Vi beskriver ett omfattande och praktiska protokoll för fluorescens återhämtning efter fotoblekning experiment med levande celler. Även om protokollet användes för att mäta rörligheten för gula fluorescerande protein-taggade p62 i aggresome-inducerad strukturer, kan det tillämpas på en mängd mikroskopi system och fluorescerande proteiner.
Fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) är en mikroskopi teknik som kan användas för att kvantifiera protein rörlighet i levande celler. I en typisk FRAP experiment observeras steady state fluorescens av upprepade imaging med låg intensitet laserljus. Därefter är de fluorescerande molekylerna snabbt och oåterkalleligt nedsatt via kort exponering för högintensiva laserljuset. Information om protein rörlighet erhålls genom övervakning återvinning av fluorescens. Vi använde FRAP för att bestämma rörligheten för p62 i aggresome-liknande inducerad strukturer (ALIS) i murina makrofager efter stimulering med lipopolysackarid (LPS). Eftersom många befintliga FRAP protokoll är antingen ofullständiga eller komplexa, var vårt mål att tillhandahålla ett omfattande, praktisk och enkel steg för steg protokoll för FRAP experiment med levande celler. Här beskriver vi RAW264.7 makrofag transfection med gula fluorescerande protein-p62 (YFP-p62), induktion av ALIS genom att utsätta celler till LP-skivor, och en stegvis metod för att samla in prebleach och postbleach FRAP bilder och dataanalys. Slutligen diskuterar vi viktiga faktorer att beakta när man genomför en FRAP experiment.
Fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) är en mikroskopi teknik som kan användas för att kvantifiera protein dynamik i levande celler1,2. FRAP popularitet har ökat på grund av den utbredda kommersiella tillgången till laserscanning confocal Mikroskop med hög upplösning, hastighet och känslighet, och en ”rainbow” av genetiskt kodade fluorescerande proteiner, såsom grön fluorescerande protein (GFP) och gula fluorescerande protein (YFP)3. Genetiskt kodade fluorescerande proteiner är smält till ett protein av intresse att möjliggöra subcellulär lokalisering av proteinet av intresse. I en typisk FRAP experiment observeras steady state fluorescensen i ett förvärv region av intresse (ROI) i en cell via upprepade avbildning av att ROI med låg intensitet laserljus. Därefter är fluorescerande molekylerna snabbt och oåterkalleligt försämras i en fördefinierad undergrupp av förvärvet ROI, hädanefter blekmedel ROI, av kort exponering för hög intensitet laserljus. Som nya oblekt proteiner fylla på blekt proteiner över tid, ger hastighet och intensitet av fluorescens återhämtning i blekmedel ROI information om protein rörlighet (figur 1)4.
Vårt intresse för bestämning av ubiquitin bindande protein p62 (även känd som sequestosome-1) i aggresome-liknande inducerad strukturer (ALIS) i murina RAW264.7 makrofager rörlighet efter stimulering med lipopolysackarid (LPS) ledde oss att granska FRAP litteratur. Tyvärr, många av de befintliga FRAP-protokoll är ofullständiga eller orimligt komplexa5,6,7,8,9. Några ger inte detaljerad information om laser inställningar, beam sökvägen konfiguration och bild förvärv parametrar5,6,7,8,9. Andra utelämnas viktiga detaljer rörande analys av data, till exempel hur frågan om blekmedel ROI drift6,9 eller att beräkna viktiga återhämtning parametrar, inklusive mobila bråkdel (Mf), orörliga bråkdel (Jagf), och halvtid återhämtning (t½)5,7. Däremot andra placeras alltför stor vikt vid komplexa matematiska formler för att beräkna Mf, jagfoch t1/25,6,8,9. Vårt syfte är således att ge en omfattande, praktisk och enkel steg för steg-protokollet för FRAP experiment med levande celler.
