Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

体外肿瘤细胞恢复对 chimeric 抗原受体 t 细胞抗肿瘤功能的预测评价

Published: February 27, 2019 doi: 10.3791/59275
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, *1, *1
1Department of Hematology & Hematopoietic Cell Transplantation, T Cell Therapeutics Research Laboratory, City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center, 2Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences, City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

在这里, 我们描述了一种体外共培养方法, 递归挑战肿瘤靶向 t 细胞, 允许表型和功能分析抗肿瘤 t 细胞活性。

Abstract

随着 car 设计、基因工程方法和制造优化的改进, 嵌合抗原受体 (car) t 细胞治疗领域正在迅速发展。然而, 这些开发工作面临的一个挑战是建立了体外检测, 可以为选择最佳的 car t 细胞产品提供有力的信息, 从而取得体内治疗的成功。标准的体外肿瘤裂解检测往往不能反映真正的抗肿瘤潜力的 car t 细胞, 由于相对较短的共同培养时间和高 t 细胞与肿瘤的比率。在这里, 我们描述了一种体外共培养方法来评估汽车 t 细胞递归杀伤潜力在高肿瘤细胞负荷。在本试验中, car t 细胞的长期细胞毒性功能和增殖能力在7天内进行体外检查, 并每隔一天对共培养进行额外的肿瘤靶点注射。该方法可与 t 细胞活化、耗尽和记忆表型的分析相结合。利用该方法, 我们成功地区分了 cd4+和 cd8 + car t细胞对胶质母细胞瘤 (gbm) 细胞的功能和表型差异, 反映了它们在原位体内的体内抗肿瘤活性差异。异种移植模型。该方法为评估 car t 细胞的效力和阐明不同 car t 细胞产品的功能变化提供了一种简便的方法。

Introduction

使用嵌合抗原受体 (car) 工程 t 细胞进行免疫治疗, 对 b 细胞恶性肿瘤1,2,3,4 有很好的疗效, 而针对其他肿瘤的潜力继续受到严格的调查, 5,6,7。在优化 car 结构、制造工艺和患者预输注方案 6、7、8和新型合成生物学方法方面取得了很大进展, 有望提高其持久性、安全性和肿瘤特异性9,10。然而, 为了指导临床翻译的最佳选择, 适当评估 car t 细胞的治疗潜力是困难和劳动密集型的。迄今为止评估 car t 细胞功能的最成熟模型是携带人肿瘤异种移植的免疫缺陷小鼠, 即检查 car t 细胞的抗肿瘤疗效, 并在滴定细胞剂量11,12时进行比较,13,14,15. 这些体内小鼠研究是劳动密集型和耗时的, 特别是在筛选大量参数时。此外, 体内的研究可以通过小鼠菌株的可及性、动物护理设施和动物处理技术来加以限制。因此, 有必要开发更方便的体外检测, 以便快速读出效应体活性, 这也忠实地反映了这些 t 细胞的体内抗肿瘤功能。

测定 t 细胞体外细胞毒性的常规方法主要集中在去粒细胞的检测、细胞因子的产生和裂解放射性同位素标记的目标细胞 (即铬释放检测) 的能力上。虽然这些检测为定义 car t 细胞特异性和重定向目标识别提供了信息, 但它们往往无法在体内反映工程 t 细胞12、13、16 的抗肿瘤潜力。在某些情况下, 短期检测中的体外杀伤活性与体内抗肿瘤功能16呈负相关。这种不一致很可能是由于效应率高: 在这些体外检测中使用的目标 (e:t) 比率, 因此无法区分容易耗尽的car t 细胞产品17。相反, 在体内肿瘤根除过程中, t 细胞通常对巨大的肿瘤负担做出反应, 因此需要多轮杀伤, 从而导致 t 细胞分化和疲惫 18,19,2 0日, 是反对 car t 细胞1 2、1 3 有效清除肿瘤的主要障碍之一。同时, 大多数短期体外杀灭检测也不会读出 t 细胞增殖的差异, 而在 car t 细胞治疗的患者中, car t 细胞扩张的能力与临床反应4密切相关。因此, 适当的体外检测需要重述高肿瘤负担的条件, 诱导 t 细胞衰竭, 并允许读出 t 细胞扩张。

