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Biology

Lipídico rápido gota protocolo de aislamiento utilizando un Kit de aislamiento de organelas bien establecidas

Published: April 19, 2019 doi: 10.3791/59290
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Gastroenterology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

Este Protocolo establece un método novedoso de aislamiento de gotas de lípido y purificación de hígado de ratón, usando un kit de aislamiento de retículo endoplásmico bien establecida.

Abstract

Gotitas del lípido (LDs) son bioactivos organelos encontrados el citosol de la mayoría eukaryotic y algunas células procariotas. LDs están compuestos de lípidos neutros encajonados por una monocapa de fosfolípidos y proteínas. Lípidos de LD hepáticos, tales como ceramidas y proteínas están implicados en varias enfermedades que causan esteatosis hepática. Aunque los métodos anteriores se han establecido para el aislamiento de LD, requieren una tiempo preparación de reactivos y no están diseñados para el aislamiento de varios compartimentos subcelulares. Se intentó establecer un nuevo protocolo para permitir el aislamiento de LDs, retículo endoplásmico (ER) y lisosomas de hígado de ratón.

Además, todos los reactivos utilizados en el protocolo que presentamos están disponibles en el mercado y requieren de una preparación reactivo mínimo sin sacrificar la pureza del LD. Aquí presentamos datos que comparan este nuevo protocolo un protocolo gradiente de sacarosa estándar, demostrando producción, morfología y pureza comparable. Además, podemos aislar ER y lisosomas utilizando la misma muestra, proporcionando visión detallada de la formación y el flujo intracelular de lípidos y sus proteínas asociadas.

Introduction

LDs son bioactivos organelos encontrados el citosol de las células eucariotas más y algunas células procariotas1,2,3. El núcleo de la LD está compuesto por lípidos neutros como los triglicéridos (TG) y ésteres de colesterol. También contienen ceramidas, lípidos bioactivos en de4,de vías de señalización celular5. LDs están rodeados por una monocapa de fosfolípidos y recubiertas de proteínas, incluyendo la perilipin proteínas perilipin 2 (PLIN2) y 3 (PLIN3)1,5,6. También están presentes las enzimas lipogénicos, lipasas y proteínas de la membrana la trata de personas que han sido vinculadas a varias enfermedades steatotic hepáticas, incluyendo enfermedad del hígado graso no alcohólico, enfermedad hepática alcohólica y la hepatitis C3,5 ,6,7,8,9,10.

LDs se cree que la forma de la membrana externa de la ER y contienen TG recién sintetizada de ácidos grasos libres derivados de ER11. Sin embargo, sigue siendo desconocido si los lípidos combinados bud, permanecer conectados, o son suprimidos de la ER6,11, haciendo el aislamiento de LDs de ER técnicamente difícil. Ácidos grasos libres pueden ser liberados del Sud por la acción de las lipasas superficie para proporcionar para la producción de energía o la síntesis de la membrana. Además, LDs pueden ser degradados a través de lipophagy como un mecanismo regulador y para producir ácidos grasos libres12.

Además del ER y lisosomas, hay otros organelos, como mitocondrias, peroxisomas, endosomas y la membrana plasmática, que se encuentran en estrecha asociación de LDs11. Esta poligamia apretada dificulta realizar una extracción pura de LD. Sin embargo, innata de baja densidad lípidos neutros puede ser aprovechada mediante centrifugación5.

Tradicionalmente, LDs han aislado con una sacarosa densidad gradiente1,5,13. Sin embargo, estos métodos no han sido diseñados para aislar otros organelos. Además, necesitan el tiempo preparación de los reactivos. Este protocolo adapta un aislamiento comercial de ER kit (véase la Tabla de materiales) para permitir el aislamiento de LD. Usamos el tampón de extracción proporcionado por el kit, agregar un paso de aislamiento de LD. Además, el protocolo también puede utilizarse para ER y aislamiento lisosomal utilizando las mismas muestras, lo que permite una imagen más completa del ciclo de vida de LDs. Para validar este nuevo método, ensayo de rendimiento de LD, morfología, tamaño y pureza. Se comparan los resultados presentados aquí a los obtenidos con un protocolo ampliamente utilizado utilizando un gradiente de sacarosa para el aislamiento de LD.