Vi tillhandahåller ett omfattande, praktisk och enkel steg för steg protokoll för FRAP experiment med levande celler. Häri, protokollet användes för att mäta YFP-p62 i ALIS rörlighet i RAW264.7 makrofager, men det kan tillämpas på många av de laserscanning confocal Mikroskop system och genetiskt kodade fluorescerande proteiner som finns nu. För mikroskopi system är pilotförsök avgörande för att fastställa de optimala FRAP-parametrar, inklusive förvärv, blekmedel och kontroll ROI storlekar, laser intensitet för fotoblekning och prebleach och postbleach bild förvärv. Det är rimligt att förvänta sig de optimala FRAP parametrarna skiljer sig för varje genetiskt kodade fluorescerande protein och cell linje.
Viktiga faktorer att beakta när genomför en FRAP experiment inkluderar (a) att uppnå lämplig blekmedel djup, (b) användning av ett kort blekning steg, (c) tillåta tillräcklig tid postbleach att observera den fullständig återhämtning funktion, d fotoblekning effektivitet, (e). cytotoxicitet med upprepade FRAP, och (f) införandet av en kontroll för fluorescens förlust på grund av upprepade imaging. Vi rekommenderar att blekmedel djup, som kan beräknas enligt ekvation som anges i avsnitt 3.3.1, ≥9013. När blekmedel djup är < 90, graden av postbleach fluorescens återhämtning kommer att underskattas, och värdena av If, Mfoch t1/2 blir felaktiga. Även om varaktighet och intensitet av blekmedel-inducerande laser pulserna kan variera mellan FRAP experiment, är det viktigt att fotoblekning steg bli kort och väsentligen snabbare än fluorescens recovery funktion. Om det inte är, kunde då en betydande mängd fluorescens återhämtning uppstå under blekning steg. Med en lång blekmedel tid, fluorescens återhämtning under blekning steg inte skulle mätas, och det skulle leda till felaktiga mätningar av If, Mf, ocht1/2. Förutom att få korrekta värden för If, Mf, ocht1/2, förvärvet ROI bör observeras postbleach tills fluorescens i blekmedel ROI har nått en platå. Till exempel i vår FRAP experiment, fanns ingen skillnad mellan I-f, Mfoch t1/2 värden när vi observerade YFP-p62 fluorescens i blekmedel ROI för 32,2 min postbleach kontra när vi observerat YFP-p62 i blekmedel ROI för 15,1 min postbleach; Således fann vi att funktionen återställning nått en platå på 15,1 min postbleach12. När det gäller fotoblekning effektivitet ökar fotoblekning med kvadraten av optisk zoom faktor14. Således, användning av hög optisk zoom objektiv är gynnsam för snabb fotoblekning men kan resultera i oönskade fotoblekning under förvärvet; den senare kan förklaras av imaging en kontroll ROI. Upprepade fotoblekning ska undvikas eftersom det kan leda till generation av cytotoxiska reaktiva syreradikaler (ROS). Men graden av ROS generation på grund av exponering för en hög intensitet laser är lägre för genetiskt kodade fluorescerande proteiner än för kemiska fluorophores (t.ex. fluorescerande antikroppar)15och ROS genereras är mer benägna att reagera inom det genetiskt kodade fluorescerande proteinet än med andra molekyler i cell4. Förutom den ökade sannolikheten för att generera cytotoxiska ROS, är upprepade fotoblekning som skall undvikas eftersom det är svårt att styra. Slutligen, även om låga laser överföring används för att förvärva alla icke-bleka bilder, vissa fotoblekning alltid inträffar, som måste kontrolleras. Eventuella kontroller för detta inkluderar övervakning fluorescens i en kontroll ROI inom förvärvet ROI, få kontroll bilder i en närliggande oblekt cell och utför kontroll experiment med identiska inställningar för dem som används i den fotoblekning experiment men utan händelsen fotoblekning.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. Seth Robia på Loyola University Chicago för hans värdefulla kommentarer på detta manuskript. Detta arbete stöds av NIH grant 1R01NS073967-01A1 till Joanna C. Bakowska.
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH30022.01 | High Glucose (4.5 g/L) |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35-mm |
Image J software | National Institutes of Health | N.A. | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391 | |
Nocodazole | Sigma | M1404 | |
Penicillin-streptomycin solution | Corning | 30-002-Cl | 100× |
Plan-Apochromat 63×/1.40 oil objective | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | 4407629904000000 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-1 | linear (MW 25,000) |
RAW 264.7 murine macrophages | ATCC | TIB-71 | |
Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | LSM 510 |