 자동차 T 셀 제품의 선택에 게 알릴 수 있는 생체 외 분석 실험의 설립 되었습니다. 표준 체 외 종양 세포 분석 실험 종종 상대적으로 짧은 공동 문화 시간 및 높은 T 세포 종양 비율 차 T 세포의 진정한 antitumor 잠재력을 반영 하지. 여기, 우리는 높은 종양 세포 부하에서 잠재력을 죽이 자동차 T 셀 재귀를 평가 하는 생체 외에서 공동 문화 방법 설명. 이 분석 결과, 장기 세포 독성 기능 및 자동차 T 세포의 증식 능력에 검사 체 외에 7 일 동안 추가 종양 대상 공동 문화 매일 관리 합니다. 이 분석 결과 프로 파일링 T 세포 활성화, 피로와 메모리 고기 결합 될 수 있다. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리는 성공적으로 구분 CD4의 기능과 phenotypic 차이점+ 와 CD8+ 차 T 세포종에 대 한 세포 (GBM) 세포, orthotopic에서 그들의 차동 vivo에서 antitumor 활동 반영 이 종이 식 모델입니다. 손쉬운 접근을 자동차 T 세포 효능을 평가 하 고 기능 변화를 명료 하 게 다른 차 T 셀 제품을 제공 합니다.
Introduction
Immunotherapy 공상 항 원 수용 체 (자동차)를 사용 하 여-설계 된 T 세포 B 세포 악성 종양1,2,3,4, 동안 다른 종양을 표적으로 하기의 가능성에 대 한 유망한 결과 본 엄격한 조사가5,,67되 고 있습니다. 큰 진전이 자동차 구조, 제조 공정 및 환자 사전 주입 식이요법6,7,8, 최적화 및 새로운 합성 생물학 접근 증가 것으로 예상 된다 그들의 지 속성, 안전 및 종양 특이성9,10. 그러나, 그것은 어렵고 적절 하 게 임상 번역에 대 한 최선의 선택 가이드 위해 자동차 T 세포의 치료 잠재력을 평가 하기 위해 노동 집약 되었습니다. 가장 설립 된 모델까지 차 T 세포의 기능을 평가 하는 인간의 종양 xenografts, 그것에 의하여 차 T 세포 antitumor 효능에 대 한 검사 하 고 적정 한 셀 복용량11,12 에 비해 베어링 immunodeficient 마우스에 , 13 , 14 , 15. 이러한 생체 조건 murine 연구는 노동 집약 하 고 시간이 걸리는, 많은 수의 매개 변수를 검사 하는 경우에 특히. 더, vivo에서 학문 마우스 긴장과 동물 시설, 동물 처리 기술에의 접근에 의해 제 지 될 수 있습니다. 따라서,이 T 세포의 생체 조건 antitumor 기능 또한 충실 하 게 반영 하는 이펙터 활동의 빠른 정보에 대 한 허용 더 편리 생체 외 분석 실험을 개발할 필요가 있다.
생체 외에서 T 세포의 세포 독성을 결정 하기 위해 기존의 방법 degranulation, cytokine 생산 및 방사성 표시 대상 셀 (즉,: 크롬 방출 분석 실험) lyse 수의 탐지에 집중 했다. 이러한 분석 실험 차 T 세포 특이성 및 리디렉션된 대상 인식에 대 한 유익 하지 않습니다, 그들은 종종 조작된 T 세포12,,1316의 vivo에서 antitumor 잠재력을 반영 하지. 경우에 따라 체 외에서 단기 분석 실험에서 활동 죽이 보였다 vivo에서 antitumor 기능16역 상관 관계. 이러한 불일치 가능성이 높은 이펙터: 대상 (E:T) 비율 경향이 피로17차 T 셀 제품을 차별화 하는 데 이러한 생체 외 분석 실험에 따라서 무 능력 사용의 결과 이다. 대조적으로, vivo에서 종양 퇴치 T 동안 세포 일반적으로 응답 함으로써 사망 하 고 이후 운전 T 세포 감 별 법 및 고갈18,19, 의 여러 라운드를 요구 하는 큰 종양 부담에 대 한 20, 자동차 t 효과적인 종양 클리어런스에 대 한 주요 장벽 중 하나는 세포12,13. 한편, 대부분 단기 생체 외에서 살인 분석 실험도 할 T 세포 증식에 판독 차이 하지 반면 차 T 세포 치료 환자에서 차 T 세포 확장에 대 한 능력은 강하게 연관 임상 응답4. 따라서, 적절 한 체 외 분석 결과 높은 종양 부담, T 세포 소모의 유도의 상태를 정리 해야 하 고 T 세포 확장의 판독에 대 한 있습니다.