Utilizamos un 10 a 12-semanas de edad, 20 g hembra C57BL/6 ratón ayunó durante 16 h (eliminación de alimentos en 17:00 para un tiempo de aislamiento de LD de 9:00) con acceso libre al agua. El rendimiento típico de TG es 0.6 mg/g hígado y para la proteína del LD, es hígado de 0,25 mg/g. Esto proporciona suficiente material para ~ 10 immunoblots por SDS PAGE. El protocolo a continuación de los datos de los reactivos usados y un protocolo adecuado para un hígado solo 1 g. El protocolo de aislamiento gradiente de sacarosa es adaptado de Sato14 y15de Wu.

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Protocol

Todos los experimentos se realizaron en un banco de laboratorio con equipo de protección personal apropiado para el nivel de bioseguridad 1, incluyendo una bata, guantes y gafas de seguridad. Los experimentos fueron realizados según los protocolos aprobados por la institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Pennsylvania. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el malestar del animal y los animales fueron tratados con atención humana.

1. aislamiento LD utilizando el kit de aislamiento ER

  1. Preparación
    Nota: Las cantidades mencionadas son convenientes para un hígado de ratón solo 1 g.
    1. Preparar 10 mL de tampón de extracción isotónica x 1 (tampón de la IE, del kit del aislamiento del ER) diluyendo 2 mL de tampón de IE x 5 con 8 mL de agua ultrapura. Enfriar el búfer al colocarlo sobre hielo.
    2. Diluir 10 mL de PBS de x 10 en 90 mL de agua ultrapura para preparar 100 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS). Enfriar colocando en el hielo.
    3. Para preparar 10 mL de 5% polietilenglicol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenil éter (PGPE) diluyendo 500 μl de PGPE en 9,5 mL de agua ultrapura. Utilice una jeringa de 1 mL para medir PGPE como es viscoso. Enfriar colocando en el hielo.
    4. Enfriar todos los tubos, colocándolos en hielo: tubos de microcentrífuga de 1,7 mL, tubos de centrífuga de 15 mL, tubos de centrífuga de alta velocidad de 50 mL y 13 mL tubos de ultracentrífuga.
    5. Enfriar los centrifugadoras a 4 ° C: una microcentrífuga, una centrífuga de alta capacidad para 15 mL tubos, una centrifugadora de alta velocidad para tubos de 50 mL y una ultracentrífuga.
    6. Esterilice en autoclave los tijeras de disección y pinzas.
  2. Preparación de tejido
    1. Eutanasia el ratón colocando en una cámara llenada de 100% CO2 durante 10 minutos eutanasia confirmar mediante la realización de la dislocación cervical.
    2. Utilizando pinzas estériles y tijeras de disección, cortadas las capas de piel y músculo del abdomen en el eje posterior, anterior al exponer el hígado.
    3. Cortar los ligamentos que conectan el hígado en el diafragma y el intestino. Utilice pinzas para sacar el intestino a hígado, hacia la parte posterior, para exponer los ligamentos.
    4. Corte entre el hígado y la parrilla costal dorsal, pasando de anterior a posterior, hasta que el hígado se libera.
    5. Transferir el hígado a un frío 5 cm plato de Petri con 10 mL de PBS 1 x fría.
    6. Lave el hígado 2 x en una plataforma oscilante en 10 mL de PBS 1 x fría durante 5 minutos a 4 ° C en la placa de Petri de 5 cm. Retirar 1 x PBS después del último lavado.
    7. Utilizar una cuchilla quirúrgica estéril de tamaño 10 (vea la Tabla de materiales) para cortar el hígado en trozos de 3-5 mm en la placa de Petri (figura 1A) de 5 cm.
    8. Lave el hígado en cubos de 2 x con 10 mL de PBS 1 x fría durante 5 minutos a 4 ° C en la placa de Petri de 5 cm.
      Nota: Para el aislamiento del lisosoma, transfiera 0,5 g de hígado a un homogeneizador limpio 45 mL y seguir las indicaciones suministradas por la extracción de lisosoma kit (véase la Tabla de materiales).
    9. 1 x PBS se decanta y transferir los trozos de hígado picados a la fría 45 mL homogeneizadores Dounce. Asegúrese de que todas las piezas van a la parte inferior de la homogeneizadora.
    10. Agregar 7 mL de tampón de IE 1 x frío (desde el kit de aislamiento ER) y homogeneizar el hielo, moviendo la mano arriba y abajo de 20 x. Asegúrese de que la mano va a la parte inferior de la homogeneizadora durante cada carrera.
