Descriviamo un protocollo completo e pratico per il recupero di fluorescenza dopo photobleaching esperimenti con cellule vivono. Anche se il protocollo è stato utilizzato per misurare la mobilità di giallo fluorescente proteina-etichetta p62 in aggresome-come le strutture indotte, può essere applicato ad una varietà di sistemi di microscopia e proteine fluorescenti.
Recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) è una tecnica di microscopia che può essere utilizzata per quantificare la mobilità della proteina in cellule vive. In un tipico esperimento FRAP, fluorescenza allo steady-state è osservato da formazione immagine ripetuta con luce laser a bassa intensità. Successivamente, le molecole fluorescenti sono rapidamente e irreversibilmente alterate tramite una breve esposizione alla luce laser ad alta intensità. Informazioni sulla mobilità della proteina sono ottenuti monitorando il recupero della fluorescenza. Abbiamo usato FRAP per determinare la mobilità di p62 in aggresome-come le strutture indotte (ALIS) in macrofagi murini dopo stimolazione con il lipopolysaccharide (LPS). Poiché molti protocolli FRAP esistenti sono incompleti o complesso, il nostro obiettivo era di fornire un protocollo completo, pratico e semplice passo-passo per FRAP esperimenti con cellule vive. Qui, descriviamo la transfezione dei macrofagi RAW 264.7 con giallo fluorescente proteina-p62 (YFP-p62), induzione di ALIS esponendo le cellule a LPS e un metodo passo passo per la raccolta di prebleach e postbleach FRAP immagini e analisi dei dati. Infine, si discute di fattori importanti da considerare quando un esperimento di FRAP.
Recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) è una tecnica di microscopia che può essere utilizzata per quantificare la dinamica di proteine in vivo le cellule1,2. La popolarità di FRAP è aumentata a causa della diffusa disponibilità commerciale di microscopi confocali con alta risoluzione, la velocità e la sensibilità di scansione laser, e un “arcobaleno” di geneticamente codificati proteine fluorescenti, come il verde fluorescente Protein (GFP) e la proteina fluorescente gialla (YFP)3. Le proteine fluorescenti geneticamente codificate sono fusi ad una proteina di interesse per consentire la localizzazione sottocellulare della proteina di interesse. In un tipico esperimento FRAP, la fluorescenza allo steady-state in una regione di acquisizione di interesse (ROI) all’interno di una cella è osservata tramite ripetute immagini di quel ROI con luce laser a bassa intensità. Successivamente, le molecole fluorescenti sono rapidamente e irreversibilmente alterate in un sottoinsieme predefinito dell’acquisizione ROI, appresso denominata la candeggina ROI, da una breve esposizione alla luce laser ad alta intensità. Come nuove proteine non candeggiati ricostituire sbiancati proteine nel corso del tempo, la velocità e l’intensità del recupero di fluorescenza nella candeggina ROI fornisce informazioni sulla proteina mobilità (Figura 1)4.
Il nostro interesse nella determinazione della mobilità dell’ubiquitina associazione proteina p62 (noto anche come sequestosome-1) in aggresome-come le strutture indotte (ALIS) in macrofagi murini RAW 264.7 dopo stimolazione con il lipopolysaccharide (LPS) ci ha portato a rivedere la FRAP letteratura. Purtroppo, molti dei protocolli FRAP esistenti sono incompleti o eccessivamente complesso5,6,7,8,9. Alcuni non forniscono informazioni dettagliate sulle impostazioni di laser, configurazione di percorsi di larghezza e immagine acquisizione parametri5,6,7,8,9. Altri omesso dettagli chiave relative all’analisi di dati, ad esempio come affrontare il problema di candeggina ROI drift6,9 o come calcolare i parametri di recupero importanti, tra cui il mobile frazione (Mf), frazione di immobile (Hof) e metà-tempo di recupero (t½)5,7. Al contrario, gli altri messo troppa enfasi su complesse formule matematiche utilizzate per calcolare Mf, hofe t1/25,6,8,9. Così, il nostro scopo è di fornire un protocollo completo, pratico e semplice passo-passo per FRAP esperimenti con cellule vive.