在这里, 我们描述了一个策略, 以评估汽车 t 细胞的重复肿瘤杀伤潜力, 一个简单的体外共培养试验。不同的 t 细胞效应因子活性参数可以同时检测, 包括靶细胞杀伤、car t 细胞扩张和记忆或耗尽相关表型。该检测结果与 car t 细胞体内抗肿瘤作用密切相关, 可用于评估 car t 细胞产物的药效。虽然我们描述了一种方法来评估 il13ra2 目标 car t 细胞对原代 gbm 线21, 它可以很容易地适应任何 car t 细胞平台。

Protocol

我们的 irb 不需要对该协议进行审查。我们收到了来自希望市病理学系的废弃新鲜胶质母细胞瘤肿瘤样本, 这些样本是编码的, 我们的实验室无法获得关键。我们只收到有关生物切除术时的早期治疗和疾病状态的数据的标本, 没有识别数据。

1. 媒体准备

  1. 制备用于培养原代 gbm 细胞系的神经干细胞培养基: dm:f12、1:50 b27、5μgml 肝素和 2 mmol l-谷氨酰胺;补充 20 ngml 表皮生长因子 (egf) 和 20 ngml 碱性成纤维细胞生长因子 (fgf) 每周两次 (见材料表)。
  2. 制备 t 细胞培养基: x-vivo 15, 含有10% 的胎儿小牛血清 (fcs);每48小时补充 70份.
  3. 准备共培养培养基: 服用无 egf 和 fgf 补充的神经干细胞培养基, 并添加10% 的 fcs。
  4. 制备流化物染色溶液 (fss): hbss, 2% fcs, nan3 (0.5 g 500 ml)。

2. gbm 肿瘤细胞的制备

  1. 在 300 x g 的离心过程中, 以4分钟的速度收获低通道 gbm 肿瘤球体 (ss), 并丢弃上清液。
    请注意:gbm 肿瘤球体 (ts) 是由切除的肿瘤产生的, 如上文所述, 22, 23, 24, 并在神经干细胞中保持, 在 37°c的孵化器中使用5% 的 co2。
  2. 在37°c 的水浴中进行预热共培养介质。
  3. 在 gbm ts 中加入1毫升冷配酸酶, 通过移液30至60秒分离 tss, 加入5毫升的温培养培养基来阻止分离。
    请注意:gbm ts 在淀粉酶上的保存时间不应超过5分钟。
  4. 以 300 x g离心4分钟采集 gbm 细胞, 丢弃上清液, 并在2毫升共培养培养基中重新悬浮细胞。
  5. 使用细胞活力计数器确定细胞浓度。
    请注意:细胞活力必须是 & gt;70%。

3. car t 细胞的制备

  1. 在检测前24小时内, 将100μl 培养的 car t 细胞放入流式细胞仪管中, 加入2毫升 fss。
    请注意:像前面描述的那样,在t 细胞培养基中培养了 t 细胞。
  2. 离心时间为 300 x克, 4分钟, 丢弃上清液。
  3. 加入2毫升 fss 清洗细胞, 以 300 x g离心剂 4分钟, 并丢弃上清液。
  4. 用适当的抗体染色细胞, 表明在4°c 下的 car 表达30分钟。
    请注意:例如, 如果使用了以前描述的il13rα2靶向 car 25, 则使用抗 il13 抗体进行染色。
  5. 用 fss 2 毫升清洗两次, 并用流式细胞仪分析 car 外显子。
  6. 使用图 1b所示的门控策略确定 t 细胞上的 car 百分比。
  7. 在共培养日, 以 300 x g离心 3分钟, 在共培养培养基中丢弃上清液, 并重新悬浮细胞, 以300xg 的速度收获所有 car t 细胞。
  8. 使用细胞活力计数器确定细胞浓度。
    请注意:细胞活力必须是 & gt;70%。

