Summary
我们描述了一种全面和实用的方法, 荧光恢复后的光漂白实验与活细胞。虽然该协议被用来测量黄色荧光蛋白标记 p62 在类似侵犯诱导结构中的流动性, 但它可以应用于各种显微镜系统和荧光蛋白。
Abstract
光漂白 (FRAP) 后的荧光恢复是一种显微镜技术, 可用于量化活细胞中的蛋白质迁移率。在一个典型的 FRAP 实验中, 用低强度激光重复成像观察稳态荧光。随后, 荧光分子通过短暂暴露在高强度激光下, 受到迅速和不可逆转的损害。通过监测荧光的恢复, 获得了有关蛋白质流动性的信息。我们用 FRAP 测定了脂多糖 (LPS) 刺激小鼠巨噬细胞在侵犯性诱导结构 (ALIS) 中 p62 的流动性。由于许多现有的 FRAP 协议要么不完整, 要么很复杂, 所以我们的目标是为活细胞的 FRAP 实验提供一个全面、实用和直接的分步协议。在这里, 我们描述 RAW264.7 巨噬细胞转染与黄色荧光蛋白-p62 (YFP-62), 通过将细胞暴露在 LPS 中引入 alis, 以及收集预漂白剂和后漂白剂的 RAP 图像和数据分析的分步方法。最后, 我们讨论了在进行 FRAP 实验时需要考虑的重要因素。
Introduction
光漂白 (frap) 后的荧光恢复是一种显微镜技术, 可用于量化活细胞1,2中的蛋白质动态。由于高分辨率、高速度和灵敏度的激光扫描共聚焦显微镜以及绿色荧光等基因编码荧光蛋白的 "彩虹", FRAP 的普及程度有所提高蛋白质 (GFP) 和黄色荧光蛋白 (YFP)3。基因编码的荧光蛋白融合到感兴趣的蛋白质中, 以实现感兴趣的蛋白质的亚细胞定位。在一个典型的 FRAP 实验中, 通过用低强度激光重复成像该 ROI, 可以观察到细胞内感兴趣的采集区域 (ROI) 中的稳态荧光。随后, 荧光分子在预定义的采集 ROI 子集 (以下简称漂白剂 roi) 中受到快速且不可逆转的损害, 方法是短暂暴露于高强度激光。随着时间的推移, 新的未漂白蛋白质补充漂白蛋白质, 漂白 ROI 中荧光恢复的速度和强度提供了有关蛋白质流动性的信息 (图 1)4。
我们对确定泛素结合蛋白 62 (也称为固合物-1) 在小鼠 RAW264.7 巨噬细胞中的侵袭性诱导结构 (ALIS) 的流动性的兴趣, 导致我们回顾了 FRAP文学。不幸的是, 许多现有的 frap 协议不完整或过于复杂 5、6、7、8、9。有些没有提供有关激光设置、光束路径配置和图像采集参数5、6、7、8、9的详细信息。另一些人省略了有关数据分析的关键细节, 如如何解决漂白剂roi漂移6、9或如何计算重要的恢复参数, 包括移动分数 (mf)、不动分数(i) 和半场恢复 (t;半)5,7。相反, 另一些人过于强调用于计算 m f、if和t5、6、8、9的复杂数学公式.因此, 我们的目的是为活细胞的 FRAP 实验提供一个全面、实用和直接的分步协议。
Protocol
1. RAW264.7 巨噬细胞转染
- 在完整培养基中培养 100, 000 RAW264.7 细胞 (材料表) (Dulbecco 的改性鹰培养基 (dmem)) (材料表), 含 4.5 g/L 葡萄糖, 辅以10% 的胎牛血清 (材料表)) 和青霉素 (材料表) 到未经处理的35毫米玻璃底盘中 (材料表), 并将盘中放置在 37°c% co2 孵化器中.第二天, 使用 1 mgl 聚乙二醇聚乙二醇 (PEI) (材料表) 转染细胞。
- 将1.5 微克的 YFP-62 与8μl 混合到166Μl 无血清 DMEM (不含胎儿牛血清和青霉素的基培养基) 中。
- 在将混合物加入每个板之前, 让转染复合混合物在室温下坐15分钟。
- 将配合物加入现有培养基中, 使其与细胞一起, 轻轻摇晃板材。
- 将板材放置在 37°c/5% co 2 孵化器中过夜。
- 第二天早上, 将介质从盘子上吸走, 然后用完整的培养基冲洗一次。在盘子中加入2毫升的完整介质, 让细胞恢复到第二天。
2. 脂多糖 (LPS) 诱导 ALIS
- 第二天, 从板材中取出培养基, 然后加入含有 10 ngml LPS (材料表) 的完整培养基1毫升。允许板材在 37°c% co% 2 孵化器中孵育 5小时.
