हम लाइव कोशिकाओं के साथ photoब्लीचिंग प्रयोगों के बाद प्रतिदीप्ति वसूली के लिए एक व्यापक और व्यावहारिक प्रोटोकॉल का वर्णन. हालांकि प्रोटोकॉल में पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन की गतिशीलता को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था-p62 आक्रामक की तरह प्रेरित संरचनाओं में टैग की गईं, यह माइक्रोस्कोपी प्रणालियों और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है ।
प्रकाशविरंजन (FRAP) के बाद प्रतिदीप्ति वसूली एक माइक्रोस्कोपी तकनीक है कि जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन गतिशीलता मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक ठेठ FRAP प्रयोग में, स्थिर राज्य प्रतिदीप्ति कम तीव्रता लेजर प्रकाश के साथ दोहराया इमेजिंग द्वारा मनाया जाता है । बाद में, फ्लोरोसेंट अणुओं तेजी से और अचल उच्च तीव्रता लेजर प्रकाश के लिए संक्षिप्त जोखिम के माध्यम से बिगड़ रहे हैं । प्रोटीन गतिशीलता के बारे में जानकारी प्रतिदीप्ति की वसूली की निगरानी के द्वारा प्राप्त की है । हम FRAP उपयोग के लिए आक्रामक में p62 की गतिशीलता का निर्धारण-प्रेरित संरचनाओं (एलिस) की तरह म्यूरिन मैक्रोफेज में लिपोपॉलिसैकेराइड (LPS) के साथ उत्तेजना के बाद । क्योंकि कई मौजूदा FRAP प्रोटोकॉल या तो अधूरा है या जटिल है, हमारा लक्ष्य के लिए एक व्यापक, व्यावहारिक प्रदान किया गया था, और सीधा कदम दर कदम के लिए live कोशिकाओं के साथ FRAP प्रयोगों के लिए प्रोटोकॉल । यहां, हम पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन-p62 (yfp-p62), एलपीएस के लिए कोशिकाओं को उजागर द्वारा ALIS के प्रेरण, और prebleach और postbleach frap छवियों और डेटा विश्लेषण इकट्ठा करने के लिए एक कदम दर कदम विधि के साथ कच्चे 264.7 मैक्रोफेज अभिकर्मक का वर्णन । अंत में, हम महत्वपूर्ण कारकों पर विचार के लिए जब एक FRAP प्रयोग आयोजित करने पर चर्चा ।
प्रकाशविरंजन (frap) के बाद प्रतिदीप्ति वसूली एक माइक्रोस्कोपी तकनीक है कि जीवित कोशिकाओं1,2में प्रोटीन गतिशीलता यों तो करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । frap की लोकप्रियता क्योंकि उच्च संकल्प, गति, और संवेदनशीलता के साथ संनाभि सूक्ष्मदर्शी स्कैनिंग लेजर की व्यापक वाणिज्यिक उपलब्धता की वृद्धि हुई है, और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक “इंद्रधनुष”, इस तरह के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) और पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP)3. आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन ब्याज के एक प्रोटीन के लिए संगलित कर रहे है के लिए ब्याज के प्रोटीन के subcellular स्थानीयकरण के लिए अनुमति देते हैं । एक ठेठ FRAP प्रयोग में, एक सेल के भीतर ब्याज (ROI) के अधिग्रहण क्षेत्र में स्थिर राज्य प्रतिदीप्ति कम तीव्रता लेजर प्रकाश के साथ कि रॉय की दोहराया इमेजिंग के माध्यम से मनाया जाता है । बाद में, फ्लोरोसेंट अणुओं तेजी से और अचल अधिग्रहण रॉय के एक पूर्वनिर्धारित सबसेट में बिगड़ा, इसके बाद ब्लीच रॉय के रूप में संदर्भित, उच्च तीव्रता लेजर प्रकाश के लिए संक्षिप्त जोखिम द्वारा । के रूप में नए अविरंजित प्रोटीन समय के साथ प्रक्षालित प्रोटीन की भरपाई, गति और ब्लीच रॉय में प्रतिदीप्ति वसूली की तीव्रता प्रोटीन गतिशीलता के बारे में जानकारी प्रदान करता है (चित्रा 1)4।