4. 建立肿瘤-t 细胞共培养

  1. 用共培养培养基稀释肿瘤细胞, 浓度为 0.16百万/升。
  2. 以 car% 为基础, 将 car t 细胞稀释至0.04亿例 car + cellsl 浓度。
    请注意:例如, 如果 car 为 50%, t 细胞浓度为0.4 万/毫升, 则进行1:5 稀释, 以获得0.04 万辆 car+ cells/ml 的最终浓度。
  3. 将稀释后的肿瘤细胞移液器100μl 放入96孔平底组织培养板的每口井中。
  4. 将稀释后的 car t 细胞移液器100μl 放入每口含有肿瘤细胞的井中, 搅拌良好。
    请注意:每个肿瘤-t 细胞共培养将在4个时间点进行分析。根据不同的分析, 每个时间点可能需要4-6 个复制, 但 & lt;3 replicates per time point is not recommended;有关具有代表性的平台图, 请参见表 1 。
  5. 将板材保持在37°c、5% co2孵化器中。

5. 肿瘤细胞

请注意:reech置在初始共培养设置后的2天、4天和6天进行 (图 1a)。

  1. 如上文所述, 收获和离解 gbm tss (步骤 2.1-2.6)。
  2. 在0.64 万/毫升的浓度下再弹性 gbm 细胞。
  3. 确定需要重新挑战的共培养井 (见表 1), 并从每口井顶部仔细去除50μl 介质。
  4. 将50μl 的 gbm 细胞悬浮液加入每口井, 搅拌均匀, 然后将板放回37°c、5% co2孵化器中。

6. 采集样品和流动细胞仪分析

请注意:样本将在最初的共培养设置后的1、3、5和7天采集, 分别有1、2、3和4轮肿瘤挑战。

  1. 在37°c 的水浴中预热0.05% 的胰蛋白酶-edta 溶液。
  2. 确定需要收获的井, 并将介质转移到新的圆底96井板中。
  3. 将胰蛋白酶 edta 50μl 移入井中, 在37°c 下消化剩余的肿瘤细胞5分钟。
  4. 在显微镜下, 确认细胞已从底部分离。
  5. 在井底周围的移液器重新悬浮分离的细胞, 然后将含有分离细胞的胰蛋白酶 edta 转移到96井板的相应井中。
  6. 在 300 x g、4°c 的温度下离心96孔圆盘 4分钟, 然后丢弃上清液。
  7. 加入 200μl/well 的 fss 清洗细胞, 离心机在 300 x克,4°c 4分钟, 然后丢弃上清液。
  8. 在含有抗体的 100μl/well fss 中重新移植细胞 (见材料表), 并在4°c 下将细胞染色30分钟。
  9. 在细胞中加入 100μlwell fss, 在 300 x g、4°c 的温度下离心 4分钟, 然后丢弃上清液。
  10. 加入 200μl/well 的 fss 清洗细胞, 离心机在 300 x克,4°c 4分钟, 然后丢弃上清液。
  11. 用 500ngml dapi 对 fss 的100-200μl/井进行再利用, 然后用流式细胞仪对样品进行分析。

7. car t 细胞的功能分析和 pen o典型分析

  1. 从流式细胞仪中检索数据文件, 并启动所有实时 (dapi-) 单元格 (图 1c)。
  2. 通过对 cd45-群体和 car t 细胞进行门控, 通过对 cd45+、car + 种群进行门控, 对肿瘤细胞进行定量 (图 1c)。
    请注意:如果肿瘤细胞表达 cd45 (如拉吉淋巴瘤细胞), 抗 cd3 染色可用于区分 t 细胞和肿瘤细胞。
  3. 通过时间过程绘制肿瘤细胞和 car t 细胞数。
  4. 通过4-1bb 和 cd69 的共表达来识别 t 细胞的激活。
    请注意:这些表面标记可用于分析 t 细胞激活6-24小时后的初始共培养。
  5. 通过 pd-1、lag-3 和 tim-3 的表达来识别 t 细胞的消耗。
  6. 通过 cd45ro 和 cd62l 的表达来识别 t 细胞记忆状态。

Representative Results

利用上述方法, 我们区分了 cd4+和 cd8 + car t细胞介导的微分效应效力和杀伤动力学。这里给出的结果说明了 cd4+和 cd8 + car t细胞之间的区别, 它们是由独立于我们以前的出版物21的健康捐献者产生的。