- LPS 处理后, 吸入培养基, 然后加入1毫升的冷, 无菌 Tyrand 的缓冲液含有 145 mM ncl, 5 mM KCl, 10 mm 葡萄糖, 1.5 mM Ccl 2, 1.0 mm MgCl2, 和 10 mM Hepes (ph 7.4) 冲洗板.
- 吸吸缓冲液, 然后加入1毫升的冷, 无菌的 Tyrode 的缓冲液补充10μgml 诺达唑 (材料表)。在 FRAP 成像和分析之前, 允许板材在4°c 下孵育15-20。
请注意:使用 Tyrode 的缓冲液, 其中包含 HEPES 作为缓冲化合物, 可以在室温下进行成像。用微管来减少阿尔维斯运动。培养基中含有碳酸氢盐作为缓冲化合物, 需要二氧化碳作为缓冲剂进行缓冲。否则, 在没有二氧化碳的情况下, 介质中含有的碳酸氢盐会改变 ph 值。
3. 共聚焦显微镜的建立和感兴趣的区域的选择
- 激光选择和光束路径配置
- 使用任何配备 AIM 或 ZEN 软件 (材料表) 或任何合适的成像软件的合适的共聚焦显微镜 (材料表)。
- 选择 Argon/2 激光器的514纳米线, 因为 YFP 的峰值激发为512纳米, 峰值发射为 514 nm。单击 "获取"按钮, 然后单击 "激光" 按钮。在 "激光控制" 窗口中, 单击Argon/2 458、458、458、514 nm,然后单击 "待机" 按钮。等待约3分钟等待激光预热后, 单击 "打开"按钮 (图 2a)。
- 将 514 nm Argon/2 激光线的激光功率设置为 100% (8.6 A)。单击 "获取"按钮, 然后单击 "激光" 按钮。在 "激光控制" 窗口中, 在"输出 [%]字段中输入100 , 然后按enter " 按钮 (图 2a)。
- 将514纳米 Argon/2 激光线的传输设置为5%。单击 "获取"按钮, 然后单击 "通道"按钮。在 "扫描控制" 窗口中, 单击 "通道" 按钮, 然后单击"行活动" 列中文本514 nm左侧的方形白色框, 以激活 514 nm 激光线。在 514 nm 激光线的传输 [%]字段中输入5 (图 2d)。
- 将主二色光束分离器 (Haupt Farb Teiler (HFT)) 设置为Hft 458/14561位置, 使这些带偏转到样品进行激发。单击 "获取"按钮, 然后单击 "配置"按钮。在 "配置控制" 窗口中, 单击 "通道模式" 按钮, 然后单击 "单一轨道" 按钮。单击Hft按钮, 然后从下拉菜单中选择hft 458\
- 将第一二次二色光束分离器 (Neben Farb Teiler 1 (NFT1)) 设置为镜像位置, 这将使100% 的光线偏转到第二次二色光束分离器 (Neben farb teiler 2 (NFT2))。单击 "获取"按钮, 然后单击 "配置"按钮。在 "配置控制" 窗口中, 单击 "通道模式" 按钮, 然后单击 "单一轨道" 按钮。单击Nft1按钮, 然后从下拉菜单中选择"镜像" (图 2b)。
- 将第二次二色分光束分频器 (NFT2) 设置为Nft 515位置, 以确保波长和 lt;515 纳米将被反射, 波长和 gt;515 纳米将被传输。单击 "获取"按钮, 然后单击 "配置"按钮。在 "配置控制" 窗口中, 单击 "通道模式" 按钮, 然后单击 "单一轨道" 按钮。单击Nft2按钮, 然后从下拉菜单中选择nft 515 (图 2b)。
- 将长通 (LP) 发射滤波器 (EF) 设置为lp 530, 这样波长和 gt;530 纳米将被传输到光电倍增管 (pmt, 检测器)。单击 "获取"按钮, 然后单击 "配置"按钮。在 "配置控制" 窗口中, 单击 "通道模式" 按钮, 然后单击 "单一轨道" 按钮。单击"排放筛选器" 按钮, 然后从下拉菜单中选择lp 530 (图 2b)。
