يصف لنا بروتوكول شامل وعملي للأسفار الانتعاش بعد تجارب فوتوبليتشينج مع العيش الخلايا. على الرغم من أن البروتوكول استخدمت لقياس تنقل الأصفر p62 نيون معلم البروتين في هياكل المستحث أجريسومي، فإنه يمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من نظم الفحص المجهري والبروتينات الفلورية.
الأسفار الانتعاش بعد فوتوبليتشينج (فراب) وهو أسلوب الفحص المجهري التي يمكن استخدامها لتحديد حجم التنقل البروتين في الخلايا الحية. في تجربة فراب نموذجي، لوحظ fluorescence الحالة المستقرة بالتصوير المتكرر مع ضوء الليزر المنخفضة الكثافة. وفي وقت لاحق، جزيئات الفلورسنت البصر بسرعة وبلا رجعة عن طريق مختصر من التعرض لضوء الليزر عالية الكثافة. يتم الحصول على المعلومات حول التنقل البروتين عن طريق رصد انتعاش الأسفار. كنا فراب لتحديد حركة p62 في هياكل المستحث (ALIS) مثل أجريسومي في الضامة مورين بعد التحفيز مع lipopolysaccharide (LPS). نظراً للعديد من البروتوكولات الموجودة في فراب أما غير مكتملة أو المعقدة، كان هدفنا تقديم بروتوكول خطوة بخطوة شامل وعملي ومباشر للتجارب فراب مع الخلايا الحية. وهنا يصف لنا RAW264.7 بلعم تعداء مع الأصفر فلوري البروتين-p62 (يفب-p62)، تحريض ALIS وذلك بتعريض الخلايا للبس، وأسلوب خطوة بخطوة لجمع بريبليتش وبوستبليتش فراب الصور وتحليل البيانات. وأخيراً، نحن نناقش العوامل الهامة في الاعتبار عند إجراء تجربة فراب.
الأسفار الانتعاش بعد فوتوبليتشينج (فراب) وهو أسلوب الفحص المجهري التي يمكن استخدامها لتحديد كمية البروتين الديناميات في العيش الخلايا1،2. زادت شعبية فراب بسبب التوافر التجاري على نطاق واسع لليزر المسح مجاهر [كنفوكل] مع عالية الدقة والسرعة، والحساسية، ووراثيا ترميز “قوس قزح” من البروتينات الفلورية، مثل أخضر نيون البروتين (التجارة والنقل) وبروتين فلوري الصفراء (يفب)3. تنصهر فيها البروتينات الفلورية وراثيا المشفر وتين فائدة للسماح للتعريب سوبسيلولار من بروتين الفائدة. في تجربة فراب نموذجي، لوحظ fluorescence الحالة المستقرة في منطقة اقتناء من الفائدة (ROI) داخل خلية عن طريق التصوير المتكرر لأن العائد على الاستثمار مع ضوء الليزر المنخفضة الكثافة. وفي وقت لاحق، الجزيئات الفلورسنت هي سريعاً ولا رجعة فيه ضعاف في مجموعة فرعية محددة مسبقاً للحصول على عائد الاستثمار، يشار إليه التبييض العائد على الاستثمار، موجز التعرض لضوء الليزر عالية الكثافة. كما البروتينات غير مقصور الجديدة تجديد البروتينات المبيضة على مر الزمن، بسرعة وكثافة الانتعاش fluorescence في بليتش دوروا يوفر معلومات حول البروتين التنقل (الشكل 1)4.
لدينا مصلحة في تحديد تنقل p62 البروتين ملزمة أوبيكويتين (يعرف أيضا باسم سيكويستوسومي-1) في هياكل المستحث (ALIS) مثل أجريسومي في مورين RAW264.7 الضامة بعد التحفيز مع lipopolysaccharide (لبس) أدت بنا إلى إعادة النظر في فراب الأدب. لسوء الحظ، العديد من البروتوكولات فراب الحالية هي غير مكتملة أو مفرطة التعقيد5،،من67،،من89. بعض لا توفر معلومات تفصيلية حول إعدادات الليزر، وتكوين مسار الشعاع واكتساب صورة معلمات6،5،7،،من89. آخرون حذف التفاصيل الرئيسية فيما يتعلق بتحليل البيانات، مثل كيفية معالجة مسألة التبييض دوروا الانجراف6،9 أو كيفية حساب معلمات استرداد الهامة، منها كسر الجوال (مو)، وكسر غير متحرك (أناو)، ونصف الوقت لاسترداد (t½)5،7. على العكس من ذلك، البعض الآخر وضع الكثير من التركيز على الصيغ الرياضية المعقدة المستخدمة لحساب مو، أناو t1/25،6،،من89. وهكذا، هدفنا تقديم بروتوكول خطوة بخطوة شامل وعملي ومباشر للتجارب فراب مع الخلايا الحية.
نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة شاملة وعملية وبسيطة للتجارب فراب مع الخلايا الحية. وهنا، البروتوكول المستخدم لقياس حركة يفب-p62 في ALIS في الضامة RAW264.7، ولكن يمكن تطبيقها على العديد من المسح مجهر [كنفوكل] نظم الليزر ووراثيا ترميز البروتينات الفلورية التي أصبحت الآن متاحة. لأي نظام الفحص المجهري، وتجارب رائدة ذات أهمية حاسمة لتحديد معلمات فراب الأمثل، بما في ذلك كثافة الليزر اقتناء والتبييض، وأحجام عنصر التحكم العائد على الاستثمار، فوتوبليتشينج، والحصول على الصور بريبليتش وبوستبليتش. فإنه من المعقول أن نتوقع المعلمات فراب الأمثل تختلف عن كل سطر البروتين وخلية الفلورسنت وراثيا المرمزة.