通过标准的去粒化试验, 我们观察到 cd4 + 和 cd8 + car t细胞在表达靶向抗原的 gbm 细胞上都具有相同的活化作用, cd107a和细胞内细胞因子的表达表明了这一点。(图 2a)。然而, 通过重复的肿瘤挑战试验, 我们发现 cd4+但不是 cd8+ car t 细胞表现出多轮杀伤能力 (图 2b)。与 cd8 + 细胞相比, cd4+ car t 细胞在本试验中也实现了较好的扩张 (图 2c)。两轮肿瘤挑战 (1:12 1:12) 后, 才观察到 d3 之间的肿瘤亚群间扩张差异, 而在三轮肿瘤挑战 (1:20 1:12) 后, 从 d5 开始观察到细胞毒性差异, 这表明:短期检测未能阐明不同 car t 细胞产品在效力上的差异。当1混合 cd4 + 和 cd8 + car t细胞应用于该检测时, 发现它们在长期毒性方面的表现优于 cd8+ , 但不能优于 cd4+ car t 细胞 (图 2b)。cd8+ car t 细胞的扩张是由共同应用的 cd4+细胞诱导的, 而 cd4+ car t 细胞的扩张在 cd8+细胞存在时受到抑制 (图 2c)。

为了解释 cd4+和 cd8+ car t 细胞效应活性的识别机制, 我们首先确认, 在初始共培养24小时后, cd4 + 和 cd8 + car t细胞都被可比较地激活 ( 图 3) a)。同时, cd45ro 和 cd62l 表达表明, cd4+和 cd8+ car t 细胞都表现出从中央存储器 (cd45ro+, cd62l+) 向效应记忆 (cd45ro+, cd62l-) 表型的转变。在重复肿瘤挑战期间 (图 3b)。然后, 我们在本试验的 d3 对细胞进行了表征, 这是在 car t 细胞子集开始显示功能差异之前的一段时间。t 细胞衰竭的表现是抑制受体 pd-1、lag-3 和 tim-315,21 的共同表达, 这表明 cd8+ car t 细胞与 cd4 + car t细胞相比更容易衰竭 (图 3此外, 在 cd8 + car t细胞衰竭方面没有发现差异, 因为没有共同应用的 cd4+细胞 (图 3c), 这表明 cd4 诱导的 cd8 + car t细胞扩张没有与更好的执行函数相关联。

该分析的结果表明, cd4 + car t细胞的表现优于 cd8+细胞, 特别是在长期细胞毒性方面。尽管类似的短期细胞毒性 (1-3天, 一旦重新挑战), cd4 + car t细胞在重复的肿瘤挑战下保持了效应功能, 而 cd8+细胞变得精疲力竭, 无法控制肿瘤细胞的生长。当两个子集混合时, cd4 + car t细胞促进了 cd8 + car t细胞的扩张, 但 cd8+细胞的耗尽状态没有得到改善, 导致两组之间缺乏协同作用。cd4+和 cd8 + car t细胞之间的相似差异在体内模型中也有类似的差异, 如前面所述的21。事实上, cd8+ car t 细胞能够介导短期肿瘤清除, 但随后抗原阳性复发;相反, cd4+ car t 细胞治疗导致长期根除肿瘤21, 这让人想起他们的重复杀灭潜力使用体外重测试验。