- 选择通道3。单击 "获取"按钮, 然后单击 "配置"按钮。在 "配置控制" 窗口中, 单击 "通道模式" 按钮, 然后单击 "单一轨道" 按钮。点击Ch3按钮左侧的方形白色框。
- 图像采集设置
- 选择 plan-apo-chect236x1.40 油目标 (材料表)。通过显微镜目镜查看标本, 并将 ALIS 放置在视野的中心。单击 "获取"按钮, 然后单击 "微"按钮。在"显微镜控制" 窗口中, 单击"目标", 然后从下拉菜单中选择 plan-apo-ch哈尔特63x/1.40 油目标。
- 将帧大小设置为512 x 512 像素, 将扫描速度设置为8, 将数据深度设置为12位。单击 "获取"按钮, 然后单击 "扫描" 按钮。在 "扫描控制" 窗口中, 单击 "模式" 按钮和"框架" 按钮, 然后单击512按钮。在 "扫描速度" 字段中输入8 , 按enter, 然后单击12位按钮 (图2 c)。
- 将扫描平均值设置为1 , 将光学变焦设置为3。单击 "获取"按钮, 然后单击 "扫描" 按钮。在 "扫描控制" 窗口中, 单击扫描平均数字字段的向下箭头按钮, 然后从下拉菜单中选择1 。在光学变焦字段中输入3 , 然后按enter (图 2c)。
- 将针孔设置为1.95 气单位, 探测器增益设置为582 (刚刚低于饱和度)。单击 "获取"按钮, 然后单击 "扫描" 按钮。在 "扫描控制" 窗口中, 单击 "通道" 按钮, 在 "针孔" 字段中输入196 , 然后按enter。在 "检测器增益" 字段中输入582 , 然后按enter (图 2d)。
- 确保 514 nm Argon/2 激光线设置为100% 功率 (8.6 A)。单击 "获取"按钮, 然后单击 "激光" 按钮。在"激光控制" 菜单中, "输出 [%] 字段中的值应为100 (图 2a)"。
- 确保 514 nm Argon/2 激光线设置为5% 的传输。单击 "获取"按钮, 然后单击 "扫描" 按钮。在 "扫描控制" 窗口中, 514 nm 激光线的 "传输 [%] 字段中的值应为5 (图 2d)。
- 创建具有 150 x 150 像素 (194.6 微米 2) 的方形 ROI (购置 roi)。单击 "获取"按钮, 然后单击 "编辑 roi " 按钮。在 "编辑 roi " 菜单中, 单击矩形图标, 然后在图像窗口中单击并拖动, 以创建具有尺寸为 150 x 150 像素 (194.6 微米2) 的正方形 (图 1a)。
请注意:收购 ROI 包括: (a) 感兴趣的 ALIS, (b) 非 alis (控制 ROI) 且至少为 20 x 20 像素 (3.3 微米 2) 的荧光区域; (c) 至少 20 x 20 像素 (3.3 微米) 的荧光面积 (背景 ROI)2) (图 1a)。在采集 ROI 中包括控制 ROI 非常重要, 这样就可以控制重复成像可能发生的光漂白。此处定义的收购投资回报率将是唯一要扫描的区域。在获取 ROI 范围内重复激光扫描只会限制光漂白对 ROI 的影响, 而不是, 例如, 光漂白整个细胞或多个细胞, 并且在 PMT (探测器) 收集的像素数将大于扫描整个单元格或多个单元格后, 在 PMT (检测器) 收集的像素。 - 设置时间序列, 扫描收购投资回报率 35次, 每30秒一次. 单击 "获取"按钮, 然后单击 "时间序列" 按钮。在 "时间序列控制" 窗口中, 单击 "手动启动系列" 按钮和"手动停止系列" 按钮。在手动停止系列字段中输入35 , 按enter键, 然后单击30.0秒周期延迟按钮 (图 2e)。