    11. Transferir el homogeneizado (figura 1B) a un tubo de centrífuga de 15 mL frío.
    12. Enjuagar el homogeneizador con 1 mL de frío 1 x buffer de IE (desde el kit de aislamiento ER) y añadir al resto el homogeneizado.
  3. Aislamiento de LD
    1. Quitar los núcleos centrifugar el homogeneizado en una centrífuga de alta capacidad a 1.000 x g durante 10 min a 4 ° C (figura 1).
    2. Transferir el sobrenadante postnuclear (PNS) a un tubo de centrífuga de 50 mL nuevo, frío. Para evitar la pérdida de LD, asegúrese de que cualquier lípido se reunieron en la parte superior del tubo de 15 mL se resuspendió antes de transferir el PNS.
    3. Tomar alícuota de PNS para análisis de pureza 100 μl y colocar en un tubo de microcentrífuga de frío 1,7 mL. Situado a un lado en el hielo.
    4. Para Retire la mitocondrias, Centrifugue la muestra PNS, no la parte alícuota, en una centrífuga refrigerada de alta velocidad a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
      1. Opcional: para aislamientos de LD (EPC) crudo (con la contaminación por citosol y membrana celular), recoger la capa de lípidos superior con una pipeta de vidrio y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Continuar a la sección 1.4.
    5. Transferir el sobrenadante postmitochondrial (PMS) a un tubo de ultracentrífuga. Para evitar la pérdida de LD, asegúrese de que cualquier lípido se reunieron en la parte superior se resuspendió antes de transferir el PMS.
    6. Tomar alícuota de PMS para el análisis de pureza 100 μl y colocar en un tubo de microcentrífuga de frío 1,7 mL. Situado a un lado en el hielo.
    7. Llene un tubo de ultracentrífuga hasta el borde con frío 1 x buffer de IE para evitar que el tubo que se derrumban durante la ultracentrifugación.
    8. El balance de las muestras y centrifugar en una ultracentrífuga a 100.000 x g durante 60 min a 4 ° C (figura 1).
    9. Para quitar la capa de LD, incline el tubo a un ángulo de 45° y utilice una pipeta de vidrio para aspirar. Transfiera el sedimento en un tubo de microcentrífuga de frío 1,7 mL.
      Nota: La pastilla contiene ER aislado. Utilice esta fracción aguas abajo para el aislamiento de ER.
    10. Recoger 100 μl del sobrenadante post-ER (por) debajo de la capa de lípidos para el análisis de pureza.
  4. Lavado de LD
    1. Añadir 1 x PBS a la fracción de LD recopilada en un tubo de microcentrífuga 1.7, para un volumen total de 1,3 mL.
    2. Vórtice de la muestra.
    3. Centrifugar en una microcentrífuga a la máxima velocidad durante 5 minutos a 4 ° C para que sedimenten los residuos celulares. Caliente el tubo suavemente con las manos para ayudar a suspender de nuevo la capa de LD. Transferir el sobrenadante, incluyendo la capa de lípidos, a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
    4. Repita los pasos 1.4.1–1.4.3 2 x x-3, hasta que la pastilla ya no es visible.
    5. Añadir 1 x PBS a la LD pellet-libre sobrenadante hasta un volumen final de 1.5 mL. La fracción lipídica de la colada por centrifugación en una microcentrífuga a la máxima velocidad durante 5 minutos a 4 ° C.
    6. Retirar 1 mL de 1 x PBS (por debajo de la capa de lípidos) con una pipeta de vidrio sin alterar la capa de lípidos.
    7. Repita los pasos 1.4.5 y 1.4.6 4 x x-5, hasta que el PBS 1 x es visualmente transparente con ninguna turbidez.
    8. Quitar todos los PBS 1 x por debajo de la capa de lípidos, con una pipeta de vidrio (Figura 1E).
    9. Utilizar el resultado, una fracción pura de LD, para posteriores análisis.
  5. Cuantificación de la proteína de LD por análisis ácido bicinchoninic
    Nota: No use un ensayo ácido bicinchoninic (BCA) si morfología LD debe evaluarse.
    1. Resuspender el LD en 500 μL de PGPE 5%.
    2. Hervir las muestras por 5 min a 95 ° C, vortex e incubar las muestras a temperatura ambiente durante 5 minutos enfriar.
    3. Repita el paso 1.5.2 un adicional 2 x.
    4. Someter a ultrasonidos las muestras durante 5 minutos con una 30 s/ciclo, a intensidad media.
    5. Normalizar las muestras mediante la medición de la concentración de proteína en todas las muestras de análisis de pureza y en la fracción de LD por ensayo BCA.