여기는 간단한 체 외 공동 문화 분석 결과와 잠재력을 죽이 반복적인 종양에 대 한 자동차 T 세포를 평가 하는 전략에 설명 합니다. 다른 T 세포 효과 기 활동 매개 변수 수 수 동시에, 시험 대상 셀 살인, 자동차 T 셀 확장 및 메모리 관련 또는 소모 된 고기를 포함 하 여. 이 분석 결과에서 생성 된 결과 자동차 T 세포의 생체 조건 antitumor 효력으로 잘 연결 하 고 자동차 T 셀 제품의 효능을 평가 하기 위해 악용 될 수 있습니다. IL13Ra2 대상 자동차 T 세포 주 GBM 라인21에 대 한 평가 분석 결과, 설명 하는 동안 어떤 자동차 T 셀 플랫폼에 쉽게 적응 될 수 있다.
Protocol
우리의 IRB는이 프로토콜의 검토를 요구 하지 않는다. 시의 희망 병 리 학과에서 코딩은 폐기 신선한 세포종 종양 샘플을 접수 하 고 우리 연구소는 키에 액세스할 수 없습니다. 우리는 식별 데이터가 없는 생/절제의 시간에서 이전 치료 및 질병 상태에만 데이터를 견본을 받을.
1. 미디어 준비
- GBM 셀 선 주 배양 신경 줄기 세포 미디어 준비: DMEM:F12, 1시 50분 B27, 5 µ g/mL 헤 파 린, 그리고 2 mmol/L L-글루타민; 20 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF)와 20 ng/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF) 일주일에 두 번 보충 ( 재료의 표참조).
- T 세포 미디어 준비: X-VIVO 15 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS);을 포함 하 ( 재료의 표참조) 모든 48 h 70 IU/mL rhIL 2와 0.5 ng/mL rhIL-15 보충.
- 공동 배양을 준비: EGF와 FGF 보충 없이 신경 줄기 세포 미디어 고 10 %FCS 추가.
- FACS 얼룩이 솔루션 (FSS) 준비: HBSS, 2 %FCS 할머니3 (0.5 g/500 mL).
2입니다. 준비 GBM 종양 세포의
- 4 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리에 의해 낮은 통로 GBM 종양 분야 (TSs)을 수확 하 고 상쾌한 삭제.
참고: GBM 종양 분야 (TSs)에서 생성 됩니다22,,2324, 위에서 설명한 대로 종양을 절제 하 고 37 ° c.에 5% CO2 인큐베이터에서 신경 줄기 세포 미디어에서 유지 - 37 ° C 물 욕조에 미리 따뜻한 공동 문화 미디어.
- GBM TSs에 찬 accutase의 1 mL을 추가 하 고 30-60 s pipetting으로 TSs 해리 따뜻한 공동 문화 미디어의 5 mL을 추가 하 여 분리를 중지.
참고: GBM TSs는 5 분 이상에 대 한 accutase에 보관해 서는 한다. - 4 분의 300 x g 에서 원심 분리에 의해 GBM 세포를 수확, 상쾌한, 삭제 하 고 셀 공동 문화 미디어의 2 mL에 resuspend.