- 设置漂白剂控制, 使光漂白后会发生扫描号 5, 收集5个预漂白剂图像的采集 ROI。单击 "获取"按钮, 然后单击 "编辑漂白剂" 按钮。在 "漂白剂控制"窗口中, 在数字扫描后单击 "漂白剂"旁边的白色正方形。在扫描编号字段中输入5 , 然后按Enter键 (图 2f)。
请注意:应在相同的光学深度采集前漂白剂和后漂白剂图像。 - 在 ALIS 内创建直径为10像素 (面积 = 0.8 微米2) 的圆形漂白剂 roi。单击 "获取"编辑漂白剂定义区域。在 "漂白区域"窗口中, 单击 "圆形" 图标。单击并拖动图像窗口以创建直径为10像素的圆 (面积 = 0.8 微米2) (图 2f)。
- 将迭代设置为300。单击 "获取"按钮, 然后单击 "编辑漂白剂" 按钮。在 "漂白剂控制" 窗口中, 在 "迭代" 字段中输入300,然后按enter键 (图 2f)。
- 将 Argon/2 514nm 激光线设置为100% 功率 (8.6 A), 并在漂白剂期间进行100% 传输。单击 "获取"按钮, 然后单击 "编辑漂白剂" 按钮。在 "漂白剂控制" 窗口中, 单击514 nm左侧的白色正方形框。在 514 nm 激光线的 "传输 [%] 字段中输入100 , 然后按Enter按钮 (图 2f)。
请注意:迭代的次数需要根据经验来确定。它将根据荧光体、将被漂白的结构大小和激光而有所不同。
- 数据采集
- 开始 FRAP 实验。收集前5个预漂白图像和第一个后漂白剂图像, 然后根据以下公式计算漂白剂深度。
如果漂白剂深度 lt;90, 停止实验并丢弃数据, 因为漂白剂深度不够。当漂白剂深度≥90时, 使用图像处理程序和电子表格程序 (材料表) 收集数据进行分析。
注: 当 ALIS 漂移≥3μm 时, 停止实验并丢弃数据, 因为无法通过图像处理软件 (材料表) 进行分析来校正此量的图像漂移。当 ALIS 漂移为 & lt;3 μm 时, 使用图像处理程序和电子表格程序 (材料表) 收集数据进行数据分析。 - 从10个细胞中收集来自 10个 ALIS 的 FRAP 数据, 这些细胞的偏离距离小于3μm。接下来, 将 AIM 文件传输到个人计算机进行数据分析。
- 开始 FRAP 实验。收集前5个预漂白图像和第一个后漂白剂图像, 然后根据以下公式计算漂白剂深度。
- 图像处理程序中的数据分析
- 通过对齐或匹配 (即, 注册) 采集 ROI 的时间序列图像堆栈来更正图像漂移。为此, 请使用图像处理程序 (材料表) 打开每个 aim. lsm 文件, 然后选择插件报名表斯塔克雷格翻译。接下来, 选择插件报名表斯塔克雷格刚体10。
- 设置 ROI 经理, 以测量漂白剂 ROI 中的信号强度。选择"分析"工具类投资回报率经理。选择"椭圆" 工具, 然后在漂白剂 roi 中绘制一个直径为10像素的圆圈, 然后单击"添加"按钮。
- 设置投资回报率管理器, 以测量控制 ROI 中的信号强度。在 ROI 管理器中, 选择"矩形" 工具, 然后在控件 roi 区域中绘制一个 20 x 20 像素的正方形, 然后单击 "添加"按钮。
- 设置投资回报率管理器, 以测量后台投资回报率中的信号强度。在 ROI 管理器中, 选择"矩形" 工具, 在背景 roi 区域中绘制一个 20 x 20 像素的正方形, 然后单击 "添加"按钮。
