Vi beskriver en omfattende og praktisk protokol til fluorescens opsving efter photobleaching eksperimenter med levende celler. Selv om protokollen blev brugt til at måle mobilitet af gul fluorescerende proteiner-tagged p62 i aggresome-lignende menneskeskabte strukturer, kan det anvendes til en lang række mikroskopi systemer og fluorescerende proteiner.
Fluorescens opsving efter photobleaching (FRAP) er en mikroskopi teknik, der kan bruges til at kvantificere protein mobilitet i levende celler. I en typisk FRAP eksperiment, er steady-state fluorescens observeret ved gentagen imaging med lav intensitet laserlys. Efterfølgende, er de fluorescerende molekyler hurtigt og uigenkaldeligt svækket via kort udsættelse for høj intensitet laserlys. Oplysninger om protein mobilitet er opnået ved at overvåge tilbagebetalingen af fluorescens. Vi brugte FRAP for at bestemme p62 i aggresome-lignende menneskeskabte strukturer (ALIS) i murine makrofager mobilitet efter stimulation med LPS (LPS). Fordi mange eksisterende FRAP protokoller er enten ufuldstændige eller komplekse, var vores mål at give en omfattende, praktisk og enkel trinvis protokol for FRAP eksperimenter med levende celler. Her beskriver vi RAW264.7 makrofag Transfektion med gul fluorescerende proteiner-p62 (YFP-p62), induktion af ALIS ved at udsætte celler til LP’ER og en trinvis metode til indsamling af prebleach og postbleach FRAP billeder og data analyse. Endelig vil diskutere vi vigtige faktorer at overveje, når de gennemfører en FRAP eksperiment.
Fluorescens opsving efter photobleaching (FRAP) er en mikroskopi teknik, der kan bruges til at kvantificere protein dynamics i levende celler,1,2. FRAP popularitet er vokset på grund af den kommercielle udbredelse af laser scanning Konfokal mikroskoper med høj opløsning, hastighed og følsomhed, og en “regnbue” af genetisk kodet fluorescerende proteiner, såsom grøn fluorescerende protein (normal god landbrugspraksis) og gul fluorescerende proteiner (YFP)3. Genetisk kodet fluorescerende proteiner er sammenvoksede til en protein af interesse at tillade subcellulært lokaliseringen af protein af interesse. I en typisk FRAP eksperiment, er steady-state fluorescens i en erhvervelse region af interesse (ROI) i en celle observeret via gentagne billeddannelse af denne ROI med lav intensitet laserlys. Efterfølgende, er de fluorescerende molekyler hurtigt og uigenkaldeligt svækket i en foruddefineret undersæt af erhvervelse ROI, benævnt blegemiddel ROI, ved kortvarig påvirkning for høj intensitet laserlys. Som ny ubleget proteiner genopbygge bleget proteiner over tid, indeholder hastighed og intensitet af fluorescens opsving i blegemiddel ROI oplysninger om protein mobilitet (figur 1)4.
Vores interesse i fastsættelsen af ubiquitin bindende protein p62 (også kendt som sequestosome-1) i aggresome-lignende menneskeskabte strukturer (ALIS) i murine RAW264.7 makrofager mobilitet efter stimulation med LPS (LPS) førte os til at revidere FRAP litteratur. Desværre er mange af de eksisterende FRAP protokoller er ufuldstændig eller overdrevent komplekse5,6,7,8,9. Nogle giver ikke detaljerede oplysninger om laser indstillinger, beam sti konfiguration og image erhvervelse parametre5,6,7,8,9. Andre udeladt vigtige detaljer om dataanalyse, såsom hvordan man kan løse problemet med blegemiddel ROI drift6,9 eller hvordan man beregner vigtigt opsving parametre, herunder mobile brøkdel (Mf), immobile fraktion (Jegf), og halv-time inddrivelse (t½)5,7. Omvendt, andre lagt for meget vægt på komplekse matematiske formler bruges til at beregne Mf, jegfog t1/25,6,8,9. Vores formål er således at levere en omfattende, praktisk og enkel trinvis protokol for FRAP eksperimenter med levende celler.
