우리는 photobleaching 실험 라이브 셀 후 형광 복구에 대 한 포괄적이 고 실용적인 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜은 aggresome 같은 유발된 구조에 노란색 형광 단백질 태그 p62의 이동성 측정 하는 데 사용 됩니다, 하지만 그것은 현미경 시스템 및 형광 단백질의 다양 한에 적용할 수 있습니다.
Photobleaching (FRAP) 후 형광 복구 라이브 세포에서 단백질 이동성을 계량 하는 데 사용할 수 있는 현미경 기술 이다. 전형적인 FRAP 실험에서 정상 형광 반복된 이미징 낮은 강도 레이저 빛에 의해 관찰 된다. 그 후, 형광 분자는 고 강도 레이저 광에 짧은 노출을 통해 신속 하 고 irreversibly 장애인. 단백질 이동성에 대 한 정보는 형광의 복구를 모니터링 하 여 얻어진 다. 우리 사용 FRAP lipopolysaccharide (LPS)와 자극 후 p62 murine 세포에 aggresome 같은 유도 구조 (ALIS)에서 이동성을 확인 합니다. 많은 기존 FRAP 프로토콜 불완전 하거나 복잡 한 때문에, 우리의 목표 FRAP 실험 라이브 셀을 위한 포괄적인, 실용적인, 그리고 간단한 단계별 프로토콜을 제공 했다. 여기, 우리 RAW264.7 macrophage transfection 노란 형광 성 단백질-p62 (YFP-p62), 유도 ALIS의 LPS와 prebleach 및 postbleach FRAP 이미지 및 데이터 분석을 수집 하기 위한 단계적인 방법 셀을 노출 하 여 함께 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 FRAP 실험을 실시 하는 때 고려해 야 할 중요 한 요소 토론.
1,2세포를 형광 복구 후 photobleaching (FRAP) 라이브에서 단백질 역동성을 계량 하는 데 사용할 수 있는 현미경 기술 이다. FRAP의 인기와 높은 해상도, 속도, 감도, confocal 현미경 스캐닝 레이저의 광범위 한 상업적인 가용성 때문에 증가 하 고의 “무지개” 유전자 형광 단백질, 형광 녹색 같은 인코딩 단백질 (GFP) 고 노란 형광 성 단백질 (YFP)3. 인코딩된 유전자 형광 성 단백질 관심사의 단백질의 subcellular 지 방화에 대 한 허용 하는 관심사의 단백질에 융합 된다. 전형적인 FRAP 실험에서 관심 (ROI) 셀 내에서 수집 지역에서 정상 형광 낮은 강도 레이저 빛으로 그 투자 수익의 반복된 영상 통해 관찰 됩니다. 그 후, 형광 분자는 신속 하 고 irreversibly 나쁘게 라 함 표 백제 ROI, 고 강도 레이저 광에 짧은 노출에 의해 인수 투자 수익, 미리 정의 된 하위 집합에. 으로 새로운 표백된 단백질 시간이 지남에 표백된 단백질 보충, 형광 표 백제 ROI에에서 복구의 강도와 속도 단백질 이동성 (그림 1)4에 대 한 정보를 제공 합니다.
우리의 관심이 murine RAW264.7 세포에 aggresome 같은 유도 구조 (ALIS)에서 유비퀴틴 바인딩 단백질 p62 (sequestosome 1)의 이동성 lipopolysaccharide (LPS)와 자극 주도하는 FRAP 검토 후 결정 문학입니다. 불행히도, 많은 기존 FRAP 프로토콜의 불완전 하거나 지나치게 복잡 한5,6,7,,89입니다. 일부 레이저 설정, 빔 경로 구성 및 이미지 수집 매개 변수5,6,7,,89에 대 한 자세한 정보를 제공 하지 않습니다. 다른 표 백제 ROI 드리프트6,9 의 문제를 해결 하는 방법 또는 모바일 분수 (Mf), 움직이기 힘 드는 분수를 포함 하 여 중요 한 복구 매개 변수를 계산 하는 방법 등의 데이터 분석에 관한 주요 내용 생략 (나f), 그리고 복구 (t½)5,7의 하프 타임. 반대로, 다른 Mf, 계산 하는 데 사용 하는 복잡 한 수학 공식에 너무 많은 중점을 배치 나f및 t1/25,6,,89. 따라서, 우리의 목적은 라이브 셀 FRAP 실험에 대 한 포괄적인, 실용적인, 그리고 간단한 단계별 프로토콜을 제공 하는 것 이다.
