Les auteurs décrivent un protocole complet et pratique pour la récupération de fluorescence après que Photoblanchiment expérimente vivre les cellules. Bien que le protocole a été utilisé pour mesurer la mobilité des jaune fluorescent protein-tag p62 en structures induites en aggresome, il peut être appliqué à une variété de systèmes de microscopie et de protéines fluorescentes.
Récupération de fluorescence après Photoblanchiment (FRAP) est une technique de microscopie qui peut être utilisée pour quantifier la mobilité des protéines dans des cellules vivantes. Dans une expérience typique de FRAP, fluorescence en état stationnaire est observé par imagerie répété avec la lumière laser de faible intensité. Par la suite, les molécules fluorescentes sont rapidement et irréversiblement altérées par une brève exposition à la lumière de laser de haute intensité. Informations sur la mobilité des protéines sont obtenues en contrôlant la récupération de la fluorescence. FRAP nous permettant de déterminer la mobilité des p62 dans aggresome-comme des structures induites (ALIS) dans les macrophages murins après stimulation avec le lipopolysaccharide (LPS). Parce que de nombreux protocoles existants de FRAP sont incomplets ou complexes, notre objectif était de fournir un protocole étape par étape complète, pratique et simple pour des expériences de PAF avec des cellules vivantes. Nous décrivons ici la transfection de macrophage RAW264.7 avec la protéine fluorescente jaune-p62 (YFP-p62), induction d’ALIS en exposant les cellules à LPS et une méthode étape par étape pour rassembler les prebleach et postbleach FRAP, analyse des images et des données. Finalement, nous discutons des facteurs importants à considérer lorsqu’il procède à une expérimentation de PAF.
Récupération de fluorescence après que Photoblanchiment (FRAP) est une technique de microscopie qui peut être utilisée pour quantifier la dynamique des protéines en direct des cellules1,2. La popularité du PAF a augmenté en raison de la disponibilité commerciale de microscopes confocaux à haute résolution, vitesse et sensibilité à balayage laser, et un « arc-en-ciel » de codé génétiquement des protéines fluorescentes, comme le vert fluorescent protéine (GFP) et protéine fluorescente jaune (YFP)3. Génétiquement codés protéines fluorescentes sont fondues à une protéine d’intérêt afin de permettre la localisation intracellulaire de la protéine d’intérêt. Dans une expérience typique du PAF, la fluorescence en état stationnaire dans une région d’acquisition d’intérêt (ROI) dans une cellule est observée par imagerie répété de ce ROI avec lumière laser de faible intensité. Par la suite, les molécules fluorescentes sont rapidement et irréversiblement altérées chez un sous-ensemble prédéfini de l’acquisition de retour sur investissement, ci-après dénommé l’eau de Javel ROI, par une brève exposition à la lumière de laser de haute intensité. Comme les nouvelles protéines écrus reconstituer les protéines blanchies au fil du temps, la vitesse et l’intensité de la reprise de fluorescence de l’eau de Javel ROI fournit des informations sur la protéine mobilité (Figure 1)4.
Notre intérêt dans la détermination de la mobilité de l’ubiquitine liaison protéine p62 (également connu sous le nom de sequestosome-1) en structures induites semblables à aggresome (ALIS) dans les macrophages murins RAW264.7 après que stimulation avec le lipopolysaccharide (LPS) nous a conduit à revoir du PAF littérature. Malheureusement, bon nombre des protocoles existants FRAP sont incomplètes ou excessivement complexe5,6,7,8,9. Certains ne fournissent pas d’informations détaillées sur les paramètres laser et configuration de chemins faisceau image acquisition paramètres5,6,7,8,9. D’autres omis des détails clés au sujet de l’analyse des données, telles que d’aborder la question de l’eau de Javel ROI dérive6,9 ou comment calculer les paramètres de récupération importante, y compris la fraction mobile (Mf), la fraction immobile (J’aif) et de temps de récupération (t½)5,7. À l’inverse, d’autres mettait trop l’accent sur des formules mathématiques complexes permettant de calculer Mf, j’aifet t1/25,6,8,9. Ainsi, notre but est de fournir un protocole étape par étape complète, pratique et simple pour des expériences de PAF avec des cellules vivantes.
Nous fournissons un protocole étape par étape complète, pratique et simple pour des expériences de PAF avec des cellules vivantes. Dans les présentes, le protocole a été utilisé pour mesurer la mobilité des YFP-p62 dans ALIS RAW264.7 macrophages, mais elle peut être appliquée à de nombreux systèmes de microscope confocal à balayage laser et codé génétiquement des protéines fluorescentes qui sont maintenant disponibles. Pour n’importe quel système de microscopie, les expériences pilotes sont essentiels pour déterminer les paramètres optimaux de FRAP, incluant l’acquisition, eau de Javel et de tailles de contrôle ROI, intensité du laser pour le Photoblanchiment et acquisition d’images prebleach et postbleach. Il est raisonnable de s’attendre les paramètres optimaux de FRAP diffèrent pour chaque ligne de protéines et cellules fluorescente codé génétiquement.