- 세포 생존 카운터를 사용 하 여 셀 농도 결정 합니다.
참고: 세포 생존 능력 있어야 > 70%.
3입니다. 자동차 T 세포의 준비
- 분석 결과, 전에 24 시간 미만 흐름 cytometry 튜브로 경작된 차 T 세포의 100 µ L 고 금감원의 2 개 mL를 추가.
참고: 자동차 T 세포11,21 위에서 설명한 대로 생성 되었고 T 셀 미디어에서 경작. - 4 분 및 폐기 상쾌한 300 x g 에서 원심 분리.
- 셀, 4 분, 300 x g 에서 원심 분리기를 씻어 FSS의 2 개 mL를 추가 하 고 상쾌한 삭제.
- 30 분 동안 4 ° C에서 자동차 식을 나타내는 적절 한 항 체와 세포 얼룩.
참고: 예를 들어 설명 하는 IL13Rα2 대상 자동차 이전25 사용 됩니다, 그리고 안티-IL13 항 체와 함께 다음 얼룩이. - FSS의 2 mL로 두 번 세척 하 고 자동차 exn 교류 cytometer를 사용 하 여 분석.
- 그림 1B제어 전략을 사용 하 여 T 세포에 차 %를 결정 합니다.
- 공동 문화 일에 4 분의 300 x g 에서 원심 분리 하 여 모든 자동차 T 세포를 수확 하 고 상쾌한, 폐기 공동 문화 미디어의 2 mL에 셀 resuspend.
- 세포 생존 카운터를 사용 하 여 셀 농도 결정 합니다.
참고: 세포 생존 능력 있어야 > 70%.
4. 종양 설정-T 세포 공동 문화
- 종양 세포 공동 문화 미디어 0.16 백만/mL의 농도를 희석.
- 자동차 T 세포 공동 문화 미디어와 0.04 백만 자동차+ 셀/mL의 농도를 희석 자동차 %에 따라 달라 집니다.
참고: 예를 들어 자동차 50% 이며 T 세포 농도 0.4 백만/mL, 경우 0.04 백만 자동차+ 셀/mL의 최종 농도를 1:5 희석을 확인 합니다. - -바닥이 96-잘 빠진 조직 배양 플레이트의 각 음에 희석된 종양 세포의 100 µ L를 플라스틱.
- 에 있는 종양 세포와 혼합 잘 각 잘 희석된 차 T 세포의 100 µ L를 플라스틱.
참고: 각 종양 T 셀 공동 문화 4 시간 지점에서 분석 될 것 이다. 때마다 다른 분석을 기반으로 포인트 4-6 복제에서 필요할 수도 있지만 < 시간 포인트 당 3 복제 권장 되지 않습니다; 대표 platemap 표 1 을 참조 하십시오. - 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서에서 접시를 유지 합니다.
5. 종양 세포 Rechallenge
참고: Rechallenge 2, 4, 6 일 게시물 초기 공동 문화 설치 (그림 1A)에서 일어난다.
- 수확 하 고 (단계 2.1 2.6) 위에서 설명한 대로 GBM TSs 해리.
- GBM 0.64 백만/mL의 농도에서 세포 resuspend
- Rechallenge 필요 공동 문화 우물을 확인 (하십시오 표 1참조) 각 우물의 상단에서 50 µ L 미디어를 조심 스럽게 제거 하 고.
- 각 우물에 GBM 세포 현 탁 액의 50 µ L을 추가 하 고 잘, 다음 37 ° C, 5% CO2 배양 기에 다시 접시를 넣어.
6. 수확 샘플 및 Cytometric 분석 흐름
참고: 샘플은 각각 종양 도전의 초기 공동 문화 설치 1, 2, 3, 4 라운드는 1, 3, 5, 7 일 게시물에서 수확 될 것입니다.
- 37 ° C waterbath에 미리 따뜻한 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션.
