נתאר פרוטוקול מקיף ומעשי פלורסצנטיות שחזור לאחר photobleaching ניסויים עם חיים תאים. למרות הפרוטוקול שימש כדי למדוד את הניידות של צהוב הניאון מתויג חלבון p62 במבנים המושרה, כמו aggresome, ניתן להחיל אותה למגוון רחב של מערכות מיקרוסקופ וחלבונים פלורסנט.
קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר photobleaching (FRAP) היא טכניקה מיקרוסקופית שניתן לכמת ניידות חלבונים בתאים חיים. בניסוי FRAP טיפוסי, מצב יציב פלורסצנטיות נצפית על ידי הדמיה חוזרות עם אור לייזר בעוצמה נמוכה. לאחר מכן, מולקולות פלורסנט הם במהירות ובאופן בלתי הפיך לקוי באמצעות חשיפה קצרה אור לייזר בעוצמה גבוהה. מידע על חלבון ניידות מתקבל על-ידי ניטור ההתאוששות של זריחה. השתמשנו FRAP כדי לקבוע את הניידות של p62 במבנים דמויי aggresome מושרה (ALIS) ב מקרופאגים מאתר לאחר גירוי עם ליפופוליסכריד (LPS). בגלל פרוטוקולים רבים FRAP הקיים או לא שלם או מורכבים, המטרה שלנו הייתה לספק פרוטוקול צעד אחר צעד מקיף, מעשית וישירה לניסויים FRAP עם תאים חיים. כאן, אנו מתארים RAW264.7 מקרופאג תרביות תאים עם צהוב הניאון חלבון-p62 (YFP-p62), אינדוקציה של ALIS באמצעות חשיפת התאים LPS ולאחר שיטה שלב אחר שלב של איסוף prebleach postbleach FRAP תמונות ונתונים וניתוח. לבסוף, נדון גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון בעת עריכת ניסוי FRAP.
קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר photobleaching (FRAP) היא טכניקה מיקרוסקופית שניתן לכמת חלבון דינאמיקה של חיים תאים1,2. הפופולריות של FRAP גדל כתוצאה מהזמינות מסחרי נרחב של סריקת מיקרוסקופ קונפוקלי עם רזולוציה גבוהה, מהירות ורגישות לייזר, “קשת” של מקודדים גנטית חלבונים פלורסנט, כגון ירוק ניאון חלבון (GFP), חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP)3. חלבונים פלורסנט מקודדים גנטית הם התמזגו כדי חלבון עניין כדי לאפשר לוקליזציה subcellular של החלבון עניין. בניסוי FRAP טיפוסי, קרינה פלואורסצנטית מצב יציב באזור רכישה של עניין (ROI) בתוך תא הוא ציין באמצעות הדמיה חוזרות ונשנות של רועי זה עם אור לייזר בעוצמה נמוכה. לאחר מכן, מולקולות פלורסנט הן במהירות ובאופן בלתי הפיך לקוי בקבוצת משנה מוגדרים מראש של רכישת רועי, ןלהל האקונומיקה רועי, על ידי חשיפה קצרה אור לייזר בעוצמה גבוהה. כמו חלבונים חדשים מולבן לחדש חלבונים מולבן לאורך זמן, המהירות ואת עוצמת קרינה פלואורסצנטית השחזור של האקונומיקה ROI מספק מידע אודות חלבון ניידות (איור 1)4.
האינטרס שלנו בקביעת הניידות של אוביקוויטין מחייב חלבון p62 (הידוע גם sequestosome-1) במבנים דמויי aggresome מושרה (ALIS) ב מקרופאגים RAW264.7 מאתר לאחר גירוי עם ליפופוליסכריד (LPS) הביאה אותנו כדי לסקור את FRAP ספרות. למרבה הצער, רבים מן הפרוטוקולים הקיימים FRAP הם חלקיים או מורכבים באופן מופרז5,6,7,8,9. חלקם אינם מספקים מידע מפורט אודות הגדרות לייזר, קרן נתיב תצורה, התמונה רכישה פרמטרים5,6,7,8,9. אחרים להשמיט פרטים חשובים לגבי ניתוח נתונים, כגון כיצד הנושא של אקונומיקה רועי להיסחף6,9 או כיצד לחשב פרמטרים חשובים שחזור, לרבות שבר ניידים (נז), שבר משותק (אניf), ואת המחצית של השחזור (t½)5,7. לעומת זאת, אחרים דגש רב מדי על נוסחאות מתמטיות מורכבות המשמש לחישוב Mf, אניf, ו- t1/25,6,8,9. לכן, המטרה שלנו היא לספק פרוטוקול צעד אחר צעד מקיף, מעשית וישירה לניסויים FRAP עם תאים חיים.
אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד מקיף, מעשיים, פשוטים FRAP ניסויים עם תאים חיים. בזאת, הפרוטוקול שימש כדי למדוד את הניידות של YFP-p62 ב- ALIS ב מקרופאגים RAW264.7, אבל זה יכול להיות מיושם רבים של הלייזר סריקת מערכות מיקרוסקופ קונפוקלי גנטית המקודדים חלבונים פלורסנט זמינים כעת. עבור כל מערכת מיקרוסקופ, טייס הניסויים הם קריטיים עבור קביעת פרמטרים FRAP אופטימליים, כולל רכישה, אקונומיקה, ומידות שליטה רועי, עוצמת לייזר photobleaching, ייבוא תמונות prebleach ו- postbleach. סביר לצפות פרמטרים FRAP אופטימליים כדי להיות שונה עבור כל מקודדים גנטית פלורסנט חלבון ותא קו.
גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון בעת עריכת ניסוי FRAP כוללים (א) להשגת מתאימים אקונומיקה עומק, (ב) השימוש צעד הלבנת קצרה, postbleach (ג) דבר המאפשר זמן מספיק כדי לבחון את תפקוד החלמה מלאה, יעילות (ד) photobleaching, (ה). cytotoxicity עם חוזרות FRAP, (נ) ההכללה של פקד עבור אובדן פלורסצנטיות עקב הדמיה חוזרות ונשנות. אנו ממליצים כי אקונומיקה עומק, אשר יכול להיות מחושב על פי המשוואה המפורטת בסעיף 3.3.1, להיות ≥9013. כאשר הוא מלבין עומק < 90, מידת ההתאוששות זריחה postbleach לזלזל, ואת הערכים של אניf, Mf, ו- t1/2 יהיו שגויים. למרות משך ועוצמת פעימות לייזר בתדר אקונומיקה עשויים להשתנות בין ניסויים FRAP, חשוב כי הצעד photobleaching להיות קצר ומהיר באופן משמעותי יותר מאשר הפונקציה שחזור זריחה. אם לא, אז כמות משמעותית של קרינה פלואורסצנטית שחזור יכול להתרחש במהלך השלב הלבנת. עם זמן ארוך מלבין, קרינה פלואורסצנטית שחזור במהלך השלב הלבנת לא ניתן למדוד ולאחר שזה יוביל מדידות שגויות של אניf, Mf, ו-t1/2. בנוסף, כדי להשיג את הערכים הנכונים עבור אניf, Mf, ו-t1/2, רכישת רועי להתייחס postbleach עד רמת קרינה פלואורסצנטית האקונומיקה רועי הגיע מישור. לדוגמה, בניסויים שלנו FRAP, לא היה הבדל בין ה-אניf, Mfו- t1/2 ערכים כאשר הבחנו פלורסצנטיות YFP-p62 ב האקונומיקה רועי 32.2 דקות postbleach לעומת כאשר הבחנו YFP-p62 ב האקונומיקה ROI עבור מין נמצא 15.1 postbleach; לפיכך, הגענו למסקנה כי הפונקציה שחזור הגיעו מישור דקות נמצא 15.1 postbleach12. לגבי יעילות photobleaching, photobleaching עולה עם הריבוע של מקדם זום אופטי14. לפיכך, שימוש בעדשות זום אופטי גבוה היא חיובית על photobleaching המהירה אבל יכול לגרום photobleaching לא רצויה במהלך הרכישה; האחרון יכול להיות אחראים על ידי הדמיה פקד ROI. Photobleaching חוזרות היא להימנע ככל זה יכול להוביל הדור של מינים חמצן תגובתי ציטוטוקסיות (ROS). עם זאת, מידת ROS דור עקב חשיפה לייזר בעוצמה גבוהה הוא נמוך יותר עבור חלבונים פלורסנט מקודדים גנטית מאשר כימי fluorophores (למשל, נוגדנים פלורסנט)15, האבחון שנוצר נוטים יותר להגיב בתוך גנטית פלורסנט החלבונים המקודדים מאשר עם מולקולות אחרות התא4. בנוסף ההסתברות גדלה של יצירת ROS ציטוטוקסיות, photobleaching חוזרות היא ניזונה גם ככה קשה לשלוט. בסופו של דבר, למרות שידור נמוכה לייזר משמש כדי לרכוש כל התמונות ללא אקונומיקה, כמה photobleaching תמיד יתרחשו, אשר חייבים להיות מבוקרים. פקדים אפשרי בשביל זה כוללים ניטור קרינה פלואורסצנטית בפקד ROI במסגרת הרכישה, רועי, קבלת תמונות בקרה בתא מולבן שכנות, ביצוע בקרת ניסויים עם ההגדרות זהים לאלה המשמשים ניסויים photobleaching אבל בלי האירוע photobleaching.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים ד ר סת Robia אוניברסיטת לויולה שיקגו על הערותיו יקר על כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH גרנט 1R01NS073967-01A1 כדי ג’ואנה ג Bakowska.
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH30022.01 | High Glucose (4.5 g/L) |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35-mm |
Image J software | National Institutes of Health | N.A. | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391 | |
Nocodazole | Sigma | M1404 | |
Penicillin-streptomycin solution | Corning | 30-002-Cl | 100× |
Plan-Apochromat 63×/1.40 oil objective | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | 4407629904000000 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-1 | linear (MW 25,000) |
RAW 264.7 murine macrophages | ATCC | TIB-71 | |
Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | LSM 510 |