Descreveremos um protocolo abrangente e prático para recuperação de fluorescência após fotobranqueamento experimentos com células vivem. Embora o protocolo foi usado para medir a mobilidade dos p62 com tag proteína fluorescente amarelo em estruturas aggresome induzidas, pode ser aplicado a uma variedade de sistemas de microscopia e proteínas fluorescentes.
Recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP) é uma técnica de microscopia que pode ser usada para quantificar a mobilidade de proteínas nas células vivas. Em um típico experimento FRAP, fluorescência de estado estacionário é observada por imagem repetida com luz laser de baixa intensidade. Posteriormente, as moléculas fluorescentes são rapidamente e irreversivelmente prejudicadas através de breve exposição à luz do laser de alta intensidade. Informações sobre mobilidade de proteína são obtidas pelo monitoramento da recuperação de fluorescência. Costumávamos FRAP para determinar a mobilidade de p62 em aggresome induzida por estruturas (ALIS) em macrófagos murino após estimulação com lipopolissacarídeo (LPS). Porque muitos protocolos FRAP existentes são incompletas ou complexo, nosso objetivo era fornecer um protocolo passo a passo abrangente, prático e simples para FRAP experimentos com células vivas. Aqui, descrevemos a transfeccao de macrófagos RAW264.7 com amarelo fluorescente proteína-p62 (YFP-p62), indução de ALIS, expondo as células de LPS e um método passo a passo para a coleta de prebleach e postbleach FRAP imagens e análise de dados. Finalmente, discutimos factores importantes a considerar quando conduzindo um experimento FRAP.
Recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP) é uma técnica de microscopia que pode ser usada para quantificar a dinâmica da proteína em vivo células1,2. A popularidade do FRAP aumentou devido a ampla disponibilidade comercial de microscópios confocal com alta resolução, velocidade e sensibilidade de exploração do laser, e um “arco-íris” de geneticamente codificado proteínas fluorescentes, como verde fluorescente proteína (GFP) e proteína fluorescente amarela (YFP)3. Proteínas fluorescentes geneticamente codificadas são fundidas para uma proteína de interesse para permitir a Localização subcellular da proteína de interesse. Em um típico experimento FRAP, a fluorescência de estado estacionário em uma região de aquisição de interesse (ROI) dentro de uma célula é observada através de imagens repetidas de que ROI com luz laser de baixa intensidade. Posteriormente, as moléculas fluorescentes são rapidamente e irreversivelmente prejudicadas em um subconjunto predefinido da aquisição ROI, doravante referida como a lixívia, ROI, pela breve exposição à luz do laser de alta intensidade. Como novas proteínas crus repor proteínas descoradas ao longo do tempo, a velocidade e a intensidade da recuperação de fluorescência em lixívia ROI fornece informações sobre proteínas de mobilidade (Figura 1)4.
Nosso interesse em determinar a mobilidade do ubiquitin ligação proteína p62 (também conhecido como sequestosome-1) na aggresome induzida por estruturas (ALIS) em murino RAW264.7 macrófagos após estimulação com lipopolissacarídeo (LPS) levou-na rever o FRAP literatura. Infelizmente, muitos dos protocolos FRAP existentes são incompletas ou excessivamente complexo5,6,7,8,9. Alguns não fornecem informações detalhadas sobre as configurações do laser, configuração de caminho do feixe e imagem aquisição parâmetros5,6,7,8,9. Outros omitido detalhes importantes sobre a análise de dados, como forma de abordar a questão da lixívia ROI deriva6,9 ou como calcular parâmetros importantes de recuperação, incluindo a fração móvel (Mf), a fração de imóvel (Euf) e metade do tempo de recuperação (t½)5,7. Por outro lado, outros ênfase demais complexas fórmulas matemáticas para calcular Mf, eufe t1/25,6,8,9. Assim, nosso objetivo é fornecer um protocolo passo a passo abrangente, prático e simples para FRAP experimentos com células vivas.
