Her beskriver vi en i vitro co kultur metode rekursivt utfordring svulst målrettede T celler, som tillater fenotypiske og funksjonell analyse av antitumor T celle aktivitet.
Feltet chimeric antigen reseptor (bil) T cellen terapi er raskt fremrykkende med forbedringer i bildesign, gen-engineering tilnærminger og produksjon optimaliseringer. En utfordring for disse utvikling innsats, men har vært etableringen av in vitro analyser som kan robust informere utvalg av optimal bil T celle produktene for i vivo terapeutiske suksess. Standard i vitro svulst-lysis analyser unnlater ofte å reflektere hva ekte antitumor bil T-celler på grunn av relativt kort co kultur og høy T celle tumor forhold. Her beskriver vi en i vitro co kultur metode for å vurdere bil T celle rekursiv drepe potensial på høy svulst celle laster. I denne analysen, langsiktig cytotoksiske funksjon og proliferativ kapasitet på bilen T celler er undersøkt i vitro over 7 dager med ekstra svulst mål administrert til co kultur annenhver dag. Denne analysen kan være kombinert med profilering T celle aktivering, utmattelse og minne fenotyper. Bruker denne analysen, har vi klarer utmerket funksjonelle og fenotypiske forskjellene mellom CD4+ og CD8+ bil T celler mot glioblastom (GBM) celler, som reflekterer deres differensial i vivo antitumor aktivitet i orthotopic xenograft modeller. Denne metoden gir en lettvinte tilnærming å vurdere bil T celle styrke og å belyse de funksjonelle variantene over ulike bilen T celle produkter.
Immunterapi bruker chimeric antigen reseptor (bil)-konstruert T celler har sett lovende resultater mot B cell malignancies1,2,3,4, mens potensialet for målretting andre svulster fortsetter å være under strenge etterforskningen5,6,7. Stor fremgang har blitt gjort å optimalisere bil konstruksjon, produksjonsprosessen og pasienten før infusjonen regimer6,7,8, og romanen syntetisk biologi tilnærminger forventes å øke deres utholdenhet, sikkerhet og svulst spesifisitet9,10. Men har det vært vanskelig og arbeidskrevende til riktig vurdere terapeutiske potensialet i bilen T celler for å lede det beste valget for klinisk oversettelse. Den mest etablerte modellen så langt for å evaluere bil T celle-funksjonen er i immunodeficient mus bærer menneskelig svulst xenografts, der bilen T celler er undersøkt for antitumor effekt og sammenlignet på titrerte celle doser11,12 , 13 , 14 , 15. disse i vivo murine studiene er arbeidskrevende og tidkrevende, særlig når screening stort antall parametere. Videre, i vivo studier kan dempes av tilgjengeligheten av musen stammer, dyr omsorg fasiliteter og dyr behandling teknikker. Derfor er det behov for å utvikle mer praktisk in vitro analyser muliggjør rask readouts effektor aktivitet, som også trofast reflekterer i vivo antitumor funksjonen til disse T-celler.
Konvensjonelle metoder for å bestemme cytotoksisitet T celler i vitro har fokusert på deteksjon av omfatter degranulering, cytokin produksjon og muligheten til å lyse radioisotop-merket målcellene (dvs. krom utgivelsen analyser). Mens disse analyser er informativ for bil T celle spesifisitet og Omdirigert målet anerkjennelse, unnlater de ofte å reflektere i vivo antitumor potensial utviklet T celler12,13,16. I enkelte tilfeller i vitro viste drepe aktivitet i kortsiktige analyser en invers korrelasjon med i vivo antitumor funksjonen16. Slike uoverensstemmelser er sannsynligvis resultatet av høy effektor: mål (E:T) prosenter brukes i disse in vitro analyser og derfor manglende evne til å skille bil T celle produkter som er tilbøyelige til utmattelse17. Derimot under i vivo svulst fjerning T reagerer cellene vanligvis mot stor svulst byrder, og dermed krever flere runder med drap og deretter kjøre T celle differensiering og utmattelse18,19, 20, som er en av de største hindringene mot effektive svulst godkjennes av bilen T celler12,13. I mellomtiden, de fleste kortsiktige i vitro drapet analyser også gjøre ikke avlesning forskjeller i T celle spredning, mens i bilen T celle behandlet pasienter kapasiteten for bil T celleutvidelse er sterkt korrelert med kliniske svar4. Dermed riktig i vitro analysen måtte recapitulate for høy svulst byrden, induksjon av T celle utmattelse, og tillater avlesning av T celle ekspansjon.
