Мы описываем всеобъемлющий и практический протокол для флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание экспериментов с живой клетки. Хотя протокол был использован для измерения мобильности Жёлтый флуоресцентный протеин тегами p62 в aggresome-индуцированной структуры, он может применяться для различных систем микроскопии и флуоресцентных белков.
Флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание (FRAP) микроскопии технику, которая может использоваться для количественной оценки подвижности белков в живых клеток. В типичном эксперименте FRAP установившегося флуоресценции наблюдается при повторных изображений с низкой интенсивности лазерного света. Впоследствии флуоресцентных молекул быстро и необратимо зрением через кратковременного воздействия высокой интенсивности лазерного света. Информация о мобильности белок получается путем мониторинга восстановления флуоресценции. Мы использовали FRAP для определения мобильности p62 в искусственных структур (ОВНМ) aggresome как в мышиных макрофаги после стимуляции с липополисахарида (LPS). Потому что многие существующие протоколы FRAP являются либо неполными, либо сложные, нашей целью было обеспечить всеобъемлющий, практический и простой шаг за шагом протокол для FRAP экспериментов с живой клетки. Здесь мы описываем transfection RAW264.7 макрофагов с желтый флуоресцентный белок p62 (рекламы ЯФП p62), индукции ALIS, подвергая клетки ПЛАСТИНОК и шаг за шагом метод для сбора целлюлоз и postbleach FRAP изображений и анализа данных. Наконец мы обсудим важные факторы, которые следует учитывать при проведении FRAP эксперимент.
Флуоресценции восстановления после того, как Фотообесцвечивание (FRAP) является методом микроскопии, который может использоваться для количественного определения динамики белков в живой клетки1,2. Популярность FRAP возросла из-за широкой коммерческой доступности лазерного сканирования конфокальные микроскопы с высоким разрешением, скорость и чувствительность, и «Радуга» из генетически закодирована флуоресцентных белков, таких как Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) и желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП)3. Генетически закодированный флуоресцентные белки сплавлены к протеину интереса для субцеллюлярные локализация протеина интереса. В типичном эксперименте FRAP установившегося флуоресценции в регионе приобретения интереса (ROI) в ячейке наблюдается через повторяющиеся изображения что ROI с низкой интенсивности лазерного света. Впоследствии флуоресцентных молекул быстро и необратимо нарушена в стандартное подмножество приобретения ROI, далее именуемые как отбеливатель ROI, путем кратковременного воздействия высокой интенсивности лазерного света. Как новые небеленой белки пополнить отбеленной белки с течением времени, скорость и интенсивность флуоресценции восстановления в отбеливатель ROI предоставляет сведения о белка мобильности (рис. 1)4.
Наша заинтересованность в определении подвижности убиквитин p62 связывания белка (также известный как sequestosome-1) в aggresome как искусственных структурах (ОВНМ) в мышиных RAW264.7 макрофаги после стимуляции с липополисахарида (LPS) привели нас пересмотреть FRAP литература. К сожалению многие из существующих протоколов FRAP являются неполными или чрезмерно сложной в5,6,,78,9. Некоторые не представить подробную информацию о параметрах лазер, луч путь конфигурации и изображения приобретения параметры5,6,,78,9. Другие опущены ключевые детали относительно анализа данных, таких как вопрос о отбеливатель ROI дрейф6,9 или как рассчитать важные восстановления параметров, включая мобильные дроби (fM), неподвижные фракция (Яf) и половина время восстановления (½t)5,7. И наоборот, другие делается слишком большой упор на сложных математических формул, используемых для вычисления Mf, яfи t1/25,6,8,9. Таким образом наша цель – обеспечить всеобъемлющий, практический и простой шаг за шагом протокол для FRAP экспериментов с живой клетки.
Мы предлагаем всеобъемлющий, практический и простой шаг за шагом протокол для FRAP экспериментов с живой клетки. Здесь протокол был использован для измерения мобильности рекламы ЯФП p62 в ALIS в RAW264.7 макрофагов, но он может быть применен к многие из лазерного конфокального микроскопа системы сканирования и генетически закодированный флуоресцентных белков, которые теперь доступны. Для любой системы, микроскопия экспериментальные эксперименты имеют решающее значение для определения оптимальных параметров FRAP, включая приобретение, отбеливатель и управления ROI размеров, интенсивности лазера для Фотообесцвечивание и приобретение целлюлоз и postbleach изображения. Это разумно ожидать оптимальные параметры FRAP отличаются для каждой генетически закодированный флуоресцентный белок и ячейки строки.
Важные факторы, которые следует учитывать при проведении эксперимента FRAP a обеспечение подходящих отбеливатель глубины, (b) использование краткого отбеливания шаг, (c) позволяет достаточно времени postbleach наблюдать полное восстановление функции, эффективность (d) Фотообесцвечивание, (e). цитотоксичность неоднократные FRAP, и (f) включение элемента управления для флуоресценции потери из-за повторяющихся изображений. Мы рекомендуем что отбеливатель глубины, которая может быть рассчитана по формуле, в разделе 3.3.1, ≥9013. Когда это отбеливатель глубина < 90, степень postbleach флуоресценции восстановления будет нельзя недооценивать и значения яf, Mfи t1/2 будет неверным. Хотя продолжительность и интенсивность лазерных импульсов, вызывая отбеливатель может варьироваться между FRAP эксперименты, важно, что Фотообесцвечивание шаг быть краткими и значительно быстрее, чем функцию восстановления флуоресценции. Если это не так, то значительное количество флуоресцирования восстановления может произойти во время отбеливания шаг. С временем длинные отбеливатель, флуоресценции восстановления во время отбеливания шага не будет оцениваться, и это приведет к неправильным измерениям яf, Mf, иt1/2. Кроме того, чтобы получить правильные значения для яf, Mf, ит1/2, приобретение ROI должны соблюдаться postbleach до тех пор, пока уровень флюоресценции в отбеливатель ROI достиг плато. Например, в наших экспериментах FRAP, там был никакой разницы между If, Mfи t1/2 значения когда мы наблюдали рекламы ЯФП p62 флуоресценции в отбеливатель ROI 32.2 мин postbleach по сравнению с когда мы наблюдали рекламы ЯФП p62 в отбеливатель ROI для 15.1 мин postbleach; Таким образом мы пришли к выводу, что функции восстановления достигли плато 15.1 мин postbleach12. Что касается эффективности Фотообесцвечивание Фотообесцвечивание увеличивается с площади оптический зум фактор14. Таким образом использование высоким оптическим зум-объективы благоприятна для быстрого Фотообесцвечивание, но может привести к нежелательным Фотообесцвечивание во время приобретения; последний можно объяснить для визуализации элемент управления ROI. Неоднократно Фотообесцвечивание является следует избегать, поскольку это может привести к генерации цитотоксических реактивнооксигенных видов (ров). Однако степень ROS поколения из-за воздействия высокой интенсивности лазерного ниже для генетически закодированный флуоресцентных белков, чем для химических флуорофоров (например, флуоресцентные антитела)15, и генерируется рос более склонны реагировать в пределах генетически закодированный флуоресцентного белка, чем с другими молекулами в ячейки4. Помимо увеличение вероятности генерирования цитотоксических ROS неоднократно Фотообесцвечивание — следует избегать, поскольку это трудно контролировать. Наконец хотя низкий лазерной передачи используется для получения всех изображений не отбеливатель, некоторые Фотообесцвечивание неизбежно произойдет, который должен контролироваться. Возможные элементы для этого включают в себя мониторинг флуоресценции в элементе управления ROI в рамках приобретения ROI, получение изображений управления в соседней ячейке небеленой и выполнение контроля эксперименты с одинаковыми параметрами для тех, которые используются в Фотообесцвечивание эксперименты, но без Фотообесцвечивание событие.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим д-р Сет Робия Университет Лойолы за его ценные комментарии на этой рукописи. Эта работа была поддержана NIH Грант 1R01NS073967-01A1 для Joanna C. Bakowska.
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH30022.01 | High Glucose (4.5 g/L) |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35-mm |
Image J software | National Institutes of Health | N.A. | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391 | |
Nocodazole | Sigma | M1404 | |
Penicillin-streptomycin solution | Corning | 30-002-Cl | 100× |
Plan-Apochromat 63×/1.40 oil objective | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | 4407629904000000 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-1 | linear (MW 25,000) |
RAW 264.7 murine macrophages | ATCC | TIB-71 | |
Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | LSM 510 |