Figure 1
图 1: 重复挑战分析的图式和分析策略.(a) 重复肿瘤挑战检测的模式和时间表。每口井, car t 细胞首先与 pbt030-2 gbm 细胞 (4, 000个 car + 细胞, 16, 000个肿瘤细胞) 共同培养, 每隔一天就会与 32, 000个肿瘤细胞 (d2、d4 和 d6) 重新挑战。在 d1、d3、d5 和 d7 中进行了肿瘤细胞和 car t 细胞数量以及 car t 细胞表型分析。(b) 在建立共培养之前, 采取门控策略确定 t 细胞中的 car 百分比。(c) 从重复挑战分析中提取活细胞、肿瘤细胞和 car t 细胞的门控策略。(d) 肿瘤细胞数量在重新挑战试验的不同时间, 与未转染的 t 细胞共同培养。错误栏 = ± sem. 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 重复挑战试验揭示了 cd4+和 cd8 + car t细胞在杀伤和增殖能力方面的差异.(a) cd4 + 和 cd8 + car t 细胞在与 gbm细胞共培养5小时后的脱粒和细胞内细胞因子染色 (E:T=1:1)。(b) 将 cd4+、cd8+或混合 (cd4:cd8cs 1: 1) car t 细胞应用于重复挑战检测, 并对活体肿瘤细胞进行了定量。*p < 0.05, ** p < 0.01, * ** p < 0.001 相比, cd4 +, 使用单向方差与邦费罗尼的多重比较测试。(c) 重复肿瘤挑战试验中 cd4 + 和 cd8+ car t 细胞扩张。比较 (从左到右) cd4+与 cd8+, 单子集;cd4+ vs cd8+, 在 "混合" 组中;cd4+, 单比混合;cd8+, 单对混合。*p < 0.05, ** p < 0.01, * ** p < 0.001 使用未配对的学生t测试。错误栏 = ± sem. 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 重复挑战分析中 t 细胞表型.(a) 在测定的 d1 处, 4-1bb 和 cd69 染色。(b) cd45 ro 和 cd62l 染色的 car t 细胞之前, 应用于重新质疑检测 (输入), 并在 d3 和 d7 的检测。(c) 在检测 d3 时, pd-1、lag-3 和 tim-3 在 car t 细胞上的共表达。(上图)表达1、2或3抑制受体的 t 细胞的作认得策略。(底部)比较: cd4+细胞 (单子集), cd8+细胞 (单子集), cd8+细胞 (在 "混合" 组内)。请点击这里查看此图的较大版本.

Table 1
表 1: 重新挑战设置的代表性板块图。

Discussion

这种重复的肿瘤细胞挑战检测提供了一个方便的方法来评估 car t 细胞的功能效力, 使用体外设置, 重述与体内肿瘤模型相关的高肿瘤负担。在这7天的检测中, car t 细胞经历了四轮肿瘤挑战 (初始共培养和3倍再挑战), 创造了一个环境, 即使有强有力的初始反应, 疲惫的 t 细胞仍可能失去应对肿瘤挑战的能力。肿瘤细胞的消除和 car t 细胞的扩张代表了可以从这种检测中获得的两个基本读数, 而 car t 细胞的表型可以很容易地通过染色表面或细胞内标记, 表明 t 细胞激活,精疲力竭和记忆。该方法还可与对 car t 细胞转录组、蛋白质组或荧光蛋白组21、26和 t 细胞多功能的无偏分析相结合, 这些分析已被用于预测临床反应27。此外, 肿瘤细胞还可以测试其对 t 细胞免疫的适应性反应, 如细胞因子分泌28。由于样本是在多个时间点采集的, 因此该检测不仅允许静态分析, 还允许在响应过多的肿瘤细胞时对 car t 细胞行为进行动态分析。

该检测方法在比较针对相同抗原但具有不同设计和制造工艺的 car t 细胞的有效性方面具有特别大的作用。我们已经使用这个分析来确定 cd4+ car t 细胞能够介导优于 cd8+细胞21的长期效应功能。研究还表明, 在本试验过程中, 体内 car 的疗效与后期的细胞毒性 (d5-d7) 有关, 进一步突出了在体外使用重复肿瘤挑战进行体外 car t 细胞评价的必要性。虽然 gbm 细胞在这里被用作靶细胞的例子, 但这种检测方法很容易被不同的 t 细胞-肿瘤组合所采用。值得注意的是, car t 细胞行为也可以根据不同的抗原密度和工程癌细胞的不同来表达不同水平的靶向抗原, 为调查car 识别 29后的序列分子事件提供了工具。因此, 该方法也可用于检测某些 car t 细胞对不同靶点的激活模式。