العوامل الهامة في الاعتبار عند إجراء تجربة فراب وتشمل (أ) تحقيق مناسب التبييض العمق، (ب) استخدام الخطوة تبيض موجزة، (ج) السماح بوستبليتش الوقت الكافي لمراقبة وظيفة الاسترداد الكامل، (د) فوتوبليتشينج الكفاءة، (ه). سيتوتوكسيسيتي مع فراب المتكررة، و (و) إدراج عنصر تحكم لفقدان الأسفار بسبب تصوير المتكررة. نوصي بأن يكون عمق التبييض، التي يمكن أن تحسب وفقا للمعادلة المنصوص عليها في قسم 3.3.1, إيه ناين زيرو13. عندما يكون عمق التبييض < 90، سيتم التقليل من درجة الانتعاش بوستبليتش الأسفار، والقيم من أناوو Mوو t1/2 تكون غير صحيحة. على الرغم من أن مدة وكثافة من نبضات الليزر يحفز التبييض قد تختلف بين تجارب فراب، من المهم أن الخطوة فوتوبليتشينج تكون قصيرة وأسرع كثيرا من الدالة استرداد الأسفار. إذا لم يكن كذلك، يمكن أن تحدث قدرا كبيرا من الأسفار الانتعاش خلال الخطوة تبيض. مع وقت التبييض طويلة، لا يمكن قياسها fluorescence الانتعاش خلال الخطوة تبيض، وأنها ستؤدي إلى قياسات غير صحيحة أناfو Mووt1/2. وبالإضافة إلى ذلك، للحصول على القيم الصحيحة لاناوMf، وt1/2، الحصول على عائد الاستثمار ينبغي أن تراعي بوستبلياتش حتى وصلت إلى مستوى الأسفار في بليتش دوروا هضبة. على سبيل المثال، في تجاربنا فراب، لم يكن هناك فرق بين أناوMووقيم t1/2 عندما لاحظنا fluorescence يفب-p62 في المبيض دوروا لدقيقة 32.2 بوستبليتش مقابل عندما لاحظنا يفب-p62 في بليتش دوروا على بوستبليتش 15.1 دقيقة؛ هكذا، خلصنا أن الدالة استرداد التوصل إلى هضبة في دقيقة 15.1 بوستبليتش12. وفيما يتعلق بكفاءة فوتوبليتشينج، يزيد فوتوبليتشينج مع مربع عامل التكبير/التصغير البصري14. وهكذا، استخدام عدسات التكبير الضوئية عالية مواتية فوتوبليتشينج السريع ولكن يمكن أن تؤدي إلى فوتوبليتشينج غير مرغوب فيه أثناء اقتناء؛ هذه الأخيرة يمكن أن يعزى للتصوير عنصر تحكم العائد على الاستثمار. فوتوبليتشينج المتكررة أمر ينبغي تجنبه كما أنها يمكن أن تؤدي إلى توليد أنواع الأكسجين التفاعلية السامة للخلايا (روس). بيد أن درجة توليد روس بسبب التعرض لليزر عالية الكثافة أقل بالنسبة للبروتينات الفلورية المرمزة وراثيا من فلوروفوريس الكيميائية (مثل الأجسام المضادة الفلورسنت)15وروس المتولدة من المرجح أن الرد إطار المرمزة وراثيا بروتين فلوري من جزيئات أخرى في الخلية4. بالإضافة إلى احتمال زيادة توليد روس السامة للخلايا، فوتوبليتشينج المتكررة تجنب نظراً لأنه من الصعب التحكم. أخيرا، على الرغم من أن انتقال الليزر منخفض يستخدم للحصول على جميع الصور غير التبييض، بعض فوتوبليتشينج دائماً سيحدث، التي يجب أن تخضع للرقابة. وتشمل الضوابط الممكنة لهذا رصد الأسفار في عنصر تحكم عائد الاستثمار في الحصول على عائد الاستثمار، والحصول على صور التحكم في خلية مجاورة غير مقصور وإجراء تجارب التحكم في إعدادات مماثلة لتلك التي استخدمت في تجارب فوتوبليتشينج ولكن من دون هذا الحدث فوتوبليتشينج.
The authors have nothing to disclose.
ونشكر الدكتور سيث ربيع في “جامعة لويولا شيكاغو” على تعليقاته القيمة على هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منحة 1R01NS073967-01A1 إلى جوانا باكووسكا جيم.
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH30022.01 | High Glucose (4.5 g/L) |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35-mm |
Image J software | National Institutes of Health | N.A. | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391 | |
Nocodazole | Sigma | M1404 | |
Penicillin-streptomycin solution | Corning | 30-002-Cl | 100× |
Plan-Apochromat 63×/1.40 oil objective | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | 4407629904000000 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-1 | linear (MW 25,000) |
RAW 264.7 murine macrophages | ATCC | TIB-71 | |
Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | LSM 510 |