Vi beskriver en omfattende og praktisk protokoll for fluorescens gjenoppretting etter photobleaching eksperimenter med live celler. Selv om protokollen ble brukt til å måle mobilitet av gule fluorescerende protein-merket p62 i aggresome-lignende menneskeskapte strukturer, kan den brukes til en rekke mikroskopi systemer og fluorescerende proteiner.
Fluorescens utvinning etter photobleaching (FRAP) er en mikroskopi teknikk som kan brukes til å kvantifisere protein mobilitet lever celler. I et typisk FRAP eksperiment, er stabil fluorescens observert av gjentatte bildebehandling med lav intensitet laserlys. Deretter er fluorescerende molekylene raskt og irreversibelt svekket via kort eksponering for høy intensitet laserlys. Informasjon om protein mobilitet oppnås ved å overvåke utvinning av fluorescens. Vi brukte FRAP for å bestemme mobilitet av p62 i aggresome-lignende menneskeskapte strukturer (ALIS) i murine makrofager etter stimulering med lipopolysakkarid (LPS). Fordi mange eksisterende FRAP protokoller er enten ufullstendig eller komplekse, var målet vårt å gi en omfattende, praktisk og enkel trinnvise protokoll for FRAP eksperimenter med levende celler. Her beskriver vi RAW264.7 macrophage transfection med gule fluorescerende protein-p62 (YFP-p62), induksjon av ALIS ved å utsette cellene LPS, og en trinnvis metode for innsamling av prebleach og postbleach FRAP bilder og data analyse. Til slutt, vi diskutere viktige faktorer å vurdere når du utfører en FRAP eksperiment.
Fluorescens gjenoppretting etter photobleaching (FRAP) er en mikroskopi teknikk som kan brukes til å kvantifisere protein dynamikk i levende celler1,2. Populariteten til FRAP har økt fordi kommersielle av laserskanning AC confocal mikroskop med høy oppløsning, hastighet og sensitivitet, og en “rainbow” av genetisk kodet fluorescerende proteiner, som grønn fluorescerende protein (GFP) og gule fluorescerende protein (YFP)3. Genetisk kodet fluorescerende proteiner er smeltet til et protein av interesse å tillate den subcellular lokaliseringen av protein av interesse. I et typisk FRAP eksperiment, er stabil fluorescens i et oppkjøp område av interesse (ROI) i en celle observert via gjentatte avbilding av at Avkastningen med lav intensitet laserlys. Deretter er fluorescerende molekylene raskt og irreversibelt nedsatt i et forhåndsdefinert delsett av oppkjøpet avkastning, heretter referert til som blekemiddel avkastning, med kort eksponering for høy intensitet laserlys. Som nye ubleket proteiner fylle bleket proteiner over tid, gir fart og intensitet på fluorescens utvinning i blekemiddel ROI informasjon om protein mobilitet (figur 1)4.
Vår interesse i å bestemme mobilitet av ubiquitin binding protein p62 (også kjent som sequestosome-1) i aggresome-lignende menneskeskapte strukturer (ALIS) i murine RAW264.7 makrofager etter stimulering med lipopolysakkarid (LPS) førte oss til å vurdere FRAP litteratur. Dessverre, mange av de eksisterende FRAP protokollene er ufullstendig eller inordinately komplekse5,6,7,8,9. Noen gir ikke detaljert informasjon om laser innstillinger, strålen banen konfigurasjon og bilde oppkjøpet parametere5,6,7,8,9. Andre utelatt detaljer om dataanalyse, som hvordan å løse problemet av blekemiddel ROI drift6,9 eller beregne viktige utvinning parametere, inkludert mobile brøkdel (Mf), ubevegelig brøk (Jegf), og halv-time recovery (t½)5,7. Derimot andre plassert mye vekt på komplekse matematiske formler brukes til å beregne Mf, jegfog t,1/2,5,,6,,8,,9. Dermed er vårt formål å gi en omfattende, praktisk og enkel trinnvise protokoll for FRAP eksperimenter med levende celler.