Her beskriver vi en strategi for å evaluere bil T celler for repeterende svulst drepe potensial, med en enkel i vitro co kultur analysen. Ulike T-celler effektor aktivitet parametere kan samtidig undersøkes, inkludert målet cellen drapet, bil T celleutvidelse og minne – eller utmattelse-assosiert fenotyper. Resultatene fra denne analysen korrelerer med i vivo antitumor effekten av bilen T-celler, og kan utnyttes for å vurdere styrken på bilen T celle produkter. Mens vi beskriver en analyse for å vurdere IL13Ra2-målrettet bil T-celler mot primære GBM linjer21, kan det lett tilpasses enhver bil T celle plattform.
Denne repeterende svulst celle utfordring analysen gir en praktisk tilnærming for å evaluere bil T celle funksjonell styrke, med en i vitro oppsett som viser høy svulst byrden knyttet i vivo svulst modeller. Under dette 7-dagers analysen, bil T celler gjennomgå fire runder av svulst utfordring (første co kultur og 3 x rechallenge), skape et miljø der utmattet T celler kan miste deres evne å svare svulst utfordringen til tross for en potent første reaksjon. Svulst celle eliminering og bil T celleutvidelse representerer to grunnleggende readouts som kan erverves fra denne analysen, mens fenotyper bil T celler lett kan analyseres av flekker overflaten eller intracellulær indikatorer som angir T celle aktivering, utmattelse og/eller minne. Denne analysen er også praktisk å kombinere med ikke-partisk analyse av bilen T celler transcriptome, proteom eller fosfor-proteom21,26og T celle polyfunctionality som er vedtatt for å forutsi kliniske svar27. Videre kan kreftceller også være testet for deres adaptive responsen mot T celle immunitet som cytokin sekresjon28. Siden prøver høstes ved flere tidspunkt, kan denne analysen for ikke bare statiske, men også dynamisk analyse av bilen T celle atferd når du svarer på overskytende antall kreftceller.
Analysen er spesielt kraftig i sammenligne effektor styrken av bilen T-celler målretting samme antigen, men med forskjellige design og/eller produksjonsprosesser. Vi har brukt denne analysen identifisere at CD4+ bil T celler klarte å megle overlegen langsiktige effektor funksjon enn CD8+ celler21. Det ble også vist at i vivo bil effekten var korrelert med cytotoksisitet på senere tidspunkt (D5-D7) under denne analysen, fremhever videre bruk av repeterende svulst utfordring for i vitro bil T celle evaluering. Selv om GBM celler ble brukt som eksempel på målcellene her, kan denne analysen lett vedtatt å en annen T celle-svulst kombinasjon. Spesielt kan bil T celle atferd også variere på forskjellige antigen tettheter og engineering kreftceller uttrykke ulike nivåer av målrettet antigener gitt verktøyet for å undersøke sekvensiell molekylære hendelsene på bilen anerkjennelse29. Derfor kan denne analysen også utnyttes for å undersøke aktivisering mønsteret av visse bil T-celler mot forskjellige mål.
Siden målet cellen levedyktighet og bil T celleutvidelse to forhånd readouts av denne analysen, er det viktig at alle co kulturer starter med levedyktig (> 70%) svulsten og T celler. Når du utfører rechallenge prosesser, bør handlingen av aspirating media (trinn 5.3) ikke forstyrr svulsten og T celler i bunnen av brønnene, for ikke å introdusere unødvendige varianter av celler teller. Når du utfører denne analysen på suspensjon målet cellelinjer, anbefales det å høste gjenværende celler med sentrifugering før svulst celle rechallenge.
En begrensning av denne analysen er at oppsettparameterne (E:T prosenter første co kultur-og rechallenge) må justeres basert på forskjellige bil-svulst kombinasjoner. For eksempel hvis kreftceller uttrykke en betydelig grad av immuno-hemmende molekyler (f.eks PD-L1), høyere E:T forholdet anbefales gitt at samlet drepe effektivitet er svekket sammenlignet med PD-L1-lav kreftceller. Før du bruker analysen på nye bil-svulst kombinasjoner, en pilotstudie er anbefalt å bestemme de optimale forholdene, som vanligvis gir de mest potente bil T cellene testet i analysen å eliminere > 80% av kreftceller på sluttpunktet. Siden direkte celle-celle kontakt er nødvendig for T celle-mediert drapet på bilen, hvis kreftceller fluorescens-merket, deretter panel av flyt cytometric analyse må bli justert tilsvarende (f.eks hvis kreftceller var GFP-merket, deretter noe FITC-konjugerte antistoffer bør ikke brukes).
