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Biology

Recupero di fluorescenza dopo Photobleaching di giallo fluorescente proteine Tagged p62 in Aggresome-come le strutture indotta

Published: March 26, 2019 doi: 10.3791/59288

Summary

Descriviamo un protocollo completo e pratico per il recupero di fluorescenza dopo photobleaching esperimenti con cellule vivono. Anche se il protocollo è stato utilizzato per misurare la mobilità di giallo fluorescente proteina-etichetta p62 in aggresome-come le strutture indotte, può essere applicato ad una varietà di sistemi di microscopia e proteine fluorescenti.

Abstract

Recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) è una tecnica di microscopia che può essere utilizzata per quantificare la mobilità della proteina in cellule vive. In un tipico esperimento FRAP, fluorescenza allo steady-state è osservato da formazione immagine ripetuta con luce laser a bassa intensità. Successivamente, le molecole fluorescenti sono rapidamente e irreversibilmente alterate tramite una breve esposizione alla luce laser ad alta intensità. Informazioni sulla mobilità della proteina sono ottenuti monitorando il recupero della fluorescenza. Abbiamo usato FRAP per determinare la mobilità di p62 in aggresome-come le strutture indotte (ALIS) in macrofagi murini dopo stimolazione con il lipopolysaccharide (LPS). Poiché molti protocolli FRAP esistenti sono incompleti o complesso, il nostro obiettivo era di fornire un protocollo completo, pratico e semplice passo-passo per FRAP esperimenti con cellule vive. Qui, descriviamo la transfezione dei macrofagi RAW 264.7 con giallo fluorescente proteina-p62 (YFP-p62), induzione di ALIS esponendo le cellule a LPS e un metodo passo passo per la raccolta di prebleach e postbleach FRAP immagini e analisi dei dati. Infine, si discute di fattori importanti da considerare quando un esperimento di FRAP.

Introduction

Recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) è una tecnica di microscopia che può essere utilizzata per quantificare la dinamica di proteine in vivo le cellule1,2. La popolarità di FRAP è aumentata a causa della diffusa disponibilità commerciale di microscopi confocali con alta risoluzione, la velocità e la sensibilità di scansione laser, e un "arcobaleno" di geneticamente codificati proteine fluorescenti, come il verde fluorescente Protein (GFP) e la proteina fluorescente gialla (YFP)3. Le proteine fluorescenti geneticamente codificate sono fusi ad una proteina di interesse per consentire la localizzazione sottocellulare della proteina di interesse. In un tipico esperimento FRAP, la fluorescenza allo steady-state in una regione di acquisizione di interesse (ROI) all'interno di una cella è osservata tramite ripetute immagini di quel ROI con luce laser a bassa intensità. Successivamente, le molecole fluorescenti sono rapidamente e irreversibilmente alterate in un sottoinsieme predefinito dell'acquisizione ROI, appresso denominata la candeggina ROI, da una breve esposizione alla luce laser ad alta intensità. Come nuove proteine non candeggiati ricostituire sbiancati proteine nel corso del tempo, la velocità e l'intensità del recupero di fluorescenza nella candeggina ROI fornisce informazioni sulla proteina mobilità (Figura 1)4.

Il nostro interesse nella determinazione della mobilità dell'ubiquitina associazione proteina p62 (noto anche come sequestosome-1) in aggresome-come le strutture indotte (ALIS) in macrofagi murini RAW 264.7 dopo stimolazione con il lipopolysaccharide (LPS) ci ha portato a rivedere la FRAP letteratura. Purtroppo, molti dei protocolli FRAP esistenti sono incompleti o eccessivamente complesso5,6,7,8,9. Alcuni non forniscono informazioni dettagliate sulle impostazioni di laser, configurazione di percorsi di larghezza e immagine acquisizione parametri5,6,7,8,9. Altri omesso dettagli chiave relative all'analisi di dati, ad esempio come affrontare il problema di candeggina ROI drift6,9 o come calcolare i parametri di recupero importanti, tra cui il mobile frazione (Mf), frazione di immobile (Hof) e metà-tempo di recupero (t½)5,7. Al contrario, gli altri messo troppa enfasi su complesse formule matematiche utilizzate per calcolare Mf, hofe t1/25,6,8,9. Così, il nostro scopo è di fornire un protocollo completo, pratico e semplice passo-passo per FRAP esperimenti con cellule vive.