Vi leverer en omfattende, praktisk og enkel trinvis protokol for FRAP eksperimenter med levende celler. Heri, protokollen blev brugt til at måle YFP-p62 i ALIS mobilitet i RAW264.7 makrofager, men det kan anvendes til mange af laser scanning Konfokal mikroskop systemer og genetisk kodet fluorescerende proteiner, der er nu tilgængelige. For enhver mikroskopi system er pilotforsøg afgørende for fastlæggelse af de optimale FRAP parametre, herunder erhvervelse, blegemiddel og kontrol ROI størrelser, laser intensitet for photobleaching, og prebleach og postbleach image erhvervelse. Det er rimeligt at forvente de optimale FRAP parametre er forskellige for hver genetisk kodet fluorescerende proteiner og celle linje.
Vigtige faktorer at overveje, hvornår gennemfører en FRAP eksperiment omfatter (a) at opnå egnet blegemiddel dybde, (b) brugen af et kort blegning skridt, (c) giver tilstrækkelig tid postbleach at observere fuld recovery funktion, (d) photobleaching effektivitet, (e). cytotoksicitet med gentagne FRAP, og (f) optagelse af et kontrolelement til fluorescens tab på grund af gentagne billeddannelse. Vi anbefaler, at der blegemiddel dybde, som kan beregnes efter ligning i afsnit 3.3.1, ≥9013. Når blegemiddel dybde er < 90, graden af postbleach fluorescens recovery vil være undervurderet, og værdierne af jegf, Mfog t1/2 vil være forkert. Selv om varigheden og intensiteten af blegemiddel-inducerende laserpulser kan variere mellem FRAP eksperimenter, er det vigtigt, at photobleaching skridt er korte og betydeligt hurtigere end fluorescens opsving funktion. Hvis det ikke er, kunne så en betydelig mængde af fluorescens opsving opstå under trinnet blegning. Med en lang blegemiddel tid, fluorescens opsving under blegning trin ikke vil blive målt, og det ville føre til forkerte målinger af jegf, Mf, ogt1/2. Hertil kommer, at få de korrekte værdier for jegf, Mf, ogt1/2, erhvervelse ROI bør overholdes, postbleach indtil niveauet fluorescens i blegemiddel ROI har nået et plateau. For eksempel, i vores FRAP eksperimenter, der var ingen forskel mellem den jegf, Mfog t1/2 værdier når vi observeret YFP-p62 fluorescens i blegemiddel ROI for 32,2 min postbleach versus hvornår vi observeret YFP-p62 i blegemiddel ROI for 15.1 min postbleach; Derfor konkluderede vi, at funktionen opsving nået et plateau på 15,1 min postbleach12. Med hensyn til photobleaching effektivitet øger photobleaching med kvadratet på den optiske zoom faktor14. Således brug af høj optisk zoom-objektiver er gunstige for hurtig photobleaching men kan resultere i uønskede photobleaching under erhvervelse sidstnævnte kan tages højde for ved imaging en kontrol ROI. Gentagne photobleaching er at undgås, da det kan føre til generation af cytotoksiske reaktive ilt arter (ROS). Men graden af ROS generation på grund af eksponering for en høj intensitet laser er lavere for genetisk kodet fluorescerende proteiner end for kemisk fluorophores (fx fluorescerende antistoffer)15, og ROS genereret er mere tilbøjelige til at reagere inden for den genetisk kodet fluorescerende proteiner end med andre molekyler i celle4. Ud over øget sandsynligheden for generering af cytotoksiske ROS, er gentagne photobleaching skal undgås, da det er svært at kontrollere. Endelig, selv om lavt laser transmission bruges til at erhverve alle ikke-bleach billeder, vil nogle photobleaching altid forekomme, som skal kontrolleres. Mulige kontrol for dette omfatter overvågning fluorescens i et kontrolelement ROI inden for erhvervelse ROI, at opnå kontrol billeder i en nærliggende ubleget celle og udfører kontrol eksperimenter med identiske indstillinger for dem, der anvendes i den photobleaching eksperimenter, men uden photobleaching begivenheden.
The authors have nothing to disclose.
Vi takke Dr. Seth Robia på Loyola University Chicago for hans værdifulde kommentarer på dette håndskrift. Dette arbejde blev støttet af NIH grant 1R01NS073967-01A1 til Joanna C. Bakowska.
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH30022.01 | High Glucose (4.5 g/L) |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35-mm |
Image J software | National Institutes of Health | N.A. | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391 | |
Nocodazole | Sigma | M1404 | |
Penicillin-streptomycin solution | Corning | 30-002-Cl | 100× |
Plan-Apochromat 63×/1.40 oil objective | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | 4407629904000000 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-1 | linear (MW 25,000) |
RAW 264.7 murine macrophages | ATCC | TIB-71 | |
Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | LSM 510 |