- 수확을 해야 하 고 새로운 라운드 아래 96 잘 접시로 미디어를 전송 하는 우물을 결정 합니다.
- 5 분 동안 37 ° C에서 남아 있는 종양 세포를 소화 하기 위해 우물에 트립 신-EDTA의 50 µ L 플라스틱.
- 현미경으로, 세포는 바닥에서 분리 확인 합니다.
- 분리 된 셀, resuspend 다음 전송 트립 신-EDTA 라운드 아래 96 잘 접시의 해당 우물을 분리 된 셀을 포함 하는 잘 바닥 주위 플라스틱.
- 분리기 300 x g, 4 분, 4 ° C에서 라운드-아래 96 잘 접시 다음 상쾌한을 삭제 합니다.
- 셀, 300 x g에서 원심 분리기, 4 분, 4 ° C에 세척 하는 FSS의 200 µ L/잘 추가 후 상쾌한 삭제.
- Resuspend 세포 100 µ L/잘 FSS 포함 항 체 ( 재료의 표참조), 그리고 30 분 동안 4 ° C에서 얼룩 세포.
- 셀에 100 µ L/잘 FSS를 추가, 삭제 상쾌한 다음 300 x g, 4 분, 4 ° C에서 원심.
- 셀, 300 x g에서 원심 분리기, 4 분, 4 ° C에 세척 하는 FSS의 200 µ L/잘 추가 후 상쾌한 삭제.
- Resuspend 100-200 µ L/잘 500 ng/mL DAPI와 금감원의 셀 다음 cytometry에 의해 샘플을 분석 합니다.
7. 기능 및 자동차 T 세포의 중독 Otypic 분석
- 교류 cytometer에서 데이터 파일을 검색 하 고 모든 라이브 (DAPI-) 세포 (그림 1C) 게이트.
- 종양 세포는 CD45 게이팅 하 여 계량- 인구와 자동차 T 세포는 CD45 게이팅 하 여+, 자동차 + 인구 (그림 1C).
참고: 종양 세포 CD45 표현 하는 경우 (예: 들의 삶 문의 림프 세포), 안티-CD3 얼룩 종양 세포에서 T 세포를 차별화 하는 데 사용할 수 있습니다. - 종양 세포와 시간 코스를 통해 자동차 T 휴대폰 번호 플롯.
- 4-1BB와 CD69 공동 식으로 T 세포 활성화를 확인 합니다.
참고: 이러한 표면 마커는 T 세포 활성화 6-24 h 게시물 초기 공동 문화 분석을 사용할 수 있습니다. - PD-1, 지연-3 팀-3의 식에 의해 T 세포 소모를 식별 합니다.
- CD45RO CD62L의 식으로 T는 세포 메모리 상태를 확인 합니다.
Representative Results
위에서 설명한 분석 결과 사용 하 여, 우리 차동 이펙터 힘을 구별 해야 하 고 CD4 중재 역학을 죽이고+ 와 CD8+ 차 T 세포. 여기에 제시 된 결과 CD4의 차이 설명+ 와 CD8+ 자동차 T 우리의 이전 게시21의 독립적인 건강 한 기증자 로부터 생성 된 셀.