Protocol

1. RAW 264.7 del macrofago transfezione

  1. 100.000 cellule RAW 264.7 (Tabella materiali) della coltura in terreno di coltura completa (di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM)) contenente glucosio di 4,5 g/L (Tabella materiali) completato con 10% siero bovino fetale (Tabella materiali ) e penicillina/streptomicina (Tabella materiali) sul non trattata piatti 35 mm con fondo di vetro (Tabella materiali) e mettere le stoviglie in incubatore a 37 °C/5% CO2 . Il giorno seguente, transfect le celle utilizzando 1 mg/mL polyethylenimine (PEI) (Tabella materiali).
  2. Mix 1,5 μg di YFP-p62 con 8 μL di PEI in 166 μL di DMEM privo di siero (base medium senza siero bovino fetale e penicillina/streptomicina).
  3. Lasciate la miscela complessa di transfezione riposare a temperatura ambiente per 15 min prima di aggiungere la miscela in ogni piatto.
  4. Aggiungere delicatamente i complessi sul supporto esistente con le cellule e la piastra di roccia.
  5. Posizionare la piastra in un incubatore 37 ° C 5% CO2 durante la notte.
  6. La mattina seguente, aspirare il mezzo fuori la piastra, poi sciacquare una volta con terreno completo. Aggiungere 2 mL di terreno completo alla piastra e permettono alle cellule di recuperare fino al giorno successivo.

2. induzione di ALIS con il Lipopolysaccharide (LPS)

  1. Il giorno successivo, aspirare il mezzo dalle piastre, quindi aggiungere 1 mL di completa medio da 10 ng/mL LPS (Tabella materiali). Lasciate le piastre Incubare per 5 h in incubatore a 37 °C/5% CO2 .
  2. Dopo il trattamento di LPS, aspirare il mezzo, quindi aggiungere 1 mL di tampone di Tyrode freddo, sterile contenente 145 mM NaCl, 5 mM KCl, glucosio di 10 mM, 1,5 mM CaCl2, 1,0 mM MgCl2e 10 mM HEPES (pH 7.4) per risciacquare la piastra.
  3. Aspirare il buffer, quindi aggiungere 1 mL di tampone di Tyrode freddo, sterile, completati con nocodazole di 10 μg/mL (Tabella materiali). Lasciate le piastre Incubare a 4 ° C per 15-20 min prima di FRAP imaging e l'analisi.
    Nota: L'utilizzo di buffer di Tyrode contenente HEPES come il buffering composto consente di imaging per essere eseguita a temperatura ambiente. Nocodazole è stato utilizzato per diminuire il movimento di ALIS di microtubuli. Terreno di coltura contiene bicarbonato come buffer composto che richiedono di CO2 al buffer. In caso contrario, il bicarbonato contenute nel pH medio cambiamenti in assenza di CO2.

3. messa a punto del microscopio confocale e selezionando la regione di interesse