Forniamo un protocollo completo, pratico e semplice passo-passo per FRAP esperimenti con cellule vive. Nel presente documento, il protocollo è stato utilizzato per misurare la mobilità di YFP-p62 in ALIS in macrofagi RAW 264.7, ma può essere applicato a molti del microscopio confocale sistemi di scansione laser e geneticamente codificato proteine fluorescenti che sono ora disponibili. Per qualsiasi sistema di microscopia, esperimenti pilota sono fondamentali per determinare i parametri ottimali di FRAP, tra cui acquisizione, candeggina e misure di controllo di ROI, intensità del laser per photobleaching e acquisizione di immagini prebleach e postbleach. È ragionevole aspettarsi che i parametri ottimali di FRAP differiscano per ogni linea di proteine e cellule fluorescente geneticamente codificato.
Fattori importanti da considerare quando un esperimento di FRAP includono (a) raggiungimento adatto candeggina profondità, (b) l’uso di un breve passo d’imbianchimento, postbleach tempo sufficiente (c) che consente di osservare la funzione di recupero con registrazione completa, l’efficienza di photobleaching (d), (e). citotossicità con ripetute FRAP e (f) l’inclusione di un controllo per la perdita di fluorescenza dei ripetuti delle immagini. Si consiglia che la profondità di candeggina, che può essere calcolata secondo l’equazione fornita nella sezione 3.3.1, essere ≥ 9013. Quando la profondità di candeggina è < 90, il grado di recupero postbleach fluorescenza verrà essere sottovalutato e i valori di If, Mfe t1/2 sarà errati. Sebbene la durata e l’intensità degli impulsi laser che inducono candeggina può variare tra FRAP esperimenti, è importante che il passo di photobleaching essere breve e sostanzialmente più veloce rispetto alla funzione di recupero di fluorescenza. Se non è, una quantità significativa di recupero fluorescenza potrebbe verificarsi durante la fase di candeggina. Con un tempo lungo candeggina, recupero di fluorescenza durante la fase di candeggina non sarebbe misurato, e porterebbe a misurazioni errate di If, Mf, et1/2. Inoltre, per ottenere valori corretti per If, M,f, et1/2, l’acquisizione di ROI dovrebbe essere osservato postbleach fino a quando il livello di fluorescenza nella candeggina ROI ha raggiunto un plateau. Ad esempio, nei nostri esperimenti FRAP, non c’era differenza tra I valori di t1/2 , Mfefquando abbiamo osservato fluorescenza YFP-p62 la candeggina ROI per 32,2 min postbleach rispetto a quando abbiamo osservato YFP-p62 la candeggina ROI per postbleach 15,1 min; quindi, abbiamo concluso che la funzione di recupero ha raggiunto un plateau a 15,1 min postbleach12. Per quanto riguarda efficienza photobleaching, photobleaching aumenta con il quadrato del fattore zoom ottico14. Così, l’uso di obiettivi zoom ottici alte è favorevole per photobleaching rapido ma può causare indesiderati photobleaching durante acquisizione; quest’ultimo può essere contabilizzato mediante un controllo ROI di formazione immagine. Photobleaching ripetute deve essere evitata in quanto può portare alla generazione di specie reattive citotossiche dell’ossigeno (ROS). Tuttavia, il grado di generazione di ROS dovuti all’esposizione ad un laser ad alta intensità è inferiore per le proteine fluorescenti geneticamente codificate rispetto per fluorofori chimico (ad es., anticorpi fluorescenti)15, e il ROS generato è più propensi a reagire all’interno della proteina fluorescente codificata geneticamente rispetto con altre molecole in cella4. Oltre la maggiore probabilità di generare ROS citotossici, ripetute photobleaching è da evitarsi in quanto è difficile da controllare. Infine, sebbene la trasmissione laser basso viene utilizzato per acquisire tutte le immagini non-candeggina, alcuni photobleaching invariabilmente si verificherà, che deve essere controllato. Possibili controlli per questo includono monitoraggio fluorescenza in un controllo ROI entro l’acquisizione ROI, ottenendo immagini di controllo in una cella vicina greggia ed esecuzione di esperimenti di controllo con le impostazioni identiche per chi è abituato alla photobleaching esperimenti ma senza l’evento photobleaching.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il dottor Seth Robia alla Loyola University Chicago per i suoi preziosi commenti su questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da NIH grant 1R01NS073967-01A1 a Joanna C. Bakowska.
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH30022.01 | High Glucose (4.5 g/L) |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35-mm |
Image J software | National Institutes of Health | N.A. | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391 | |
Nocodazole | Sigma | M1404 | |
Penicillin-streptomycin solution | Corning | 30-002-Cl | 100× |
Plan-Apochromat 63×/1.40 oil objective | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | 4407629904000000 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-1 | linear (MW 25,000) |
RAW 264.7 murine macrophages | ATCC | TIB-71 | |
Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | LSM 510 |