표준 degranulation 분석 결과 통해 우리 모두 관찰할 수 있었다 CD4+ 와 CD8+ 자동차 T CD107a 및 세포내 cytokine의 식에 의해 표시 된 대로 셀 똑같이 GBM 세포 타겟된 항 원 표현에 대 한 활성화 되었다 (그림 2A). 그러나, 우리는 발견 반복적인 종양 도전 분석 결과 사용 하 여, CD4+ CD8 하지 하지만+ 차 T 세포 전시 다중 라운드 살인 (그림 2B)의 기능. CD4+ 차 T 세포 또한이 분석 결과 (그림 2C) 동안 CD8 + 세포에 비해 더 나은 확장을 달성된. 자동차 T 세포 부분 집합 사이 확장의 차이 관찰 했다 D3에서 종양 도전 (1시 12분 E:T)의 2 라운드 후 종양 도전 (1시 20분 E:T)의 3 라운드 후 d 5에서 시작, 나타내는 세포 독성의 차이가 관찰 하는 동안 단기 분석 실험은 다른 자동차 T 셀 제품의 효능에는 차이 명료 하 게 하지 못했습니다. 때 1:1 혼합 CD4+ 와 CD8+ 차 T 세포는이 분석 결과에 적용 된, 그들은 것을 발견 했다 CD8 능가할+ 하지 CD4 하지만 장기 세포 독성 (그림 2B)에+ 차 T 세포. CD8의 확장+ 차 T 세포 공동 적용된 CD4에 의해 유도 되었다+ 세포, CD4 동안+ 차 T 세포 확장 CD8 존재 저해 했다+ 세포 (그림 2C).
CD4 사이 이펙터 활동을 구별 하는 메커니즘을 설명 하기 위해+ 와 CD8+ 차 T 세포, 우리가 먼저 확인 초기 후 그 24 시간 공동 문화, 두 CD4+ 와 CD8+ 차 T 세포 했다 comparably 활성화 (그림 3 A). 한편, CD45RO CD62L 식 두 CD4에 표시 된 대로+ 와 CD8+ 차 T 세포 중앙 메모리에서 전환 했다 (CD45RO+, CD62L+) 이펙터 메모리 (CD45RO+, CD62L-) 표현 형 동안 반복 종양 챌린지 (그림 3B). 우리는이 분석 결과의 d 3에 셀 특징 다음 차 T 세포 부분 집합 기능 차이 표시 하기 시작 하기 전에 한 번. T 세포 소모 억제 수용 체 PD-1, 지연 3과 팀-315,21, 보여주는의 공동 식에 의해 표시 되었다 그 CD8+ 차 T 세포 CD4에 비해 소모 하는 더 경향이 있었다+ 차 T 세포 ( 그림 3 C). 또한, 차이가 CD8에 보였다+ 공동 적용된 CD4의 존재/부재에 차 T 세포 소모+ (그림 3C)을 나타내는 세포는 CD4 유도 CD8+ 자동차 T 셀 확장은 더 나은 effector 기능 연관 된.
함께,이 분석 결과에서 결과 확인 그 CD4+ 차 T 실적된 CD8 세포+ 세포 특히 장기 세포 독성. 유사한 단기 세포 독성 (1-3 일, 한 번 rechallenged) CD4에도 불구 하 고+ 차 T 세포 CD8 동안 반복적인 종양 도전 시 지속적인된 effector 기능+ 세포 소진 되었고 종양 세포의 성장을 제어 하는 데 실패. 두 개의 하위 혼합 했다, CD4+ 차 T 세포 CD8의 확장을 촉진+ 차 T 세포, CD8의 고갈 상태 하지만+ 세포, 두 그룹 간의 시너지 효과의 부족의 결과로 ameliorated 하지 했다. 비슷한 차이 CD4+ 와 CD8+ 차 T 세포 vivo에서 모델에서 앞에서 설명한21으로 보였다. 실제로, CD8+ 차 T 세포 항 원 양성 재발;와 뒤 하지만 단기 종양 클리어런스를 중재할 수 있었다 반면, CD4+ 차 T 세포 치료 결과, 장기 종양 퇴치21, 생체 외에서 rechallenge 분석 결과 사용 하 여 그들의 반복적인 살인 잠재력의 연상입니다.