बैबैरिन बाध्यकारी प्रोटीन p62 की गतिशीलता का निर्धारण करने में हमारी रुचि (भी sequestosome के रूप में जाना जाता है-1) में आक्रामक की तरह प्रेरित संरचनाओं (एलिस) के साथ उत्तेजना के बाद मुरीन रॉ 264.7 मैक्रोफेज में लाइपोपोलिएसकेराइड (LPS) हमें FRAP की समीक्षा करने के लिए नेतृत्व किया साहित्य. दुर्भाग्य से, मौजूदा frap प्रोटोकॉल के कई अपूर्ण या inordinately5,6,7,8,9जटिल हैं । कुछ लेजर सेटिंग्स, बीम पथ विंयास, और छवि अधिग्रहण पैरामीटर5,6,7,8,9के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान नहीं करते । अंय डेटा विश्लेषण, जैसे ब्लीच रॉय बहाव6,9 या कैसे महत्वपूर्ण वसूली मापदंडों की गणना करने के लिए, मोबाइल अंश (एमएफ), स्थिर अंश सहित की समस्या को संबोधित करने के लिए के बारे में प्रमुख विवरण लोप (If), और पुनर्प्राप्ति का आधा समय (t1/2)5,7. इसके विपरीत, दूसरों के जटिल गणितीय फार्मूले पर बहुत अधिक जोर रखा एमएफ, मैंएफ, और टी1/25,6,8,9की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया । इस प्रकार, हमारे उद्देश्य के लिए एक व्यापक, व्यावहारिक प्रदान करना है, और सीधा कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल के लिए जीना कोशिकाओं के साथ FRAP प्रयोगों के लिए ।
हम लाइव कोशिकाओं के साथ FRAP प्रयोगों के लिए एक व्यापक, व्यावहारिक, और सरल कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इस के साथ साथ, प्रोटोकॉल के लिए yfp की गतिशीलता को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था p62 कच्चे 264.7 macrophages में ALIS में, लेकिन यह लेजर स्कैनिंग संनाभि माइक्रोस्कोप सिस्टम के कई और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि अब उपलब्ध है लागू किया जा सकता है । किसी भी माइक्रोस्कोपी प्रणाली के लिए, पायलट प्रयोगों अधिग्रहण, ब्लीच, और नियंत्रण रॉय आकार, photoब्लीचिंग के लिए लेजर तीव्रता, और prebleach और postbleach छवि अधिग्रहण सहित इष्टतम FRAP मापदंडों का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । यह इष्टतम FRAP मापदंडों प्रत्येक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन और सेल लाइन के लिए अलग करने की उंमीद करने के लिए उचित है ।
महत्वपूर्ण कारकों पर विचार करने के लिए जब एक FRAP प्रयोग आयोजित करने में शामिल है (क) उपयुक्त ब्लीच गहराई को प्राप्त करने, (ख) एक संक्षिप्त विरंजन कदम के उपयोग, (ग) पर्याप्त समय postbleach पूर्ण वसूली समारोह का निरीक्षण करने की अनुमति, (घ) photoब्लीचिंग दक्षता, (ई) दोहराया frap के साथ कोशिका आविषता, और (च) दोहराया इमेजिंग के कारण प्रतिदीप्ति हानि के लिए एक नियंत्रण का समावेश । हम अनुशंसा करते है कि ब्लीच गहराई, जो धारा 3.3.1 में प्रदान समीकरण के अनुसार गणना की जा सकती है, ≥ ९०13। जब ब्लीच गहराई 90 < है, postbleach प्रतिदीप्ति वसूली की डिग्री को कम करके आंका जाएगा, और मैंएफ, एमएफके मूल्यों, और टी1/2 गलत हो जाएगा । हालांकि अवधि और ब्लीच की तीव्रता-लेजर दालों inducing FRAP प्रयोगों के बीच भिंन हो सकते हैं, यह महत्वपूर्ण है कि photoब्लीचिंग कदम संक्षिप्त और काफी तेजी से प्रतिदीप्ति वसूली समारोह की तुलना में है । यदि ऐसा नहीं है, तो प्रतिदीप्ति वसूली की एक महत्वपूर्ण राशि विरंजन कदम के दौरान हो सकता है । एक लंबे ब्लीच समय के साथ, विरंजन कदम के दौरान प्रतिदीप्ति वसूली मापा नहीं होगा, और यह मैंएफ, एमएफ, औरटी1/2के गलत माप करने के लिए नेतृत्व करेंगे । इसके अलावा, मैंएफके लिए सही मूल्यों को प्राप्त करने के लिए,एमएफ, और टी1/2, अधिग्रहण रॉय postbleach मनाया जाना चाहिए जब तक ब्लीच रॉय में प्रतिदीप्ति स्तर एक पठार तक पहुंच गया है । उदाहरण के लिए, हमारे FRAP प्रयोगों में, वहां मैंएफ, एमएफके बीच कोई अंतर नहीं था, और टी1/2 मूल्यों जब हम yfp-३२.