Klinisk aktiviteten av bilen T-celler mot B-cell malignancies har ført til to FDA-godkjent narkotika. Men har svaret vist betydelig variasjon over pasienter27,30,31, som var belyst for å korrelere med fenotypiske egenskapene til bilen produkter30. Denne i vitro repeterende svulst utfordring analysen videre gir en tilnærming for å funksjonelt teste bilen effektor styrken i tillegg til fenotypiske karakteristikkene og polyfunctionality cytokiner produksjonen, og tillater høyere gjennomstrømming screening av klinisk produkter i forhold til i vivo svulst modeller samtidig beholde prediktiv gjengivelsen. Samlet kan denne analysen brukes for T celle Funksjonstesten for bil T celle design, prekliniske og kliniske utvikling.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra California Institutt for regenerativ medisin (CIRM) gi TR3-05641 og NIH tilskudd P30 CA33572 (kjerner). DW støttes av NCI fellesskap 1F99CA234923-01.
0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS w/o Calcium and Magnesium | Corning | MT25051CI | |
1M Hepes | Irvine Scientific | 9319 | |
200 mM L-Glutamine | Cambrex Bio Science | 17-605E | |
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) – FluoroPure grade | Invitrogen | D21490 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
Aldesleukin Proleukin (rhIL-2) | Novartis Oncology | NDC 0078-0495-61 | |
Anti-CD137, PE | BD Biosciences | 555956 | 4B4-1 |
Anti-CD19, PE-Cy7 | BD Biosciences | 557835 | SJ25C1 |
Anti-CD3, PERCP | BD Biosciences | 340663 | SK7 |
Anti-CD4, FITC | BD Biosciences | 340133 | SK3 |
Anti-CD45, PERCP | BD Biosciences | 340665 | 2D1 |
Anti-CD45RO, PE | BD Biosciences | 561137 | UCHL1 |
Anti-CD62L, APC | BD Biosciences | 559772 | DREG-56 |
Anti-CD69, APC | BD Biosciences | 340560 | L78 |
Anti-CD8, APC-Cy7 | BD Biosciences | 348793 | SK1 |
Anti-IL-13, PE | BD Biosciences | 340508 | JES10-5A2 |
Anti-LAG-3, PE | eBiosciences | 12-2239-41 | 3DS223H |
Anti-PD-1, APC-Cy7 | BioLegend | 329921 | EH12.2H7 |
Anti-TIM-3, APC | eBiosciences | 17-3109-42 | F38-2E2 |
B-27 Serum-Free Supplement (50X) | Invitrogen | 17504-044 | |
Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596) | Corning Life Sciences | 3596 | |
Defined fetal bovine serum,HI IR | Hyclone Labs | SH30070.03IH | |
DMEM F-12 50:50 (1X) w/o Glutamine | MediaTech, Inc. | 15-090-CV | |
DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L | Invitrogen | 11960051 | |
DMEM-Ham's F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES | Fisher Scientific | MT10092CV | |
HBSS | Irvine Scientific | 9224 | |
Heat-Inactivated FCS | Hyclone | SH30070.03 | |
Heparin Sodium(1,000 U/ml) | American Pharmaceutical | 401811B | |
MACSQuant | Milteni Biotech Inc. | BIS013220 | |
PBS 1X W/CA & MG | Irvine Scientific | 9236 | |
PBS with 1MM EDTA (No Ca2+ or Mg2+) | VWR Scientific Products | PB15009A | |
Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG-200 | |
Recombinant human FGF | R&D Systems | 233-FB | |
rhIL-15 Working Dilution (10 ng/µL) | CellGenix, US Operations | tF0297 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S8032 | |
Sorvall ST40R | Thermo Scientific | 41693700 | |
TC-HEPES BUFFER (1M) SOLN 100ML | IRVINE SCIENTIFIC CORP | 6472 | |
Tecnol Procedure Mask | Kimberly-Clark | 47117 | |
X-VIVO 15 | Lonza | BW04-744Q |