- 重命名 Roi。添加要在Roi 管理器中分析的 roi 后, 相应地将其重命名为 "漂白 Roi"、"控制 Roi" 和"背景 roi "。
- 测量 Roi 中的信号强度。选择"漂白 Roi"、"控制 roi" 和"后台 roi", 然后选择 "更多"多项测量。确保选择 "测量每个切片的所有35个切片和一行" 。在 "设置测量值"窗口中, 确保只选择"平均值" 。
请注意:这些是原始的 FRAP 数据 (图 1b)。 - 将结果粘贴到电子表格程序中 (材料表)。复制漂白剂 roi、控制 ROI 和背景 ROI 信号强度结果, 然后将它们分别粘贴到电子表格程序中标记为漂白剂 roi、控制 roi和后台 roi的列 (材料表)。
- 电子表格程序中的数据分析
- 背景校正漂白剂 ROI 中的信号强度并控制 ROI (图 1a、c)。使用电子表格程序 (材料表) 中的"插入函数" 工具, 从标记为"漂白剂 roi" 的列中的值中减去标记为"背景 roi " 的列中的值。从标记为 "控制 roi "的列中的值减去标记为 "背景 roi" 的列中的值。标记这些新列更正了漂白剂 Roi并更正了控制 roi。
- 将漂白剂 ROI 中的信号归一化到控制 ROI 中的背景校正信号 (图 1a, d)。使用电子表格程序 (材料表) 中的"插入" 函数, 将标记为 "更正的漂白剂 roi" 的列中的值除以标记为"更正控制 roi" 的列中的值。标记此新列归一化更正漂白剂 Roi.
- 将归一化的 "校正漂白 Roi " 列中的信号归一化为漂白剂 roi 中5个预漂白值的平均值 (图 1a, e)。计算漂白剂 ROI 中5个预漂白值的平均值。接下来, 将标记为"规范化更正的漂白剂 Roi " 的列中的值除以漂白剂 roi 中5个预漂白值的平均值。标记此新列归一化更正前漂白剂平均漂白剂平均漂白剂 Roi.
- 移动分数和从曲线拟入数据中恢复的一半时间
- 使用图像处理程序 (材料表) 对归一化和校正的漂白剂 ROI 数据进行曲线拟合。在成像处理程序 (材料表) 中, 选择"分析"工具类曲线拟合.复制后漂白剂归一化和修正的漂白剂 roi 值和相应的时间值, 然后将它们粘贴到"曲线打火机" 窗口中。从 "曲线范围"下拉菜单中选择 "指数恢复" , 然后选择 "适合"。
- 从恢复函数的参数计算 mf , 该参数提供了以下值: "a", 这是一个缓慢恢复的分数;"b," 回收率;和 "c", 一个快速扩散的分数。通过将 "a" 和 "c" 的值插入方程 Mf = a + c 计算 i f 来计算 mf,使用方程 i f = 1-mf计算 i f。计算 t半,将值替换为 "b" 到方程
中, 然后求解为t 半.11
中, 然后求解为t 半.11
Representative Results
这里显示的是一个典型的实验的结果, 我们使用 FRAP 来检查在 RAW264.7 细胞中使用 LPS 处理 3-5 h 12 的 ALIS 中的 p62 的流动性程度。图 3a显示了在对齐图像堆栈以纠正 allis 的少量 (< ~ 3μm) 图像漂移后从漂白剂、控制和背景 roi 中获得的原始数据。在预漂白剂和后漂白剂上, YFP-62 荧光如图 3 e 和补充视频 1所示。图 3b在背景校正后显示这些数据。图 3c显示这些数据在校正荧光在控制 roi 以后。图 3d显示这些数据归一化为漂白剂 roi 中5个预漂白值的平均荧光。本实验中漂白的程度是足够的 (漂白深度 = 91.94)。yfp-62 荧光在此 ALIS 内恢复缓慢, 因为 t半= 128 8.27秒 (2.14分钟)。YFP-62 在这个实验中不是一个很流动的蛋白质, 因为 Mf = 21.97, if = $0803。