라이브 셀 FRAP 실험, 실용적인 포괄적이 고 간단한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 여기, 프로토콜 RAW264.7 세포에 YFP-p62 ALIS에서의 이동성을 측정 하는 데 사용 했다 하지만 레이저 confocal 현미경 시스템을 스캔의 많은에 적용할 수 있는 유전자 인코딩 형광 단백질을 사용할 수 있습니다. 모든 현미경 시스템에 대 한 파일럿 실험이 photobleaching, 및 prebleach 및 postbleach 이미지 수집에 대 한 수집, 표 백제, 및 제어 ROI 크기, 레이저 강도 포함 한 최적의 FRAP 매개 변수를 결정 합니다. 그것은 각 유전자 인코딩된 형광 단백질 및 세포 라인에 대 한 다를 최적의 FRAP 기대 하입니다.
(A) 적합 한 달성 포함 FRAP 실험 실시 때 고려해 야 할 중요 한 요소는 깊이, (b) 간략 한 표백 단계, (c) 수 있도록 충분 한 시간 postbleach 전체 복구 기능, (d) photobleaching 효율성, 관찰의 사용 표 백제 (e). 반복 FRAP와 (f) 반복된 이미징 인해 형광 손실에 대 한 컨트롤의 포함 세포 독성. 3.3.1 섹션에 제공 된 공식에 따르면 산출 될 수 있다, 표 백제 깊이 ≥ 9013수 하는 것이 좋습니다. 때 표 백제 깊이 < 90, postbleach 형광 복구의 정도 과소평가 될 것입니다, 그리고 값의f, Mf, t1/2 것 이다 잘못 될. 기간 및 표 백제 유도 레이저 펄스의 강도 FRAP 실험 사이 다를 수 있습니다, 비록 photobleaching 단계 짧고 형광 복구 기능 보다 실질적으로 더 빠른 것이 중요 하다. 그것은, 상당한 양의 형광 복구 표백 단계 동안 발생할 수 있습니다. 긴 표 백제 시간, 형광 표백 단계에서 복구 하지 측정 것입니다, 그리고 그것은 나의 잘못 된 측정으로 이어질 것 이다f, Mf, 그리고t1/2. 또한,f, Mf, 나에 대 한 올바른 값을 얻을 수 및t1/2, 수집 투자 수익 관찰 해야 postbleach 표 백제 ROI에에서 형광 수준 고원에 도달 했습니다 때까지. 예를 들어 우리의 FRAP 실험에서 때 차이 If, Mf및 t1/2 값 32.2 분에 대 한 투자 수익 표 백제 때 우리가 투자 수익 표 백제 YFP-p62 관찰 대 postbleach의 YFP p62 형광 관찰에 대 한 15.1 분 postbleach; 따라서, 우리는 복구 기능 15.1 분 postbleach12에서 정점에 도달 하는 결론을 내렸다. Photobleaching 효율성, 관련 photobleaching 광학 줌 요인14의 제곱으로 증가 한다. 따라서, 높은 광학 줌 렌즈를 사용 하 여 신속한 photobleaching에 대 한 유리한 이지만; 중 바람직하지 않는 photobleaching 귀 착될 수 있다 후자 수 수 차지 제어 투자 수익을 이미징 하 여. 반복된 photobleaching 세포 독성 반응 산소 종 (ROS)의 발생으로 이어질 수 있습니다 피해 야 하는 것입니다. 그러나, 높은 강도 레이저에 노출으로 인해 선생님 세대의 정도 화학 fluorophores (예를 들어, 형광 항 체)15, 보다 유전자 인코딩된 형광 단백질에 대 한 낮은 그리고 생성 선생님 반응 더 높습니다. 내는 유전자 인코딩된 형광 단백질 보다 셀4에 다른 분자와. 생성 하는 세포 독성 선생님의 증가 가능성, 뿐만 아니라 반복된 photobleaching 그것은 제어 하기 어려운 피할 것입니다. 마지막으로, 낮은 레이저 전송은 모든 비 블리치 이미지 사용, 일부 photobleaching 변함없이 발생 합니다 하지,이 제어 해야 합니다. 이 가능한 컨트롤 포함 수집 투자 수익 내 컨트롤 ROI에에서 형광 모니터링, 이웃 표백된 셀에 컨트롤 이미지 획득 및 그 사용에 대 한 동일한 설정 제어 실험을 수행 합니다 photobleaching 실험 photobleaching 이벤트 없이.
The authors have nothing to disclose.
우리는에 대 한 그의 귀중 한 의견이이 원고 Loyola 대학 시카고 박사 세스 Robia을 감사합니다. 이 작품은 NIH 그랜트 1R01NS073967-01A1 조 안 나 C. Bakowska에 의해 지원 되었다.
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH30022.01 | High Glucose (4.5 g/L) |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35-mm |
Image J software | National Institutes of Health | N.A. | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391 | |
Nocodazole | Sigma | M1404 | |
Penicillin-streptomycin solution | Corning | 30-002-Cl | 100× |
Plan-Apochromat 63×/1.40 oil objective | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | 4407629904000000 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-1 | linear (MW 25,000) |
RAW 264.7 murine macrophages | ATCC | TIB-71 | |
Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | LSM 510 |