Vi gir en omfattende, praktisk og enkel trinnvise protokoll for FRAP eksperimenter med levende celler. Her, protokollen ble brukt til å måle mobilitet av YFP-p62 innenfor ALIS i RAW264.7 makrofager, men det kan brukes til mange av laser skanning AC confocal mikroskop systemer og genetisk kodet fluorescerende proteiner som er nå tilgjengelig. For alle mikroskopi system er piloten eksperimenter kritiske for å bestemme optimale FRAP parametere, inkludert kjøp, blekemiddel og kontroll ROI størrelser, laser intensitet for photobleaching, og prebleach og postbleach bilde. Det er rimelig å forvente parameterne for optimal FRAP forskjellig for hver genetisk kodet fluorescerende protein og cellen linje.
Viktigste faktorene når gjennomfører en FRAP eksperiment omfatter (a) oppnå egnet blekemiddel dybde, (b) bruk av et kort bleking skritt (c) tillater nok tid postbleach å observere full gjenoppretting funksjon, (d) photobleaching effektivitet, (e). cytotoksisitet med gjentatte FRAP, og (f) inkludering av en kontroll for fluorescens tap på grunn av gjentatte bildebehandling. Vi anbefaler at blekemiddel dybde, som kan beregnes i henhold til formelen i punkt 3.3.1, ≥9013. Når blekemiddel dybde er < 90, graden av postbleach fluorescens utvinning vil undervurderes, og verdiene av jegf, Mfog t1/2 vil være feil. Selv om varigheten og intensiteten av blekemiddel-inducing laser pulser kan variere mellom FRAP eksperimenter, er det viktig at photobleaching trinnet være kort og betydelig raskere enn funksjonen fluorescens utvinning. Hvis ikke kan en betydelig mengde fluorescens utvinning oppstå under bleking trinnet. Med en lang blekemiddel, fluorescens utvinning under bleking trinnet skulle ikke måles, og det vil føre til feil målinger av jegf, Mf, ogt1/2. I tillegg til få riktige verdier for jegf, Mf, ogt1/2, oppkjøpet ROI observeres postbleach til fluorescens nivået i blekemiddel Avkastningen har nådd et platå. For eksempel i våre FRAP eksperimenter, det var ingen forskjell mellom If, Mfog t1/2 verdier når vi observert YFP-p62 fluorescens i blekemiddel avkastning i 32.2 min postbleach versus når vi observert YFP-p62 i blekemiddel avkastning for 15,1 min postbleach; Derfor vi konkluderte med at utvinning funksjonen nådd et platå på 15,1 min postbleach12. Med hensyn til photobleaching effektivitet øker photobleaching med kvadratet av optisk zoom faktor14. Dermed bruk av høy optisk zoom objektiver er gunstig for rask photobleaching, men kan resultere i uønskede photobleaching under oppkjøpet; sistnevnte kan forklares av imaging en kontroll avkastning. Gjentatte photobleaching er unngås siden det kan føre til generering av cytotoksiske reaktive oksygen arter (ROS). Men graden av ROS generasjon skyldes eksponering for en høy intensitet laser er lavere for genetisk kodet fluorescerende proteiner enn kjemiske fluorophores (f.eks fluorescerende antistoffer)15og ROS generert er mer sannsynlig å reagere innen genetisk kodet fluorescerende protein enn med andre molekyler i cellen4. Økt sannsynlighet for å generere cytotoksiske ROS er gjentatt photobleaching unngås som det er vanskelig å kontrollere. Til slutt, selv om lavt laser overføring brukes til å hente alle ikke-blekemiddel bilder, noen photobleaching alltid skjer, som må kontrolleres. Mulig for dette omfatter overvåking fluorescens i en kontroll avkastning i oppkjøpet avkastning, få kontroll bilder i en nærliggende ubleket celle og utføre kontroll eksperimenter med identiske innstillinger for de som brukes i den photobleaching eksperimenter, men uten hendelsen photobleaching.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Seth Robia ved Loyola University Chicago for hans verdifulle kommentarer på dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av NIH grant 1R01NS073967-01A1 til Joanna C. Bakowska.
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH30022.01 | High Glucose (4.5 g/L) |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35-mm |
Image J software | National Institutes of Health | N.A. | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391 | |
Nocodazole | Sigma | M1404 | |
Penicillin-streptomycin solution | Corning | 30-002-Cl | 100× |
Plan-Apochromat 63×/1.40 oil objective | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | 4407629904000000 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-1 | linear (MW 25,000) |
RAW 264.7 murine macrophages | ATCC | TIB-71 | |
Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | LSM 510 |