图 1: RAW264.7 单元格的示意图和 FRAP 图像对齐后的图像分析步骤, 以纠正 alis 的图像漂移.(a) RAW264.7 单元格的示意图, 描述了多个 alis 以及采集 roi 中的漂白剂、控制和背景 roi。(b) 在 a. (c) 面板 a. (c) 中对在漂白剂、控制和背景 roi 中获得的原始 frap 数据的理想化描述, 以及已进行背景校正的原始 frap 数据的理想化图形。(d) 在控制 roi 中已归一化为荧光的背景校正 frap 数据的理想化图。(e) 已归一化和背景校正的 frap 数据的理想化图, 该数据已归一化为漂白剂 roi 中的预漂白荧光。缩写: Con = 控制;BG = 背景。这一数字是从拉古特和埃伦伯格4号修改的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:用于激光选择、光束路径配置和用于 FRAP 实验的图像采集参数的 aim 软件 (材料表) 中的用户界面图像.(a) 激光控制屏幕, 显示使用的 argon/2 激光线、输出和管电流。(b) 显示所使用的分束和发射滤波器设置的配置控制屏幕。(c) 扫描控制屏幕, 显示用于图像采集的设置。(d) 扫描控制屏幕, 显示 argon\ 2514 nm 激光线的针孔、探测器增益、放大器偏移、放大器增益和传输设置。(e) 显示所使用的时间序列设置的时间序列控制屏幕。(f) 显示所使用的预漂白剂和后漂白剂参数的漂白剂控制屏幕。缩写: HFT = Haupt farb Teiler (主双色分束分配器);NT1 = Neben Farb Teiler 1 (第一二次双色分束分离器);NT2 = Neben Farb Teiler 2 (第二次二重化光束分离器);EF = 排放过滤器。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 一个具有代表性的 FRAP 实验, 用于研究 raw264.7 细胞中 alis 中 YFP-62 动力学.(a) 漂白剂、控制和背景 roi 的原始荧光强度数据。(b) 在漂白剂和控制 roi 后, a 组中给出的数据已在背景 roi 中进行荧光校正。(c) 在将漂白剂 roi 中的荧光强度归一化后, 在 A 和 b 面板中给出的数据, 以解释背景校正控制 roi 中的荧光。(d) 在归一化和背景校正的漂白剂 roi 中的荧光强度归一化后, 在 a-c 面板中给出的数据, 使之达到漂白剂 roi 中前5个预漂白值的平均值。Mf = 21.97, if = $78. 03, t半= 128 8.27 秒 (2.14秒), 漂白剂深度 = 91.94。(e) 预漂白剂 (1.5 分) 和后漂白剂 (0、6和 16分钟) 处的 alis 图像。刻度杆 = 5μm, 适用于所有面板。缩写: Con = 控制;BG = 背景;更正;规范。= 归一化;平均 = 平均。这个数字是从 Cabe 等人的 12修改的, 请点击这里查看这个数字的更大版本.
补充视频 1: 一个典型的 alis 在 RAW264.7 巨噬细胞前后光漂白和光漂白.YFP-62 荧光在光镜下恢复缓慢;因此, 62 不是一个很可移动的蛋白质。对于这个实验, Mf = 25.62, if = 74.38,t 半= 442.79 秒 (7.38分钟), 漂白剂深度 = 90.19。刻度杆 = 5μm。此视频是修改从小木屋等12请点击这里查看此视频。(右键单击下载.