२ ंयूनतम POSTBLEACH के लिए ब्लीच रॉय में p62 प्रतिदीप्ति मनाया बनाम जब हम YFP मनाया-ब्लीच रॉय में p62 के लिए १५.१ min postbleach; इस प्रकार, हम निष्कर्ष निकाला है कि वसूली समारोह में १५.१ मिनट पर एक पठार पहुंचे12postbleach । photoब्लीचिंग दक्षता के संबंध में, ऑप्टिकल ज़ूम फैक्टर14के वर्ग के साथ photoब्लीचिंग बढ़ जाती है । इस प्रकार, उच्च ऑप्टिकल ज़ूम लेंस का उपयोग तेजी से photoब्लीचिंग के लिए अनुकूल है, लेकिन अधिग्रहण के दौरान अवांछनीय photoब्लीचिंग में परिणाम कर सकते हैं; बाद इमेजिंग एक नियंत्रण रॉय द्वारा के लिए जिंमेदार हो सकता है । दोहराया photoब्लीचिंग के रूप में यह साइटोटोक्सिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओज) की पीढ़ी के लिए नेतृत्व कर सकते है से बचना होगा । हालांकि, एक उच्च तीव्रता लेजर के लिए जोखिम के कारण ROS पीढ़ी की डिग्री रासायनिक फ्लोरोफोरस (जैसे, फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी) के लिए की तुलना में आनुवंशिक रूप से फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए कम है15, और उत्पन्न ros अधिक प्रतिक्रिया करने की संभावना है भीतर आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ सेल में अंय अणुओं4। साइटोटोक्सिक ROS पैदा करने की वृद्धि की संभावना के अलावा, दोहराया photoब्लीचिंग के रूप में इसे नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है बचा जा करने के लिए है । अंत में, हालांकि कम लेजर संचरण के लिए सभी गैर ब्लीच छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है, कुछ photoब्लीचिंग निरपवाद रूप से घटित होगा, जो नियंत्रित किया जाना चाहिए. इस के लिए संभव नियंत्रण अधिग्रहण रॉय के भीतर एक नियंत्रण रॉय में निगरानी प्रतिदीप्ति शामिल हैं, एक पड़ोसी अविरंजित सेल में नियंत्रण छवियों को प्राप्त करने, और में इस्तेमाल किया उन लोगों के लिए समान सेटिंग्स के साथ नियंत्रण प्रयोगों प्रदर्शन photoब्लीचिंग प्रयोगों लेकिन photoब्लीचिंग घटना के बिना.
The authors have nothing to disclose.
हम इस पांडुलिपि पर अपनी बहुमूल्य टिप्पणियों के लिए लोयोला विश्वविद्यालय शिकागो में डॉ सेठ रोबिया का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम के लिए NIH अनुदान 1R01NS073967-01A1 जोआना सी. Bakowska द्वारा समर्थित किया गया ।
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH30022.01 | High Glucose (4.5 g/L) |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35-mm |
Image J software | National Institutes of Health | N.A. | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391 | |
Nocodazole | Sigma | M1404 | |
Penicillin-streptomycin solution | Corning | 30-002-Cl | 100× |
Plan-Apochromat 63×/1.40 oil objective | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | 4407629904000000 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-1 | linear (MW 25,000) |
RAW 264.7 murine macrophages | ATCC | TIB-71 | |
Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | LSM 510 |