Sonra hücreleri ile photobleaching deneyler canlı Floresans kurtarma için kapsamlı ve pratik iletişim kuralı açıklar. Her ne kadar sarı floresan protein etiketli p62 aggresome benzeri indüklenen yapılarda hareketliliğini ölçmek için kullanılan protokol, çeşitli mikroskobu sistemleri ve floresan proteinler için uygulanabilir.
Floresans kurtarma photobleaching (sıkı BAĞLAMAK) sonra canlı hücrelerdeki protein hareketlilik ölçmek için kullanılan bir mikroskobu tekniktir. Tipik bir sıkı BAĞLAMAK deneyde, kararlı durum Floresans yanında düşük yoğunluktaki lazer ışık ile tekrarlanan düşsel görülmektedir. Daha sonra floresan molekülleri kısa ışığa maruz kalma yüksek yoğunluktaki lazer ile hızla ve geri dönüşümsüz zarar görür. Protein hareketlilik hakkında bilgi Floresans kurtarılması izleyerek elde edilir. Sıkı BAĞLAMAK stimülasyon ile lipopolysaccharide (LPS) sonra p62 aggresome benzeri indüklenen yapıları (alış) fare makrofajlar içinde hareketliliğini belirlemek için kullanılır. Birçok varolan sıkı BAĞLAMAK iletişim kuralları eksik veya karmaşık olduğundan, hedefimiz bir kapsamlı, pratik ve basit adım adım protokol canlı hücreleri ile sıkı BAĞLAMAK deneyler için sağlamaktı. Burada, RAW264.7 makrofaj transfection sarı floresan protein-p62 (YFP-p62), LPS ve prebleach ve postbleach sıkı BAĞLAMAK görüntüleri ve veri analizi toplamak için bir adım-adım yöntemi hücrelere açığa tarafından alış indüksiyon ile açıklayın. Son olarak, biz bir sıkı BAĞLAMAK deney zaman dikkat edilmesi gereken önemli faktör tartışıyorlar.
Photobleaching (sıkı BAĞLAMAK) protein dinamiklerini canlı ölçmek için kullanılan bir mikroskobu tekniktir sonra Floresans kurtarma1,2hücreleri. Sıkı BAĞLAMAK popülaritesi yüksek kararlılık, hız ve hassasiyet ile confocal mikroskoplar tarama lazer yaygın ticari durumu nedeniyle artmış ve bir “Gökkuşağı” genetik olarak flüoresan proteinler, yeşil flüoresan gibi kodlanmış protein (GFP) ve sarı floresan protein (YFP)3. Genetik olarak kodlanmış floresan proteinler bir protein ilgi proteinin hücre altı yerelleştirme için izin ilgi erimiş. Tipik bir sıkı BAĞLAMAK deneyde, kararlı durum Floresans ilgi (ROI) bir hücre içinde bir alım bölgesinde ki ROI düşük yoğunluktaki lazer ışık ile tekrarlanan görüntüleme ile görülmektedir. Daha sonra floresan molekülleri hızla geri dönüşümsüz bundan sonra yatırım Getirisi, çamaşır suyu kısa yoğun lazer ışık maruz anılacaktır edinme yatırım Getirisi, önceden tanımlanmış alt kümesinde engelliler ve. Yeni Ryslampa protein ağartılmış proteinler zamanla doldurmak gibi çamaşır suyu ROI toparlanmanın floresan yoğunluğu ve hız protein hareketlilik (şekil 1)4hakkında bilgi sağlar.
Stimülasyon lipopolysaccharide (LPS) ile sıkı BAĞLAMAK gözden geçirmek için bize yol sonra yapılarda aggresome benzeri indüklenen (alış) fare RAW264.7 makrofajlar içinde Ubikuitin bağlayıcı protein p62 (olarak da bilinen sequestosome-1) hareketliliğini belirlemede bizim ilgi Edebiyat. Ne yazık ki, mevcut sıkı BAĞLAMAK iletişim kuralları eksik veya haddinden fazla karmaşık5,6,7,8,9çoğu. Bazı görüntü edinme parametreleri5,6,7,8,9, ışın yolu yapılandırma ve lazer ayarlar hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Diğerleri çamaşır suyu ROI drift6,9 sorunu gidermek veya mobil kesir (Mf), hareketsiz kesir dahil olmak üzere önemli kurtarma parametreleri hesaplamak gibi veri analizi ile ilgili önemli ayrıntılar atlandı (Benf) ve yarı-zamanlı kurtarma (t½)5,7. Bunun tersi olarak, diğerleri Mf, hesaplamak için kullanılan karmaşık matematiksel formüller üzerinde çok fazla vurgu benfve t1/25,6,8,9. Böylece, bizim amacımız bir kapsamlı, pratik ve basit adım adım protokol canlı hücreleri ile sıkı BAĞLAMAK deneyler için sağlamaktır.