Discussion
我们为活细胞 FRAP 实验提供了一个全面、实用和简单的分步协议。在此, 该协议被用来测量 YFP-62 在刚刚264.7 巨噬细胞的 alis 中的流动性, 但它可以应用于许多激光扫描共聚焦显微镜系统和基因编码荧光蛋白, 这些系统和基因编码的荧光蛋白现已可用。对于任何显微镜系统, 试点实验对于确定最佳 FRAP 参数都至关重要, 包括采集、漂白剂和控制 ROI 大小、用于光漂白的激光强度以及预漂白和后漂白剂图像采集。对于每个基因编码的荧光蛋白和细胞系, 预计最佳 FRAP 参数会有所不同是合理的。
在进行 FRAP 实验时需要考虑的重要因素包括: (a) 达到适当的漂白剂深度, (b) 使用短暂的漂白剂步骤, (c) 让足够的时间后观察完全恢复功能, (d) 光漂白效率, (e)具有重复 FRAP 的细胞毒性, 以及 (f) 包括对重复成像引起的荧光损失的控制。我们建议漂白剂深度是≥90 13, 它可以根据3.3.1 部分提供的方程计算.当漂白剂深度 lt;90 时, 漂白剂后荧光恢复的程度会被低估, if、mf 和t半的值就不正确了。尽管在 FRAP 实验中, 诱导漂白剂的激光脉冲的持续时间和强度可能会有所不同, 但光漂白步骤的长度和速度必须比荧光恢复函数快很多。如果不是, 那么在漂白步骤中可能会发生大量的荧光恢复。在较长的漂白剂时间内, 在漂白步骤中不会测量荧光恢复, 并将导致对 if、mf 和t半的测量不正确。此外, 为了获得 if、mf 和t-半的正确值, 应观察获得后的 roi, 直到漂白剂 roi 中的荧光水平达到一个高原。例如, 在我们的 FRAP 实验中, 当我们在32.2分钟漂白剂的漂白剂中观察到 YFP-62 荧光时, 当我们在漂白剂 roi 中观察到 YFP-62 时, if、mf 和t半值之间没有差别15.1 分钟后漂白剂;因此, 我们的结论是, 恢复功能达到了高原在15.1 分后漂白剂12。在光漂白效率方面, 光漂白随光学变焦因子14的平方而增大。因此, 使用高光学变焦镜头有利于快速光漂白, 但在采集过程中可能会导致不良的光漂白;后者可以通过成像控制 ROI 来解释。重复的光漂白是要避免的, 因为它可以导致产生细胞毒性活性氧物种 (ROS)。然而, 基因编码荧光蛋白因暴露于高强度激光而产生的 ROS 的程度低于化学荧光 (如荧光抗体)15, 产生的 ros 更有可能发生反应在基因编码的荧光蛋白比与细胞4中的其他分子。除了产生细胞毒性 ROS 的概率增加外, 由于难以控制, 还应避免重复的光漂白。最后, 虽然使用低激光传输来获取所有非漂白剂图像, 但总会发生一些光漂白现象, 这一点必须得到控制。这方面可能的控制包括在获取 ROI 范围内监测控制 ROI 中的荧光, 在相邻的未漂白单元中获取控制图像, 以及对在光漂白实验, 但没有光漂白事件。
Disclosures
提交人没有利益冲突可以披露。
Acknowledgments
我们感谢芝加哥洛约拉大学的塞思·罗比亚博士对这份手稿的宝贵评论。国家卫生研究院向 Joanna c. Bakowska 提供1R01NS073967-01A1 的赠款, 支持了这项工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH30022.01 | High Glucose (4.5 g/L) |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35 mm |
| ImageJ software | National Institutes of Health | N.A. | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Corning | 30-002-Cl | 100× |
| Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil objective | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | 4407629904000000 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-1 | linear (MW 25,000) |
| RAW 264.7 murine macrophages | ATCC | TIB-71 | |
| Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | LSM 510 |
References
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).
- Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).
- Patterson, G., Day, R. N., Piston, D.
- Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2004).
- Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
- Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells. Methods. 37 (2), 154-164 (2005).
- Hildick, K. L., Gonzàlez-Gonzàlez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. Journal of Visualized Experiments. (60), e3747 (2012).
- Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. Photobleaching assays (FRAP & FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (52), e2696 (2011).
- Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons. Journal of Visualized Experiments. (50), e2568 (2011).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).
- Centonze, V., Pawley, J. Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen. Handbook of biological confocal microscopy. , Plenum Press. New York. 549-570 (1995).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).