Nós fornecemos um protocolo passo a passo abrangente, prático e simples para FRAP experimentos com células vivas. Neste documento, o protocolo foi utilizado para medir a mobilidade dos YFP-p62 no ALIS em macrófagos RAW264.7, mas pode ser aplicado a muitos dos sistemas do microscópio confocal de varredura a laser e geneticamente codificado proteínas fluorescentes que agora estão disponíveis. Para qualquer sistema de microscopia, experimentos piloto são críticos para a determinação de parâmetros ideais FRAP, incluindo aquisição, lixívia e tamanhos ROI de controle, intensidade do laser para fotobranqueamento e aquisição de imagem prebleach e postbleach. É razoável esperar que os parâmetros FRAP ideais para diferentes para cada linha fluorescente geneticamente codificada de proteína e células.
Factores importantes a considerar quando conduzindo um experimento FRAP incluem (a) realização adequada do descorante profundidade, (b) o uso de uma breve etapa de branqueamento, (c) que permite postbleach de tempo suficiente para observar a função de recuperação completa, (d) fotobranqueamento eficiência, (e). citotoxicidade com repetidas FRAP e (f) a inclusão de um controle para perda de fluorescência devido a imagem repetida. É recomendável que a profundidade de água sanitária, que pode ser calculada de acordo com a equação fornecida na seção 3.3.1, ser ≥ 9013. Quando a profundidade da água sanitária é < 90, o grau de recuperação de fluorescência postbleach ser subestimado e os valores de If, M,fe t1/2 será incorretas. Embora a duração e a intensidade dos pulsos de laser de lixívia de indução podem variar entre FRAP experimentos, é importante que a etapa de fotobranqueamento ser breve e substancialmente mais rápido do que a função de recuperação de fluorescência. Se não é, então, uma quantidade significativa de recuperação de fluorescência pode ocorrer durante a etapa de branqueamento. Com um tempo longo de lixívia, recuperação de fluorescência durante a etapa de branqueamento não seria medida, e levaria a medições incorretas de If, M,f, et1/2. Além disso, para obter os valores corretos paraf, M,f, et1/2, a aquisição de ROI deve ser observada postbleach até o nível de fluorescência em lixívia ROI atingiu um platô. Por exemplo, em nossos experimentos FRAP, não houve diferença entre o quef, M,fe t1/2 valores quando observamos YFP-p62 fluorescência em lixívia ROI para 32,2 min postbleach versus quando observamos YFP-p62 em lixívia ROI para postbleach de 15,1 min; assim, concluímos que a função de recuperação alcançado um platô em 15,1 min postbleach12. No que respeita à eficiência de fotobranqueamento, fotobranqueamento aumenta com o quadrado do fator zoom óptico14. Assim, o uso de lentes de zoom ópticos altos é favorável para fotobranqueamento rápido mas pode resultar em indesejável fotobranqueamento durante a aquisição; Este último pode ser contabilizado por um ROI de controle de imagem. Fotobranqueamento repetido é deve ser evitada pois pode levar à geração de espécies citotóxicas reativas de oxigênio (ROS). No entanto, o grau de geração de ROS devido à exposição a um laser de alta intensidade é mais baixo para proteínas fluorescentes geneticamente codificadas, do que para fluorophores química (por exemplo, anticorpos fluorescentes)15, e o ROS gerado são mais propensos a reagir dentro a proteína fluorescente geneticamente codificada do que com outras moléculas na célula4. Além da probabilidade aumentada de gerar ROS citotóxicos, repetido fotobranqueamento é deve ser evitada pois é difícil de controlar. Finalmente, embora a transmissão do laser de baixa é usado para adquirir todas as imagens não-alvejante, alguns fotobranqueamento invariavelmente ocorrerá, que deve ser controlado. Controles possíveis para isto incluem monitoramento fluorescência em um ROI de controle dentro da aquisição ROI, obtenção de imagens de controle em uma célula não-branqueada vizinha e realizando experiências de controle com as configurações idênticas para aqueles usados na experimentos de fotobranqueamento mas sem o fotobranqueamento evento.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos o Dr. Seth Robia na Loyola University Chicago por seus valiosos comentários sobre este manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH grant 1R01NS073967-01A1 para Joanna C. Bakowska.
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH30022.01 | High Glucose (4.5 g/L) |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35-mm |
Image J software | National Institutes of Health | N.A. | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391 | |
Nocodazole | Sigma | M1404 | |
Penicillin-streptomycin solution | Corning | 30-002-Cl | 100× |
Plan-Apochromat 63×/1.40 oil objective | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | 4407629904000000 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-1 | linear (MW 25,000) |
RAW 264.7 murine macrophages | ATCC | TIB-71 | |
Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | LSM 510 |