由于靶细胞活力和 car t 细胞扩张是这种检测的两个前期读数, 至关重要的是, 所有的共同培养都要从可行 (& gt;70%) 开始肿瘤和 t 细胞。在执行重新挑战过程时, 吸气介质 (步骤 5.3) 的作用不应干扰井底的肿瘤和 t 细胞, 以免引入不必要的细胞计数变化。在悬浮物靶细胞系进行此检测时, 建议在肿瘤细胞再挑战之前, 通过离心收获剩余细胞。

这种检测的一个局限性是, 设置参数 (初始共培养和再挑战的 e:t 比率) 需要根据不同的 car-肿瘤组合进行调整。例如, 如果肿瘤细胞表达了相当程度的免疫抑制分子 (例如 pd-l1), 则建议使用较高的 e:t 比, 因为与 pd-l1 低的肿瘤细胞相比, 总体杀伤效率受到损害。在将该检测方法应用于新的 carn-肿瘤组合之前, 建议进行试点研究, 以确定最佳条件, 这通常允许在该检测中测试的最有效的 car t 细胞在终点消除和 gt;80% 的肿瘤细胞。由于 car t 细胞介导的杀伤需要直接细胞接触, 如果肿瘤细胞被荧光标记, 则必须相应地调整流式细胞检查分析面板 (例如, 如果肿瘤细胞被 gfp 标记, 则任何 fitc 共轭抗体不应使用)。

car t 细胞对 b 细胞恶性肿瘤的临床活性已导致两种 fda 批准的药物。然而, 反应显示了巨大的差异,不同的患者27,30, 31, 这被阐明与表型属性的汽车产品 30。这种体外重复肿瘤挑战试验进一步提供了一种方法, 功能测试 car 效应的效力, 除了表型特征和多功能细胞因子的生产, 并允许更高的吞吐量筛选临床产品与体内肿瘤模型相比, 同时保留了预测保真度。总体而言, 该方法可用于 t 细胞功能测试的 car t 细胞设计, 临床前和临床发展。