Biz canlı hücreleri ile sıkı BAĞLAMAK deneyler için kapsamlı, pratik ve basit adım adım Protokolü sağlar. Burada, protokol YFP-p62 içinde alış hareketlilik RAW264.7 makrofajlar ölçmek için kullanılan, ancak birçok confocal mikroskop sistemler taranıyor lazer için uygulanabilir ve are şimdi elde edilebilir floresan proteinler genetik olarak kodlanmış. Herhangi bir mikroskobu sistemi için pilot deneyler edinme, çamaşır suyu ve denetim yatırım Getirisi boyutları, lazer yoğunluk photobleaching ve prebleach ve postbleach resim alma dahil olmak üzere en uygun sıkı BAĞLAMAK parametreleri belirlemek için kritik öneme sahiptir. Her genetik olarak kodlanmış floresan protein ve hücre satırı için farklı için en uygun sıkı BAĞLAMAK parametreleri beklemek uygun olur.
Ne zaman bir sıkı BAĞLAMAK deney dahil elde (a) uygun dikkat edilmesi gereken önemli faktör derinlik, (b) kısa bir beyazlatma adım tam kurtarma işlevi, (d) photobleaching verimlilik gözlemlemek için (c) izin yeterli zaman postbleach kullanımı bleach (e). sitotoksisite tekrarlanan sıkı BAĞLAMAK ve (f) floresan kaybı nedeniyle tekrarlanan görüntüleme için bir denetimi eklenmesi ile. 3.3.1 sağlanan denklem göre hesaplanabilir, çamaşır suyu derinlik ≥9013olmasını öneririz. Ne zaman çamaşır suyu derinlik < 90, postbleach floresan kurtarma ölçüde hafife almışım ve değerleri,f, Mfve t1/2 hatalı olur. Her ne kadar süre ve çamaşır suyu-inducing lazer bakliyat yoğunluğunu sıkı BAĞLAMAK deneyler arasında değişebilir, photobleaching adım kısa ve önemli ölçüde daha hızlı Floresans kurtarma işlevi daha önemlidir. Yoksa, Floresans kurtarma önemli miktarda beyazlatma adımı sırasında meydana gelebilir. Uzun çamaşır suyu vakit geçirmek, Floresans kurtarma beyazlatma adım sırasında değil ölçülen ve ben hatalı ölçümlerden yol açacakf, Mf, vet1/2. Doğru değerler ben içinf, Mf, elde etmek için ek olarak, vet1/2, yatırım Getirisi edinme gözlenen postbleach çamaşır suyu ROI Floresans kademede bir plato ulaşmıştır kadar. Örneğin, bizim sıkı BAĞLAMAK deneylerde vardı ben arasında bir fark yokturf, Mfve t1/2 değerlerini biz ne zaman biz YFP-p62 çamaşır suyu ROI gözlenen karşı postbleach YFP-p62 floresan 32.2 min için yatırım Getirisi çamaşır suyu içinde gözlenen için 15.1 min postbleach; Böylece, biz kurtarma işlevi 15.1 min postbleach12bir plato ulaşmış sonucuna vardı. Photobleaching verimliliği ile ilgili olarak, photobleaching optik zoom faktörü14Meydanı ile artar. Böylece, yüksek optik zoom lens kullanımı için hızlı photobleaching olumlu ama istenmeyen photobleaching Alım sırasında neden olabilir; ikinci için bir denetim yatırım Getirisi Imaging tarafından muhasebesi. Tekrarlanan photobleaching sitotoksik Reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi için yol açabilir gibi var olmak kaçmak etmektir. Ancak, ROS üretimi yüksek yoğunluktaki lazer maruz derecesi için genetik olarak kodlanmış floresan proteinlerin kimyasal fluorophores (örneğin, floresan antikor)15düşüktür ve oluşturulan ROS tepki olasılığı daha yüksektir genetik olarak kodlanmış floresan protein içinde diğer moleküller hücre4ile. Sitotoksik ROS üretme artan ek olarak, tekrarlanan photobleaching kontrol etmek zor olduğu gibi kaçınılması gereken olasılıktır. Ne kadar düşük lazer iletim tüm çamaşır suyu olmayan görüntüleri elde etmek için kullanılır, son olarak, bazı photobleaching her zaman, hangi kontrol altına alınmalı ortaya çıkar. Bunun için mümkün denetimler içerir Floresans edinme yatırım Getirisi bir denetiminde ROI izleme, komşu Ryslampa hücrede kontrol görüntüleri elde etme ve bu kullanılan kontrol deneyleri aynı ayarları ile gerçekleştirme photobleaching deneyler ama photobleaching olay olmadan.
The authors have nothing to disclose.
Biz Dr Seth Robia Chicago Loyola Üniversitesi bu el yazması onun değerli yorumlar için teşekkür ederim. Bu eser NIH grant 1R01NS073967-01A1 için Joanna C. Bakowska tarafından desteklenmiştir.
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH30022.01 | High Glucose (4.5 g/L) |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35-mm |
Image J software | National Institutes of Health | N.A. | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391 | |
Nocodazole | Sigma | M1404 | |
Penicillin-streptomycin solution | Corning | 30-002-Cl | 100× |
Plan-Apochromat 63×/1.40 oil objective | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | 4407629904000000 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-1 | linear (MW 25,000) |
RAW 264.7 murine macrophages | ATCC | TIB-71 | |
Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | LSM 510 |