  1. Selezione e configurazione di percorso del fascio laser
    1. Utilizzare qualsiasi microscopio confocale adatto (Tabella materiali) dotato di software AIM o ZEN (Tabella materiali) o qualsiasi software di imaging adatto.
    2. Selezionare la linea 514 nm del laser dell'Argon/2, come YFP ha eccitazione di picco a 512 nm e picco di emissione a 527 nm. Fare clic sul pulsante Acquisisci , quindi fare clic sul pulsante Laser . Nella finestra di controllo Laser, fare clic Argon/2 458, 477, 488, 514 nm, fare clic sul pulsante di Standby . Dopo aver aspettato ~ 3 min del laser per riscaldarsi, fare clic sul pulsante (Figura 2A).
    3. Impostare la potenza del laser della linea di laser di Argon/2 nm 514 al 100% (8,6). Fare clic sul pulsante Acquisisci , quindi fare clic sul pulsante Laser . Nella finestra di controllo Laser, digitare 100 nel campo Output [%] , quindi premere il tasto Enter (Figura 2A).
    4. Impostare la trasmissione della linea di laser di Argon/2 nm 514 al 5%. Fare clic sul pulsante Acquisisci , quindi sul pulsante canali . Nella finestra di Controllo di eseguire la scansione , fare clic sul pulsante canali , quindi fare clic sulla casella bianca quadrata a sinistra del testo 514 nm nella colonna linea attiva per attivare la linea di laser 514 nm. Immettere 5 nel campo di trasmissione [%] per la linea di laser 514 nm (Figura 2D).
    5. Impostato sulla posizione di HFT 458/514/561 primario dicroico beam splitter (Haupt Farb Teiler (HFT)) tale che queste bande sono deviate al provino per l'eccitazione. Fare clic sul pulsante Acquisisci , quindi il pulsante di configurazione . Nella finestra di Controllo di configurazione , fare clic sul pulsante Modalità canale , quindi il pulsante Single Track . Fare clic sul pulsante HFT , quindi selezionare HFT 458/514/561 dal menu a discesa (Figura 2B).
    6. Impostare il primo divisore di fascio dicroico secondario (Neben Farb Teiler 1 (NFT1)) la posizione dello specchio , che defletterà 100% della luce a seconda secondaria dicroico beam splitter (Neben Farb Teiler 2 (NFT2)). Fare clic sul pulsante Acquisisci , quindi il pulsante di configurazione . Nella finestra di Controllo di configurazione , fare clic sul pulsante Modalità canale , quindi il pulsante Single Track . Fare clic sul pulsante NFT1 , quindi selezionare specchio dal menu a discesa (Figura 2B).
    7. Impostato secondo secondario dicroico beam splitter (NFT2) sulla posizione di NFT 515 per garantire quel lunghezze d'onda < 515 nm si rifletteranno e lunghezze d'onda > 515 nm saranno trasmessi. Fare clic sul pulsante Acquisisci , quindi il pulsante di configurazione . Nella finestra di Controllo di configurazione , fare clic sul pulsante Modalità canale , quindi il pulsante Single Track . Fare clic sul pulsante NFT2 , quindi selezionare NFT 515 dal menu a discesa (Figura 2B).
    8. Impostare il filtro di emissione di passaggio lungo (LP) (EF) LP 530, modo che lunghezze d'onda > 530 nm sarà trasmesso al tubo fotomoltiplicatore (PMT, rivelatore). Fare clic sul pulsante Acquisisci , quindi il pulsante di configurazione . Nella finestra di Controllo di configurazione , fare clic sul pulsante Modalità canale , quindi il pulsante Single Track . Fare clic sul pulsante filtro di emissione , quindi selezionare LP 530 dal menu a discesa (Figura 2B).
    9. Selezionare il canale 3. Fare clic sul pulsante Acquisisci , quindi il pulsante di configurazione . Nella finestra di Controllo di configurazione , fare clic sul pulsante Modalità canale , quindi il pulsante Single Track . Fare clic sulla casella bianca quadrata a sinistra del pulsante Ch3 .
  2. Set-up acquisizione immagine
    1. Selezionare il piano-Apochromat 63 x / 1,40 olio obiettivo (Tabella materiali). Mostra il campione attraverso l'oculare del microscopio e posizionare l'ALIS al centro del campo visivo. Fare clic sul pulsante Acquisisci , quindi sul pulsante Micro . Nella finestra di Controllo del microscopio , fare clic su obiettivo, quindi selezionare il piano-Apochromat 63X / 1,40 olio obiettivo dal menu a discesa.
    2. Impostare le dimensioni della cornice a 512 x 512 pixel, la velocità di scansione a 8e la profondità dei dati a 12 bit. Fare clic sul pulsante Acquisisci , quindi il tasto Scan . Nella finestra di Controllo di eseguire la scansione , fare clic sul pulsante modalità pulsante Frame , quindi fare clic sul pulsante di 512 . Invio 8 nel campo di Velocità di scansione , premere invio, quindi fare clic sul pulsante 12bit (Figura 2C).
    3. Impostata la media di scansione 1 e lo zoom ottico a 3. Fare clic sul pulsante Acquisisci , quindi fare clic sul pulsante scansione . Nella finestra di Controllo di eseguire la scansione , fare clic sul pulsante freccia giù del campo numero medio di scansione, quindi selezionare 1 dal menu a discesa. Immettere 3 nel campo di zoom ottico, quindi premere invio (Figura 2C).
    4. Impostare il foro stenopeico 1,95 unità arioso e rilevatore di guadagno a 582 (appena di sotto della saturazione). Fare clic sul pulsante Acquisisci , quindi il tasto Scan . Nella finestra di Controllo di eseguire la scansione , fare clic sul pulsante canali , immettere 196 nel campo Pinhole, quindi premere invio. Inserisci 582 nel campo rivelatore di guadagno, quindi premere invio (Figura 2D).
    5. Verificare che la linea di laser di Argon/2 nm 514 è impostata al 100% di potenza (8,6). Fare clic sul pulsante Acquisisci , quindi il pulsante Laser . Nel menu di Controllo Laser , il valore nel campo Output [%] dovrebbe essere 100 (Figura 2A).
    6. Assicurarsi che la linea di laser di Argon/2 nm 514 è impostato su 5% trasmissione. Fare clic sul pulsante Acquisisci , quindi il tasto Scan . Nella finestra di Controllo di eseguire la scansione , il valore nel campo di trasmissione [%] per la linea di laser 514 nm dovrebbe essere 5 (Figura 2D).
    7. Creare un ROI di forma quadrata (acquisizione ROI) che ha le dimensioni 150x150 pixel (194.6 µm2). Fare clic sul pulsante Acquisisci , quindi sul pulsante Edit ROI . Nel menu Edit ROI , fate clic sull'icona rettangolo, quindi fare clic e trascinare nella finestra immagine per creare un quadrato che ha le dimensioni 150x150 pixel (194.6 µm2) (Figura 1A).
      Nota: L'acquisizione ROI include (a) un ALIS di interesse, (b) un'area di fluorescenza che non è un ALIS (controllo ROI) ed è almeno 20 x 20 pixel (3,3 µm2) e (c) un'area di poco a nessuna fluorescenza (sfondo ROI) che è almeno 20 x 20 pixel (3,3 µm 2) (Figura 1A). È importante includere un controllo ROI nell'acquisizione ROI affinché il photobleaching che possono verificarsi con formazione immagine ripetuta può essere controllato. L'acquisizione ROI definito qui sarà l'unica area che verrà analizzato. Ripetute laser scansione all'interno di un'acquisizione ROI solo limiterà photobleaching al ROI anziché, ad esempio, photobleaching l'intera cella o più celle, e il numero di pixel raccolti presso la PMT (rivelatore) sarà maggiore del numero di pixel raccolti presso la PMT (rivelatore) dopo la scansione di un'intera cella o più celle.
    8. Set-up della serie tempo tali che l'acquisizione di ROI è analizzato 35 volte, una volta ogni 30 s. fare clic sul pulsante Acquisisci , quindi il pulsante di Serie temporali . Nella finestra di Controllo di serie di tempo , fare clic sul pulsante manuale start di serie e il pulsante stop manuale di serie . Immettere 35 nel campo di serie di arresto manuale, premere il tasto invio , quindi fare clic sul pulsante di ritardo ciclo 30,0 sec (Figura 2E).
    9. Impostare il controllo di candeggina, tale che il photobleaching si verificherà dopo scansione numero 5, a raccogliere 5 immagini prebleach dell'acquisizione ROI. Fare clic sul pulsante Acquisisci , quindi sul pulsante Edit Bleach . Nella finestra di Controllo di Bleach , fare clic sul quadrato bianco accanto la candeggina dopo numeri scansioni. Immettere 5 nel campo numero di scansione, quindi premere il tasto invio (Figura 2F).
      Nota: Immagini prebleach e postbleach dovrebbero essere acquisite alla stessa profondità ottica.
    10. Creare una forma circolare candeggina ROI entro l'ALIS che ha un diametro di 10 pixel (zona = 0,8 µm2). Fare clic acquisire | Modificare Bleach | Definire le aree. Nella finestra di Bleach regioni , fare clic sull'icona del cerchio . Fare clic e trascinare nella finestra immagine per creare un cerchio con un diametro di 10 pixel (zona = 0,8 µm2) (Figura 2F).
    11. Impostare le iterazioni su 300. Fare clic sul pulsante Acquisisci , quindi sul pulsante Edit Bleach . Nella finestra di Controllo di Bleach , immettere 300 nel campo iterazioni, quindi premere il tasto invio (Figura 2F).
    12. Impostare la linea di 514 nm laser di Argon/2 al 100% di potenza (8,6) e 100% di trasmissione durante la candeggina. Fare clic sul pulsante Acquisisci , quindi sul pulsante Edit Bleach . Nella finestra di Controllo di Bleach , fare clic sulla casella quadrata bianca a sinistra del 514 nm. Immettere 100 nel campo di trasmissione [%] per la linea di laser 514 nm, quindi premere il tasto invio (Figura 2F).
      Nota: Il numero di iterazioni deve essere determinata empiricamente. Varierà a seconda il fluoroforo, la dimensione della struttura che verrà essere sbiancata e il laser.
  3. Raccolta dei dati
    1. Iniziare l'esperimento FRAP. Raccogliere le prime 5 immagini prebleach e la prima immagine di postbleach, quindi calcolare la profondità di candeggina secondo la seguente equazione.
      Equation 1
      Se la profondità di candeggina è < 90, interrompere l'esperimento e scartare i dati, come la profondità di candeggina non era sufficiente. Quando la profondità di candeggina è ≥ 90, raccogliere i dati per l'analisi con un'immagine elaborazione programma e un programma di foglio di calcolo (Tabella materiali).
      Nota: Quando drift dell'ALIS è ≥ 3 µm, interrompere l'esperimento e scartare i dati, come questa quantità di drift di immagine non può essere corretto per analisi con software di elaborazione immagine (Tabella materiali). Quando drift dell'ALIS è < 3 µm, raccogliere i dati per l'analisi dei dati con un'immagine elaborazione programma e un programma di foglio di calcolo (Tabella materiali).
    2. Raccogliere dati di FRAP da 10 ALIS da 10 celle con meno di 3 µm di deriva dell'ALIS. Successivamente, trasferire i file di .lsm di scopo ad un personal computer per l'analisi dei dati.
  4. Analisi dei dati in un programma di elaborazione di immagini
    1. Corretta per drift di immagine di allineamento o di corrispondenza (vale a dire, registrazione) nello stack di immagini di serie temporali dell'acquisizione ROI. A tale scopo, aprire ogni file di .lsm AIM con un programma di elaborazione immagini (Tabella materiali), quindi selezionare plugin | Registrazione | StackReg | Traduzione. Successivamente, selezionare plugin | Registrazione | StackReg | Corpo rigido10.
    2. Set-up Manager ROI per misurare l'intensità di segnale la candeggina ROI. Selezionare analizzare | Strumenti | ROI Manager. Selezionare lo strumento ovale , quindi disegnare un cerchio nella candeggina ROI con un diametro di 10 pixel, quindi fare clic sul pulsante Aggiungi .
    3. Set-up Manager ROI per misurare l'intensità del segnale nel controllo ROI. In ROI Manager, selezionare lo strumento rettangolo , disegnare un quadrato di 20 x 20 pixel nella zona ROI di controllo, quindi fare clic sul pulsante Aggiungi .
    4. Set-up Manager ROI per misurare l'intensità del segnale in background ROI. In ROI Manager, selezionare lo strumento rettangolo , disegnare un quadrato di 20 x 20 pixel della regione di ROI di sfondo, quindi fare clic sul pulsante Aggiungi .
    5. Rinominare il ROIs. Dopo aver aggiunto il ROIs per essere analizzati in ROI Manager, rinominarli Bleach ROI, controllo ROIe Sfondo ROI di conseguenza.
    6. Misura l'intensità del segnale nella ROIs. Selezionare ROI Bleach, controllo ROIe ROI di sfondo, quindi selezionare più | Multi misura. Assicurarsi che misurano 35 tutte le fette e una riga per ogni fetta siano selezionate. Nella finestra Impostare misure , assicurarsi che sia selezionato il solo valore di grigio medio .
      Nota: Questi sono i dati grezzi di FRAP (Figura 1B).
    7. Incollare i risultati in un foglio di calcolo (Tabella materiali). Copia la candeggina ROI, controllare ROI, e l'intensità del segnale sfondo ROI risultati poi incollarli alle colonne denominate rispettivamente Bleach ROI, controllo ROIe Sfondo ROI, in un programma di foglio di calcolo (Tabella materiali).
  5. Analisi dei dati in un foglio di calcolo
    1. Sfondo-correggere l'intensità del segnale nella candeggina ROI e controllo ROI (Figura 1A, C). Utilizzare lo strumento Inserisci funzione in un programma di foglio di calcolo (Tabella materiali) per sottrarre i valori nella colonna con l'etichetta Sfondo ROI dai valori nella colonna etichettata Bleach ROI. Sottrarre i valori nella colonna etichettata Sfondo ROI dai valori nella colonna con l'etichetta Controllo ROI. Etichettare queste nuove colonne Rettificato ROI di Bleach e Corretto controllo ROI.
    2. Normalizzare il segnale la candeggina ROI al segnale sfondo-rettificato nel controllo ROI (Figura 1A, D). Utilizzare la funzione di inserire in un foglio di calcolo (Tabella materiali) per dividere i valori nella colonna etichettato Rettificato Bleach ROI dai valori nella colonna con l'etichetta Corretto controllo ROI. Etichetta questa nuova colonna Normalizzato corretto Bleach ROI.
    3. Normalizzare il segnale nella colonna Normalizzato corretto Bleach ROI alla media dei 5 valori prebleach la candeggina ROI (Figura 1A, E). Calcolare la media dei valori di prebleach 5 la candeggina ROI. Successivamente, dividere i valori nella colonna etichettata Normalizzato ROI Bleach rettificato dalla media di 5 valori prebleach la candeggina ROI. Etichetta questa nuova colonna Normalizzato corretto Prebleach Bleach ROI medio.
  6. Frazione mobile e metà tempo di recupero dai dati curva-montato
    1. I dati ROI candeggina normalizzato e corretti utilizzando un programma di elaborazione immagini (Tabella materiali) adattamento curva. Il programma di elaborazione immagini (Tabella materiali), selezionare Analyze | Strumenti | Curva di raccordo. Copia il postbleach normalizzato e corretti valori ROI di candeggina e i corrispondenti valori di tempo, quindi incollarli in finestra Curva montatore . Selezionare Recupero esponenziale dal menu a discesa Curva montatore , quindi adatta.
    2. Calcolare il Mf dai parametri della funzione di recupero, che fornisce i valori per: 'a', una frazione di lenta ripresa; 'b', il tasso di recupero; e 'c', una frazione rapidamente diffondente. Calcola Mf inserendo i valori di 'a' e 'c' nell'equazione Mf = a + c. calcolare If usando l'equazione hof = 1 - Mf. Calcolare t½ sostituendo il valore per 'b' nell'equazione Equation 2 quindi risolvendo per t1/2. 11

Representative Results

Qui sono i risultati di un tipico esperimento in cui abbiamo usato FRAP per esaminare il grado di mobilità di p62 in ALIS in cellule RAW 264.7 trattati con LPS per 3-5 h12. Figura 3 A Mostra i dati grezzi ottenuti da una candeggina, controllare e ROI in background dopo lo stack di immagini era stato allineato per correggere per piccole quantità (< ~ 3 µm) della deriva di immagine dell'ALIS. Fluorescenza YFP-p62 in questo ALIS a prebleach e postbleach è mostrato in Figura 3E e complementare Video 1. Figura 3 B Mostra questi dati dopo correzione del fondo. Figura 3 C Mostra questi dati dopo la correzione per fluorescenza nel controllo ROI. Figura 3 D Mostra questi dati normalizzati alla fluorescenza media dei 5 valori prebleach la candeggina ROI. Il grado di sbiancamento era sufficiente in questo esperimento (candeggina profondità = 91,94). YFP-p62 fluorescenza all'interno di questo ALIS ha recuperato lentamente, come t1/2 = 128.27 s (min 2,14). YFP-p62 non era una proteina molto mobile in questo esperimento, come Mf = 21,97 e If = 78,03.

Figure 1
Figura 1 : Un diagramma di una cella di RAW 264.7 e passaggi per l'analisi di immagine dopo le immagini FRAP sono state allineate per correggere la deriva di immagine dell'ALIS. (A) diagramma di una cella di RAW 264.7 raffiguranti diversi ALIS e la candeggina, controllo e sfondo ROIs entro l'acquisizione ROI. (B), una rappresentazione idealizzata di FRAP raw dati ottenuti nella candeggina, di controllo e sfondo ROIs nel pannello A. (C) un grafico idealizzato di dati grezzi di FRAP che sono stati corretti di sfondo. (D) un grafico idealizzato di sottofondo-rettificato FRAP dati che sono stati normalizzati a fluorescenza nel controllo ROI. (E) un idealizzato grafico di dati FRAP normalizzati e sfondo-corretti che sono stati normalizzati per la fluorescenza prebleach la candeggina ROI. Abbreviazioni: Con = controllo; BG = sfondo. Questa figura è stata modificata da Rabut ed Ellenberg4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Immagini dell'interfaccia utente del software AIM (tabella materiali) per selezione laser, fascio percorso configurazione e parametri di acquisizione immagine per gli esperimenti FRAP. Laser (A) controllare la schermata che mostra le linee laser Argon/2, uscita e corrente del tubo utilizzato. (B) configurazione controllo schermo mostrando il fascio splitter ed emissione filtrare le impostazioni utilizzate. (C) scansione di controllo schermo mostrando l'impostazione utilizzata per acquisizione di immagini. (D) scansione di controllo schermo mostrando il foro stenopeico, rivelatore guadagno, amplificatore offset, guadagno dell'amplificatore e le impostazioni di trasmissione per la linea di laser di Argon/2 514 nm. (E) serie di tempo controllo schermo che mostra le impostazioni di serie di tempo utilizzate. Bleach (F) controllo schermo mostrando la prebleach e postbleach i parametri utilizzati. Abbreviazioni: HFT = Haupt Farb Teiler (divisore di fascio dicroico primaria); NT1 = Neben Farb Teiler 1 (divisore di fascio prima secondaria dicroico); NT2 = Neben Farb Teiler 2 (divisore di fascio dicroico secondo secondario); EF = filtro di emissione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Un esperimento FRAP rappresentativo per studiare la dinamica di YFP-p62 in ALIS in cellule RAW 264.7. (A) dati di intensità di fluorescenza Raw per un candeggina, controllo e sfondo del ROI. (B) i dati riportati nel pannello A dopo la candeggina e il controllo ROI era stato corretto per la fluorescenza in background ROI. (C) i dati riportati in pannelli A e B dopo normalizzazione l'intensità di fluorescenza nella candeggina ROI al conto per fluorescenza nel controllo sfondo-rettificato ROI. (D) i dati riportati in pannelli A-C dopo normalizzazione l'intensità di fluorescenza nella candeggina normalizzata e sfondo-rettificato ROI alla media dei primi 5 valori prebleach la candeggina ROI. Mf = 21,97, hof = 78.03, t1/2 = 128.27 s (2,14 min) e la candeggina profondità = 91,94. (E), un'immagine di un ALIS presso prebleach (1,5 min) e postbleach (0, 6 e 16 min). Barra della scala = 5 µm ed è valida per tutti i pannelli. Abbreviazioni: Con = controllo; BG = sfondo; Corr. = corretto; Norm. = normalizzato; Medio a = media. Questa figura è stata modificata da Cabe et al.12Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementary Video 1
Supplementare Video 1: un tipico ALIS in un RAW 264.7 del macrofago prima e dopo photobleaching. Fluorescenza YFP-p62 è lento a recuperare dopo il photobleach; quindi, p62 non è una proteina molto mobile. Per questo esperimento, Mf = 25,62, hof = 74.38, t1/2 = 442.79 s (7,38 min) e la candeggina profondità = 90,19. Barra della scala = 5 µm. Questo video è stato modificato da Cabe et al.12per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Discussion

Forniamo un protocollo completo, pratico e semplice passo-passo per FRAP esperimenti con cellule vive. Nel presente documento, il protocollo è stato utilizzato per misurare la mobilità di YFP-p62 in ALIS in macrofagi RAW 264.7, ma può essere applicato a molti del microscopio confocale sistemi di scansione laser e geneticamente codificato proteine fluorescenti che sono ora disponibili. Per qualsiasi sistema di microscopia, esperimenti pilota sono fondamentali per determinare i parametri ottimali di FRAP, tra cui acquisizione, candeggina e misure di controllo di ROI, intensità del laser per photobleaching e acquisizione di immagini prebleach e postbleach. È ragionevole aspettarsi che i parametri ottimali di FRAP differiscano per ogni linea di proteine e cellule fluorescente geneticamente codificato.

Fattori importanti da considerare quando un esperimento di FRAP includono (a) raggiungimento adatto candeggina profondità, (b) l'uso di un breve passo d'imbianchimento, postbleach tempo sufficiente (c) che consente di osservare la funzione di recupero con registrazione completa, l'efficienza di photobleaching (d), (e). citotossicità con ripetute FRAP e (f) l'inclusione di un controllo per la perdita di fluorescenza dei ripetuti delle immagini. Si consiglia che la profondità di candeggina, che può essere calcolata secondo l'equazione fornita nella sezione 3.3.1, essere ≥ 9013. Quando la profondità di candeggina è < 90, il grado di recupero postbleach fluorescenza verrà essere sottovalutato e i valori di If, Mfe t1/2 sarà errati. Sebbene la durata e l'intensità degli impulsi laser che inducono candeggina può variare tra FRAP esperimenti, è importante che il passo di photobleaching essere breve e sostanzialmente più veloce rispetto alla funzione di recupero di fluorescenza. Se non è, una quantità significativa di recupero fluorescenza potrebbe verificarsi durante la fase di candeggina. Con un tempo lungo candeggina, recupero di fluorescenza durante la fase di candeggina non sarebbe misurato, e porterebbe a misurazioni errate di If, Mf, et1/2. Inoltre, per ottenere valori corretti per If, M,f, et1/2, l'acquisizione di ROI dovrebbe essere osservato postbleach fino a quando il livello di fluorescenza nella candeggina ROI ha raggiunto un plateau. Ad esempio, nei nostri esperimenti FRAP, non c'era differenza tra I valori di t1/2 , Mfefquando abbiamo osservato fluorescenza YFP-p62 la candeggina ROI per 32,2 min postbleach rispetto a quando abbiamo osservato YFP-p62 la candeggina ROI per postbleach 15,1 min; quindi, abbiamo concluso che la funzione di recupero ha raggiunto un plateau a 15,1 min postbleach12. Per quanto riguarda efficienza photobleaching, photobleaching aumenta con il quadrato del fattore zoom ottico14. Così, l'uso di obiettivi zoom ottici alte è favorevole per photobleaching rapido ma può causare indesiderati photobleaching durante acquisizione; quest'ultimo può essere contabilizzato mediante un controllo ROI di formazione immagine. Photobleaching ripetute deve essere evitata in quanto può portare alla generazione di specie reattive citotossiche dell'ossigeno (ROS). Tuttavia, il grado di generazione di ROS dovuti all'esposizione ad un laser ad alta intensità è inferiore per le proteine fluorescenti geneticamente codificate rispetto per fluorofori chimico (ad es., anticorpi fluorescenti)15, e il ROS generato è più propensi a reagire all'interno della proteina fluorescente codificata geneticamente rispetto con altre molecole in cella4. Oltre la maggiore probabilità di generare ROS citotossici, ripetute photobleaching è da evitarsi in quanto è difficile da controllare. Infine, sebbene la trasmissione laser basso viene utilizzato per acquisire tutte le immagini non-candeggina, alcuni photobleaching invariabilmente si verificherà, che deve essere controllato. Possibili controlli per questo includono monitoraggio fluorescenza in un controllo ROI entro l'acquisizione ROI, ottenendo immagini di controllo in una cella vicina greggia ed esecuzione di esperimenti di controllo con le impostazioni identiche per chi è abituato alla photobleaching esperimenti ma senza l'evento photobleaching.

Disclosures

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi di divulgare.

Acknowledgments

Ringraziamo il dottor Seth Robia alla Loyola University Chicago per i suoi preziosi commenti su questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da NIH grant 1R01NS073967-01A1 a Joanna C. Bakowska.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Hyclone SH30022.01 High Glucose (4.5 g/L)
Fetal bovine serum Gemini Bio-Products 100-106
Glass bottom dishes MatTek P35G-1.5-14-C 35 mm
ImageJ software National Institutes of Health N.A.
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L4391
Nocodazole Sigma M1404
Penicillin-streptomycin solution Corning 30-002-Cl 100×
Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil objective Carl Zeiss MicroImaging, Inc 4407629904000000
Polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966-1 linear (MW 25,000)
RAW 264.7 murine macrophages ATCC TIB-71
Zeiss confocal microscope Carl Zeiss MicroImaging, Inc LSM 510

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References

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Recupero di fluorescenza dopo Photobleaching di giallo fluorescente proteine Tagged p62 in Aggresome-come le strutture indotta
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Rademacher, D. J., Cabe, M., Bakowska, J. C. Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures. J. Vis. Exp. (145), e59288, doi:10.3791/59288 (2019).More

Rademacher, D. J., Cabe, M., Bakowska, J. C. Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures. J. Vis. Exp. (145), e59288, doi:10.3791/59288 (2019).

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