그림 1 : 반복적인 도전 분석 결과의 스키마 및 분석 전략. (A) 스키마 그리고 타임 라인의 반복 종양 도전 분석 결과. 각 잘 차 T 세포 처음 PBT030-2 GBM 셀 (자동차 + 셀 4000, 16000 종양 세포)와 공동 경작 되었고 다시 32000 종양 세포 (D2, D4, D6) 매일 도전. 종양 세포와 자동차 T 휴대폰 번호 뿐만 아니라 자동차 T 세포 표현 형의 분석은 D1, D3, D5, D7에서 수행 됩니다. (B) 공동 문화를 설정 하기 전에 세포 게이팅 자동차 %T 결정 하는 전략. (C) 게이팅 라이브 세포, 종양 세포와 반복적인 과제 분석 결과에서 차 T 세포의 전략. (D) 종양 세포 rechallenge 분석 결과, untransduced T 세포와 공동 경작의 다른 시간에 번호를. 오차 막대 = ±SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 반복적인 도전 분석 결과 밝혀 CD4 살인 및 증식 효능 차이+ 와 CD8+ 자동차 T 셀. (A) Degranulation와 CD4의 얼룩이 지는 세포내 cytokine+ 와 CD8 GBM 셀 후 공동 문화 5 h+ 차 T 세포 (E:T = 1:1). (B) CD4+, CD8+ 또는 혼합 (CD4:CD8 = 1:1) 차 T 세포 반복적인 도전 분석 결과에 적용 된 및 가능한 종양 세포 계량 했다. p < 0.05 * *p < 0.01, * * *p < 0.001 c d 4와 비교+, Bonferroni의 여러 비교 테스트 편도 ANOVA를 사용 하 여. (C) CD4+ 와 CD8+ 반복 종양 도전 분석 결과 중 차 T 세포 확장. (왼쪽에서 오른쪽)의 비교 CD4+ vs CD8+, 단일 하위 집합; CD4+ vs CD8+, 그룹 내에서 "혼합"; CD4+, 싱글 vs 혼합; CD8+, 싱글 vs 혼합. p < 0.05 * *p < 0.01, * * *p < 0.001 짝이 없는 학생의 t 시험을 사용 하 여. 오차 막대 = ±SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 반복적인 도전 시험 동안 T 세포 표현 형의 분석. (A) 4-1BB와 분석 결과의 d 1에서 자동차 T 세포에 CD69 얼룩. (B) CD45RO 및 CD62L rechallenge (입력), 분석 결과를 적용 하기 전에 그리고 d 3와 D7 분석 결과의 자동차 T 세포의 얼룩. (C) 공동 식 PD-1, 지연 3 및 분석 결과의 D3에서 자동차 T 세포에 팀-3. (맨 위) 1, 2 또는 3 억제 수용 체를 표현 하는 T 세포를 식별 하는 전략 게이팅 (아래) 비교: CD4+ 셀 (단일 하위 집합), CD8+ 셀 (단일 하위 집합), CD8+ (그룹 내에서 "혼합") 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1: rechallenge 설치의 대표적인 접시 지도.
Discussion
이 반복적인 종양 세포 도전 분석 결과 자동차 T 세포 기능 힘, 생체 조건 종양 모델와 관련 된 높은 종양 부담이 생체 외에서 설치를 사용 하 여 평가에 대 한 편리한 접근을 제공 합니다. 두 일 분석 결과 중 차 T 세포 종양 도전 (초기 공동 문화 및 3 x rechallenge)의 4 라운드를 받 다 지쳐 T 세포 강력한 초기 대응에도 불구 하 고 종양도 전에 대응 하는 그들의 기능을 잃을 수 있습니다 환경. 종양 세포 제거 및 자동차 T 셀 확장 대표이 분석 결과에서 취득 될 수 있다 T 세포 활성화를 나타내는 표면 또는 세포내 마커 얼룩에 의해 자동차 T 세포의 고기를 쉽게 분석할 수 있는 동안 두 기본 정보 피로 또는 메모리입니다. 이 분석 결과 또한 바이어스 비 분석 자동차 T 세포 transcriptome, 프로테옴 또는 형광체 프로테옴21,26및 임상 응답27을 예측 하기 위해 채택 된 T 세포 polyfunctionality와 결합 하 여 편리 하다. 또한, 종양 세포 cytokine 분 비28같은 T 세포 면역에 대 한 그들의 적응 응답도 테스트할 수 있습니다. 예제는 여러 시간 지점에서 수확 하 고, 이후이 분석 결과 수 있습니다 정적, 뿐만 아니라 자동차 T 셀 동작의 동적 분석에 대 한 종양 세포의 과잉 수 응답.