Disclosures

这项工作中描述的 car 建筑已获得野马 bio 公司的许可, s. j. f. 和 c. e. b. 为此收取版税。所有其他作者声明没有潜在的利益冲突。

Acknowledgments

这项工作得到了加州再生医学研究所赠款 tr3-05641 的支持, 国家卫生研究院提供了 p30 ca33572 (核心)。d. w. 得到 nci 研究金1f99ca234923-01 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS without Calcium and Magnesium Corning MT25051CI
1 M Hepes Irvine Scientific 9319
200 mM L-Glutamine Cambrex Bio Science 17-605E
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) - FluoroPure grade Invitrogen D21490
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Aldesleukin Proleukin (rhIL-2) Novartis Oncology NDC 0078-0495-61
Anti-CD137, PE BD Biosciences 555956 4B4-1
Anti-CD19, PE-Cy7 BD Biosciences 557835 SJ25C1
Anti-CD3, PERCP BD Biosciences 340663 SK7
Anti-CD4, FITC BD Biosciences 340133 SK3
Anti-CD45, PERCP BD Biosciences 340665 2D1
Anti-CD45RO, PE BD Biosciences 561137 UCHL1
Anti-CD62L, APC BD Biosciences 559772 DREG-56
Anti-CD69, APC BD Biosciences 340560 L78
Anti-CD8, APC-Cy7 BD Biosciences 348793 SK1
Anti-IL-13, PE BD Biosciences 340508 JES10-5A2
Anti-LAG-3, PE eBiosciences 12-2239-41 3DS223H
Anti-PD-1, APC-Cy7 BioLegend 329921 EH12.2H7
Anti-TIM-3, APC eBiosciences 17-3109-42 F38-2E2
B-27 Serum-Free Supplement (50x) Invitrogen 17504-044
Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596) Corning Life Sciences 3596
Defined fetal bovine serum,HI IR Hyclone Labs SH30070.03IH
DMEM F-12 50:50 (1x) without Glutamine MediaTech, Inc. 15-090-CV
DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L Invitrogen 11960051
DMEM-Ham's F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES Fisher Scientific MT10092CV
HBSS Irvine Scientific 9224
Heat-Inactivated FCS Hyclone SH30070.03
Heparin Sodium(1,000 U/mL) American Pharmaceutical 401811B
MACSQuant Milteni Biotech Inc. BIS013220 
PBS 1x W/CA & MG Irvine Scientific 9236
PBS with 1 mM EDTA (No Ca2+ or Mg2+) VWR Scientific Products PB15009A
Recombinant human EGF R&D Systems 236-EG-200
Recombinant human FGF R&D Systems 233-FB
rhIL-15 Working Dilution (10 ng/µL) CellGenix, US Operations tF0297
Sodium Azide (NaN3) Sigma S8032
Sorvall ST40R Thermo Scientific 41693700
TC-HEPES BUFFER (1 M) SOLN 100ML  IRVINE SCIENTIFIC CORP 6472
Tecnol Procedure Mask Kimberly-Clark 47117
X-VIVO 15 Lonza BW04-744Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
  2. Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), (2013).
  3. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  4. Lee, D. W., et al. T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial. The Lancet. 385 (9967), 517-528 (2015).
  5. Yong, C. S. M., et al. CAR T-cell therapy of solid tumors. Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).
  6. Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric antigen receptor therapy for cancer. Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).
  7. Priceman, S. J., Forman, S. J., Brown, C. E. Smart CARs engineered for cancer immunotherapy. Current Opinion in Oncology. 27 (6), 466-474 (2015).
  8. Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 566-581 (2016).
  9. Esensten, J. H., Bluestone, J. A., Lim, W. A. Engineering Therapeutic T Cells: From Synthetic Biology to Clinical Trials. Annual Review of Pathology. 12, 305-330 (2017).
  10. Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
  11. Brown, C. E., et al. Optimization of IL13Ralpha2-Targeted Chimeric Antigen Receptor T Cells for Improved Anti-tumor Efficacy against Glioblastoma. Molecular Therapy. , (2017).
  12. Long, A. H., et al. 4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors. Nature Medicine. 21 (6), 581-590 (2015).
  13. Cherkassky, L., et al. Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition. The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3130-3144 (2016).
  14. Priceman, S. J., et al. Co-stimulatory signaling determines tumor antigen sensitivity and persistence of CAR T cells targeting PSCA+ metastatic prostate cancer. Oncoimmunology. 7 (2), 1380764 (2018).
  15. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
  16. Gattinoni, L., et al. Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).
  17. Malandro, N., et al. Clonal Abundance of Tumor-Specific CD4(+) T Cells Potentiates Efficacy and Alters Susceptibility to Exhaustion. Immunity. 44 (1), 179-193 (2016).
  18. Gattinoni, L., et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).
  19. Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
  20. Gattinoni, L., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell. Nature Reviews Cancer. 12 (10), 671-684 (2012).
  21. Wang, D., et al. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), (2018).
  22. Kahlon, K. S., et al. Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells. Cancer Research. 64 (24), 9160-9166 (2004).
  23. Brown, C. E., et al. Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells. Cancer Research. 69 (23), 8886-8893 (2009).
  24. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  25. Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
  26. Salter, A. I., et al. Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function. Science Signaling. 11 (544), (2018).
  27. Rossi, J., et al. Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL. Blood. 132 (8), 804-814 (2018).
  28. Garcia-Diaz, A., et al. Interferon Receptor Signaling Pathways Regulating PD-L1 and PD-L2 Expression. Cell Reports. 19 (6), 1189-1201 (2017).
  29. Walker, A. J., et al. Tumor Antigen and Receptor Densities Regulate Efficacy of a Chimeric Antigen Receptor Targeting Anaplastic Lymphoma Kinase. Molecular Therapy. 25 (9), 2189-2201 (2017).
  30. Fraietta, J. A., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
  31. Fraietta, J. A., et al. Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells. Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).

Tags

癌症研究 第144期 免疫治疗 采用细胞转移 共培养试验 有效效力 长期功能 t 细胞衰竭
体外肿瘤细胞恢复对 chimeric 抗原受体 t 细胞抗肿瘤功能的预测评价
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, D., Starr, R., Alizadeh, D.,… More

Wang, D., Starr, R., Alizadeh, D., Yang, X., Forman, S. J., Brown, C. E. In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function. J. Vis. Exp. (144), e59275, doi:10.3791/59275 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter