We beschrijven een uitgebreide en praktische protocol voor fluorescentie herstel na photobleaching experimenten met cellen levende. Hoewel het protocol werd gebruikt voor het meten van de mobiliteit van gele fluorescerende eiwit-gelabeld p62 in aggresome-achtige geïnduceerde structuren, kan het worden toegepast op een verscheidenheid van microscopie systemen en fluorescente proteïnen.
Fluorescentie herstel na photobleaching (FRAP) is een microscopie techniek die kan worden gebruikt voor het kwantificeren van eiwit mobiliteit in levende cellen. In een typische FRAP-experiment, is door herhaalde beeldbewerking met laserlicht van lage-intensiteit steady-state fluorescentie waargenomen. Vervolgens zijn de fluorescerende moleculen snel en onherroepelijk aangetast via korte blootstelling aan hoge-intensiteit laserlicht. Informatie over eiwit mobiliteit wordt verkregen door het toezicht op het herstel van de fluorescentie. We FRAP gebruikt om te bepalen van de mobiliteit van p62 in aggresome-achtige geïnduceerde structuren (ALIS) in lymfkliertest macrofagen na stimulatie met lipopolysaccharide (LPS). Omdat vele bestaande FRAP protocollen onvolledig of complexe zijn, was ons doel om een complete, praktische en eenvoudige stapsgewijze protocol voor FRAP experimenten met levende cellen. Hier beschrijven we RAW264.7 macrofaag transfectie met gele fluorescerende eiwit-p62 (YFP-p62), inductie van ALIS door de cellen aan LPS en een stapsgewijze methode voor het verzamelen van prebleach en postbleach FRAP beelden en gegevens analyse bloot te leggen. Tot slot bespreken we belangrijke factoren te overwegen bij het uitvoeren van een FRAP-experiment.
Fluorescentie herstel na photobleaching (FRAP) een microscopie techniek die kan worden gebruikt is voor het kwantificeren van de dynamiek van de eiwitten in levende cellen1,2. De populariteit van FRAP gestegen vanwege het wijdverspreide commerciële beschikbaarheid van laser scannen confocal microscopen met hoge resolutie, snelheid en gevoeligheid, en een “regenboog” van genetisch gecodeerd fluorescerende eiwitten, zoals groen fluorescerend proteïne (GFP) en gele fluorescerende eiwit (YFP)3. Genetisch gecodeerde fluorescente proteïnen worden gesmolten tot een proteïne van belang te voorzien in de subcellular localisatie van het eiwit van belang. In een typische FRAP-experiment, wordt de steady-state-fluorescentie in een regio van de acquisitie van belang (ROI) binnen een cel waargenomen via herhaalde beeldvorming van dat ROI met lage intensiteit laserlicht. Vervolgens zijn de fluorescerende moleculen snel en onherroepelijk aangetast in een vooraf gedefinieerde subset van de overname ROI, hierna te noemen het bleekmiddel ROI, door korte blootstelling aan hoge-intensiteit laserlicht. Als nieuwe ongebleekte eiwitten vullen gebleekte eiwitten na verloop van tijd, bevat de snelheid en de intensiteit van de fluorescentie herstel in het bleekmiddel ROI informatie over eiwit mobiliteit (Figuur 1)4.
Ons belang bij het bepalen van de mobiliteit van de ubiquitin bindende eiwitten p62 (ook bekend als sequestosome-1) in aggresome-achtige geïnduceerde structuren (ALIS) in lymfkliertest RAW264.7 macrofagen na stimulatie met lipopolysaccharide (LPS) ons leidde te herzien de FRAP literatuur. Helaas, veel van de bestaande FRAP-protocollen zijn onvolledig of buitensporig complex5,6,,7,,8,9. Sommige bieden geen gedetailleerde informatie over de instellingen van de laser, lichtbundel pad configuratie en afbeelding overname parameters5,6,7,8,9. Andere belangrijke details met betrekking tot de analyse van de gegevens, zoals hoe de kwestie van bleekmiddel ROI drift6,9 of hoe Bereken belangrijk herstel parameters, met inbegrip van de mobiele breuk (Mf), onbeweeglijke gedeelte weggelaten (Ikf), en de helft van de tijd van herstel (t½)5,7. Omgekeerd, anderen teveel nadruk gelegd op complexe wiskundige formules voor de berekening van Mf, ikfen t1/25,6,8,9. Ons doel is dus om een complete, praktische en eenvoudige stapsgewijze protocol voor FRAP experimenten met levende cellen.
Wij bieden een complete, praktische en eenvoudige stapsgewijze protocol voor FRAP experimenten met levende cellen. Hierin, het protocol is gebruikt voor het meten van de mobiliteit van YFP-p62 in ALIS in macrofagen van de RAW264.7, maar het kan worden toegepast op veel van de laser confocal microscoop systemen scannen en genetisch gecodeerd fluorescente proteïnen die nu beschikbaar zijn. Voor elk systeem van microscopie zijn proefprojecten kritisch voor de bepaling van de optimale FRAP-parameters, met inbegrip van acquisitie, bleekmiddel, en controle ROI maten, laser intensiteit voor photobleaching en prebleach en postbleach Beeldacquisitie. Het is redelijk te verwachten dat de optimale FRAP-parameters kunnen verschillen voor elke genetisch gecodeerde fluorescent proteïne en cel regel.
Belangrijke factoren om te overwegen wanneer het uitvoeren van een experiment FRAP nemen (a) bereiken geschikt bleken diepte, (b) het gebruik van een korte bleken stap, (c) waardoor voldoende tijd postbleach te observeren de volledig herstel functie, (d) photobleaching efficiëntie, (e). cytotoxiciteit met herhaalde FRAP, en (f) de opneming van een besturingselement voor fluorescentie verlies als gevolg van herhaalde imaging. Het is raadzaam dat bleekmiddel diepte, die kan worden berekend op basis van de in punt 3.3.1 bedoelde vergelijking, ≥9013 worden. Wanneer bleekmiddel diepte is < 90, de mate van postbleach fluorescentie herstel zal worden onderschat, en de waarden van If, Mfen t-1/2 onjuist zal zijn. Hoewel de duur en de intensiteit van de laserpulsen bleekmiddel-inducerende tussen FRAP experimenten variëren kunnen, is het belangrijk dat de photobleaching stap kort en aanzienlijk sneller dan de fluorescentie recovery functie worden. Als het niet is, dan is een aanzienlijke hoeveelheid fluorescentie herstel kan optreden tijdens de bleken stap. Met een tijd van lange bleekmiddel, fluorescentie herstel tijdens de bleken stap niet zou worden gemeten, en het zou leiden tot onjuiste metingen van If, Mf, ent1/2. Bovendien, juist om waarden te verkrijgen voor If, Mf, ent1/2, de verwerving ROI nageleefd moet worden postbleach totdat het niveau van de fluorescentie in het bleekmiddel ROI heeft een plateau bereikt. Bijvoorbeeld, in onze FRAP-experimenten, er geen verschil was tussen de If, Mfen t-1/2 waarden wanneer we fluorescentie van de YFP-p62 in het bleekmiddel ROI voor 32.2 min postbleach waargenomen versus wanneer we YFP-p62 in het bleekmiddel ROI waargenomen voor 15.1 min postbleach; Dus wij geconcludeerd dat de recovery functie een plateau op 15.1 min postbleach12 bereikt. Met betrekking tot photobleaching efficiëntie toeneemt photobleaching met het kwadraat van de optische zoom factor14. Dus het gebruik van hoge optische zoomlenzen is gunstig voor de snelle photobleaching maar kan resulteren in ongewenste photobleaching tijdens overname; de laatste kan worden verklaard door een besturingselement ROI imaging. Herhaalde photobleaching dient te worden vermeden als het tot de generatie van cytotoxische reactieve zuurstof soorten (ROS leiden kan). Echter, de mate van ROS generatie als gevolg van blootstelling aan een hoge intensiteit laser is lager voor genetisch gecodeerde fluorescente proteïnen dan voor chemische fluorophores (bijvoorbeeld fluorescerende antilichamen)15, en het ROS gegenereerd zijn meer kans om te reageren binnen het genetisch gecodeerde fluorescerende eiwit dan met andere moleculen in de cel4. Naast de grotere waarschijnlijkheid van het genereren van cytotoxische ROS, dient herhaalde photobleaching te worden vermeden, want het is moeilijk te controleren. Tot slot, hoewel lage laser transmissie is bedoeld voor het verwerven van alle niet-bleekmiddel afbeeldingen, sommige photobleaching steevast plaatsvindt, die moet worden gecontroleerd. Mogelijke controles voor dit omvatten monitoring fluorescentie in een besturingselement ROI binnen de overname ROI, verkrijgen van controle beelden in een naburige ongebleekte cel en het uitvoeren van controle experimenten met de identieke instellingen voor die worden gebruikt de photobleaching experimenten, maar zonder de photobleaching gebeurtenis.
The authors have nothing to disclose.
We bedanken voor zijn waardevolle opmerkingen over dit manuscript Dr. Seth Robia Loyola Universiteit van Chicago. Dit werk werd gesteund door de NIH grant 1R01NS073967-01A1 naar Joanna C. Bakowska.
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH30022.01 | High Glucose (4.5 g/L) |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35-mm |
Image J software | National Institutes of Health | N.A. | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391 | |
Nocodazole | Sigma | M1404 | |
Penicillin-streptomycin solution | Corning | 30-002-Cl | 100× |
Plan-Apochromat 63×/1.40 oil objective | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | 4407629904000000 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-1 | linear (MW 25,000) |
RAW 264.7 murine macrophages | ATCC | TIB-71 | |
Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | LSM 510 |