분석 결과 비교 이펙터 힘 차 T 세포 같은 항을 대상으로 하지만 다른 디자인 및 제조 공정에 특히 강력 하다. 우리는 CD4 식별 하이 분석 결과 사용+ 차 T 세포 CD8 보다 우수한 장기 effector 기능을 중재할 수 있었다+ 세포21. 그것은 또한 그 vivo에서 차 효능 더 생체 외에서 자동차 T 셀 평가 대 한 반복적인 종양 도전 사용의 필요성을 강조,이 분석 결과 중 나중 시간 포인트 (D5-D7)에서 세포 독성을 연관 했다 표시 했다. GBM 셀은 대상 셀 여기의 예제로 사용 했다,이 분석 결과 다른 T 세포 종양 조합에 쉽게 채택 될 수 있었다. 특히, 자동차 T 셀 동작 또한 다른 항 원 밀도 및 엔지니어링 암 세포 타겟된 항 차 인식29시 순차 분자 이벤트를 조사 하는 도구를 제공의 다양 한 레벨을 표현 하 게 달라질 수 있습니다. 따라서,이 분석 결과 다른 대상에 대 한 특정 차 T 세포의 활성화 패턴을 검사 하 또한 악용 될 수 있습니다.
대상 세포 생존 능력 및 자동차 T 셀 확장이 분석이 결과의 두 가지 선행 정보 때문에, 그것은 중요 한 모든 공동 문화 가능한로 시작 (> 70%) 종양 그리고 T 세포입니다. Rechallenge 프로세스를 수행할 때 종양과 T 셀 셀의 불필요 한 변이 소개 하기 위하여 우물의 바닥에 있는 발음 미디어 (5.3 단계)의 작업 방해 한다. 정지 대상 셀 라인에서이 분석 결과 수행할 때 종양 세포 rechallenge 전에 원심 분리 하 여 남아 있는 세포를 수확 하 좋습니다.
이 분석 결과의 한 가지 한계는 설치 매개 변수 (초기 공동 문화 및 rechallenge E:T 비율) 해야 한다는 조정 될 다른 자동차 종양 조합에 따라. 예를 들어 종양 세포 면역 억제 분자 (예: PD-L1)의 상당한 수준, 표현 하는 경우 더 높은 E:T 비율 권장 주어진 전체 효율을 죽이 장애인 PD-L1-낮은 종양 세포와 비교. 새로운 자동차-종양 조합에 분석 결과 적용 하기 전에 파일럿 연구 것이 좋습니다 최적의 조건을 결정 하는 일반적으로 제거를 분석 결과에서 테스트 하는 가장 강력한 자동차 T 세포 수 > 끝점에서 종양 세포의 80%. 종양 세포 형광 표시 된 경우 직접 셀 접촉 자동차 살해 T 세포 중재를 위해 필요 하다, 이후 다음 흐름 cytometric 분석의 패널을 조정 해야 따라 (예: 종양 세포 GFP 표시, 다음 어떤 FITC 활용 된 경우 항 체 해야 사용할 수 없습니다).