Facteurs importants à considérer quand mène une expérience FRAP incluent (a) réalisation convenable de Javel profondeur, (b) l’utilisation d’une brève étape de blanchiment, (c) ce qui permet aux postbleach de temps suffisant pour observer la fonction de restauration complète, l’efficacité de Photoblanchiment (d), (e). cytotoxicité avec répétitions FRAP et (f) l’inclusion d’un contrôle pour la perte de fluorescence en raison de l’imagerie répété. Nous recommandons que la profondeur de l’eau de Javel, qui peut être calculé selon l’équation fournie dans la section 3.3.1, soit ≥ 9013. Quelle est la profondeur de l’eau de Javel < 90, le degré de fluorescence postbleach récupération sera sous-estimée et les valeurs d’IfMfet t1/2 sera incorrectes. Bien que la durée et l’intensité des impulsions laser induisant la javel peuvent varier entre les expériences du PAF, il est important que l’étape de Photoblanchiment être bref et sensiblement plus rapide que la fonction de récupération de fluorescence. Si ce n’est pas le cas, une quantité importante de récupération de la fluorescence peut se produire pendant l’étape de blanchiment. Avec un temps de l’eau de Javel long, récupération de fluorescence au cours de l’étape de blanchiment ne serait pas être mesurée, et cela donnerait lieu à des mesures erronées d’If, M,f, ett1/2. En outre, pour obtenir des valeurs correctes pour If, M,f, ett1/2, l’acquisition de retour sur investissement doit être observée postbleach jusqu’à ce que le degré de fluorescence dans l’eau de Javel ROI atteint un plateau. Par exemple, dans nos expériences FRAP, il n’y avait aucun différence entre l’If, M,fet t1/2 valeurs lorsque nous avons observé YFP-p62 fluorescence dans le ROI de l’eau de Javel pour 32,2 min postbleach contre quand nous avons observé YFP-p62 dans l’eau de Javel ROI pour 15,1 min postbleach ; ainsi, nous avons conclu que la fonction de récupération atteint un plateau à 15,1 min postbleach12. En ce qui concerne l’efficacité de Photoblanchiment, Photoblanchiment augmente avec le carré du facteur de zoom optique14. Ainsi, l’utilisation de zooms optiques hautes est favorable pour le Photoblanchiment rapid mais peut entraîner le Photoblanchiment indésirable lors de l’acquisition ; ce dernier peut s’expliquer par un contrôle ROI d’imagerie. Photoblanchiment répété doit être évitée car elle peut conduire à la génération de cytotoxiques reactive oxygen species (ROS). Toutefois, le degré de génération ROS dus à l’exposition d’un laser à haute intensité est plus faible pour des protéines fluorescentes génétiquement codés que pour fluorophores chimiques (p. ex. anticorps fluorescents)15et les ROS générées sont plus susceptibles de réagir au sein de la protéine fluorescente génétiquement encodée qu’avec d’autres molécules dans la cellule4. En plus de la probabilité accrue de générer ROS cytotoxique, répété Photoblanchiment est à éviter car il est difficile à contrôler. Enfin, bien que la transmission laser faible sert à acquérir toutes les images non-eau de Javel, certains Photoblanchiment invariablement se produira, qui doit être contrôlée. Contrôles possibles pour cela incluent la surveillance fluorescence dans un contrôle de retour sur investissement dans l’acquisition de ROI, obtenir des images de contrôle dans une cellule voisine écrue et effectuent des expériences de contrôle avec les paramètres identiques à ceux utilisés dans le expériences de Photoblanchiment mais sans l’événement Photoblanchiment.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le Dr Seth Robia à Loyola University Chicago pour ses précieux commentaires sur ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par les NIH grant 1R01NS073967-01 a 1 à Joanna C. Bakowska.
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH30022.01 | High Glucose (4.5 g/L) |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35-mm |
Image J software | National Institutes of Health | N.A. | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391 | |
Nocodazole | Sigma | M1404 | |
Penicillin-streptomycin solution | Corning | 30-002-Cl | 100× |
Plan-Apochromat 63×/1.40 oil objective | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | 4407629904000000 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-1 | linear (MW 25,000) |
RAW 264.7 murine macrophages | ATCC | TIB-71 | |
Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | LSM 510 |