자동차 T 세포 B 세포 악성 종양에 대 한의 임상 활동 두 FDA의 승인을 마약을 주도하 고 있다. 그러나, 응답 다른 환자27,,3031, 자동차 제품30의 phenotypic 속성와 상관 관계를 해명 했다에서 상당한 변화를 보이고 있다. 이 생체 외에서 반복적인 종양 도전 분석 결과 추가 phenotypic characterizations 및 polyfunctionality cytokine 생산, 자동차 이펙터 힘 기능 테스트에 대 한 접근을 제공 하 고의 높은 처리량 검열에 대 한 있습니다. 예측 정확도 유지 하면서 생체 조건 종양 모델에 비해 임상 제품. 전반적으로,이 분석 결과 자동차 T 셀 디자인, 전 임상 및 임상 개발에 대 한 T 세포 기능 테스트 사용 될 수 있습니다.
Disclosures
이 작업에 설명 된 자동차 구조는 머스탱 바이오.에 의해 허가 되었습니다 Inc.는 S.J.F. 및 C.E.B. 로열티 지급 받을. 다른 작가 모든 관심의 잠재적인 충돌을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 캘리포니아 연구소의 재생 의학 (CIRM) 부여 TR3 05641 및 NIH 교부 P30 CA33572 (코어)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. D.W.는 NCI 친목 1F99CA234923-01에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS without Calcium and Magnesium | Corning | MT25051CI | |
| 1 M Hepes | Irvine Scientific | 9319 | |
| 200 mM L-Glutamine | Cambrex Bio Science | 17-605E | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) - FluoroPure grade | Invitrogen | D21490 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Aldesleukin Proleukin (rhIL-2) | Novartis Oncology | NDC 0078-0495-61 | |
| Anti-CD137, PE | BD Biosciences | 555956 | 4B4-1 |
| Anti-CD19, PE-Cy7 | BD Biosciences | 557835 | SJ25C1 |
| Anti-CD3, PERCP | BD Biosciences | 340663 | SK7 |
| Anti-CD4, FITC | BD Biosciences | 340133 | SK3 |
| Anti-CD45, PERCP | BD Biosciences | 340665 | 2D1 |
| Anti-CD45RO, PE | BD Biosciences | 561137 | UCHL1 |
| Anti-CD62L, APC | BD Biosciences | 559772 | DREG-56 |
| Anti-CD69, APC | BD Biosciences | 340560 | L78 |
| Anti-CD8, APC-Cy7 | BD Biosciences | 348793 | SK1 |
| Anti-IL-13, PE | BD Biosciences | 340508 | JES10-5A2 |
| Anti-LAG-3, PE | eBiosciences | 12-2239-41 | 3DS223H |
| Anti-PD-1, APC-Cy7 | BioLegend | 329921 | EH12.2H7 |
| Anti-TIM-3, APC | eBiosciences | 17-3109-42 | F38-2E2 |
| B-27 Serum-Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596) | Corning Life Sciences | 3596 | |
| Defined fetal bovine serum,HI IR | Hyclone Labs | SH30070.03IH | |
| DMEM F-12 50:50 (1x) without Glutamine | MediaTech, Inc. | 15-090-CV | |
| DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L | Invitrogen | 11960051 | |
| DMEM-Ham's F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES | Fisher Scientific | MT10092CV | |
| HBSS | Irvine Scientific | 9224 | |
| Heat-Inactivated FCS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Heparin Sodium(1,000 U/mL) | American Pharmaceutical | 401811B | |
| MACSQuant | Milteni Biotech Inc. | BIS013220 | |
| PBS 1x W/CA & MG | Irvine Scientific | 9236 | |
| PBS with 1 mM EDTA (No Ca2+ or Mg2+) | VWR Scientific Products | PB15009A | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG-200 | |
| Recombinant human FGF | R&D Systems | 233-FB | |
| rhIL-15 Working Dilution (10 ng/µL) | CellGenix, US Operations | tF0297 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S8032 | |
| Sorvall ST40R | Thermo Scientific | 41693700 | |
| TC-HEPES BUFFER (1 M) SOLN 100ML | IRVINE SCIENTIFIC CORP | 6472 | |
| Tecnol Procedure Mask | Kimberly-Clark | 47117 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BW04-744Q |
References
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