2. aislamiento LD mediante gradiente de densidad de sacarosa

  1. Preparación
    1. Hacer 200 mL de buffer TE (10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 1 mM EDTA [pH 8.0]). Enfriar colocando en el hielo.
    2. Hacer 100 mL de solución de sacarosa de 60% (p/v) en tampón TE disolviendo 60 g de sacarosa en solución tampón TE, llevando el volumen final a 100 mL. Enfriar colocando en el hielo.
    3. Hacer 6 mL de solución de sacarosa al 40% (w/v) añadiendo 4 mL de sacarosa al 60% a 2 mL de tampón TE. Enfriar colocando en el hielo.
    4. Hacer 6 mL de solución al 25% (p/v) de sacarosa añadiendo 2.5 mL de sacarosa al 60% a 3,5 mL de tampón TE. Enfriar colocando en el hielo.
    5. Hacer 4 mL de solución 10% (p/v) de sacarosa añadiendo 0,7 mL de sacarosa al 60% a 3,3 mL de tampón TE. Enfriar colocando en el hielo.
    6. Tomar 10 mL de solución de inhibidor de la proteasa y fosfatasa mediante la adición de una tableta de inhibidores de la proteasa y fosfatasa a 10 mL de tampón TE.
    7. Preparar el tampón de homogeneizado de tejido añadiendo 4 mL de solución de inhibidor de la proteasa y fosfatasa a 50 mL de solución stock de 60% de sacarosa. Enfriar colocando en el hielo.
    8. Preparar el tampón de recubrimiento añadiendo 2 mL de solución de inhibidor de la proteasa y fosfatasa a 50 mL de tampón TE. Enfriar colocando en el hielo.
    9. Diluir 10 mL de PBS de x 10 en 90 mL de agua ultrapura para preparar 100 mL de 1 x PBS. Enfriar colocando en el hielo.
    10. Preparar 10 mL de 5% PGPE por dilución a 500 μl de PGPE en 9,5 mL de agua ultrapura. Utilice una jeringa de 1 mL para medir PGPE como es viscoso. Enfriar colocando en el hielo.
    11. Enfriar los tubos de centrífuga siguientes colocándolos en hielo: tubos de microcentrífuga de 1,7 mL, tubos de centrífuga de 15 mL, tubos de centrífuga de alta velocidad de 50 mL y 13 mL tubos de ultracentrífuga.
    12. Enfriar las centrifugadoras requiere a 4 ° C: una microcentrífuga, una centrífuga de alta capacidad (para tubos de 15 mL), una centrifugadora de alta velocidad (para tubos de 50 mL) y una ultracentrífuga.
  2. Preparación de tejido
    1. Utilizar pasos 1.2.1–1.2.9 para preparar el tejido para homogeneización.
    2. Agregar 7 mL de tampón de homogeneizado de tejido frío y homogeneizar el hielo moviendo la mano arriba y abajo de 20 x. Durante los cinco primeros trazos, asegúrese de que la mano va a la parte inferior de la homogeneizadora.
    3. Transferir el homogenizado a un tubo de centrífuga de 15 mL frío.
    4. Enjuagar el homogeneizador con 1 mL de tampón de homogeneizado de tejido frío y transferir al tubo de centrífuga 15 mL previamente usados.
    5. Llevar el volumen del homogeneizado hasta 10 mL con buffer de homogeneizado de tejido.
    6. Centrifugue la muestra en una centrífuga de alta capacidad a 1.000 x g durante 10 min a 4 ° C.
    7. Transferencia 8 mL del sobrenadante a un tubo de centrífuga de 50 mL.
    8. Transfiera 100 μl del sobrenadante restante como muestra PNS para análisis de pureza.
  3. Gradiente de sacarosa
    1. El tubo de centrífuga de 50 mL que contenga 8 mL de PNS en un ángulo de 45° de inclinación. Añadir cuidadosamente 6 mL de solución de sacarosa al 40%, asegurando que las dos fases alojarte separadas.
    2. De manera similar, lentamente agregar 6 mL de solución de sacarosa al 25%; a continuación, añadir 4 mL de solución de sacarosa al 10%; por último, añada 8 mL de tampón de recubrimiento.
    3. Centrifugue la muestra en una centrífuga de alta velocidad a 30.000 x g a 4 ° C durante 30 minutos.
    4. Transferir la capa superior conteniendo el Sud a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
    5. Para el lavado de LD, siga los pasos en la sección 1.4.

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Representative Results

Hemos realizado el aislamiento de LD con el kit de ER en aproximadamente 30 ratones y compararon los resultados con aquellos que siguen el protocolo de aislamiento de sacarosa en aproximadamente 40 ratones. Los resultados reportados son típicos para ambos protocolos. Ratones se mantuvieron en ayuno durante la noche con acceso libre al agua, para aumentar el rendimiento de LD. Aislamiento de LD utilizando un gradiente de sacarosa se ejecute en paralelo con el kit de ER protocolo de aislamiento de LD. Muestras de PNS, PMS, por CLDs y LDs fueron recogidos en todo el kit de ER protocolo de aislamiento de LD. Debido a la restricción de flujo de trabajo del Protocolo de aislamiento de sacarosa, se obtuvieron sólo el aislante del PNS y LD.

Para microscopia fluorescente, se mezclaron 50 μl de LDs aislados con un volumen igual de 100 μm de 4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene (DPBDI). Las muestras fueron protegidas de la luz y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las muestras se lavaron, añadir 1 mL de PBS 1 x, seguido de centrifugación y remoción del exceso de tampón. De la fracción de LD, se colocó 1 μl sobre un portaobjetos de microscopio y coverslipped. 20 representante x fluorescente y brightfield imágenes LD fueron tomadas del aislamiento de kit LD ER y el aislamiento de sacarosa LD métodos (figura 2A-D), utilizando un microscopio invertido de investigación (véase la Tabla de materiales). Las imágenes de brightfield revelan similares niveles de material particulado, sugiriendo purezas similares utilizando los diferentes protocolos.

Para determinar las diferencias de rendimiento entre los dos protocolos, se utilizaron ratones de tamaños comparable y hígados del ratón (Figura 2EF). Siguientes niveles de purificación, LD TG y proteína se midió mediante análisis colorimétricos (ver la Tabla de materiales) y los datos fueron normalizados a peso del hígado (figura 2h). Encontramos, cuando normalizó el material de partida, que la proteína de LD y TG rendimiento después de aislamiento LD utilizando el kit de ER y sacarosa fueron similares. Para determinar si el tamaño de LD también era similar, cuantificamos diámetros LD utilizando software de análisis de imagen (véase la Tabla de materiales). LDs oscilaron entre 0,27 y 6.37 μm. La distribución de frecuencias de diámetro de LD muestra que el ER kit LD aislamiento (Figura 3A) y aislamiento de LD de sacarosa (figura 3B) LDs de tamaños similares.

Para evaluar la pureza del LD, las muestras fueron analizadas por immunoblotting. Una cantidad de 20 μg de proteína por muestra fue probada por SDS PAGE. Las muestras fueron probadas con los marcadores de anticuerpos para LDs (PLIN2 y PLIN3), ER (Sec61), mitocondrias (VDAC), lisosomas (LAMP1), membrana plasmática (MEK1), núcleos (histona H3) y el citosol (GAPDH) (Figura 4A). PLIN2 fue detectada en todas las muestras excepto el kit de ER aislamiento LD PER y PNS de la sucrosa. LDs deriva el kit ER aislamiento de LD y el sacarosa gradiente protocolo ambos tenía igual pureza. No bandas aparecieron para ER (Sec61), mitocondrias (VDAC1), lisosomas (LAMP1), membrana plasmática (Mek1) o citosol (GAPDH). El centro tenía membrana plasmática y contaminación citosol pero sin contaminación aparente de la ER, mitocondrias y lisosomas. La intensidad de la banda de PLIN2 en el protocolo de ER adaptado indica que el protocolo de ER tenía aproximadamente 14-fold PLIN2 mayor expresión en la fracción de LD en comparación con el PNS, mientras que el protocolo de sacarosa tenía una expresión de PLIN2 mayor multiplicado por seis en el (LD) fracción datos no mostrados).

Ya que este protocolo también tiene la opción de purificar ER y lisosomas, también realizamos western blot para evaluar la pureza de estos orgánulos. Figura 4B muestra que los immunoblots de ER purificada de la misma muestra usando la ER kit (véase la Tabla de materiales) estaban libre de PLIN2 pero tenía niveles significativos de la proteína de Sec61A ER. Mediante el enriquecimiento lysosomal kit (véase la Tabla de materiales), lisosomas fueron más aislados y immunoblotted de LD (PLIN2), ER (Sec61A) y lisosomas (LAMP1) marcadores (figura 4). Juntos, estos datos demuestran que el protocolo presentado aquí, en combinación con los kits de purificación de lisosoma comercialmente disponibles, permiten el aislamiento puro de hígado LDs, ER, lisosomas y de un solo animal.

Figure 1
Figura 1: referencia de fotografías tomadas durante la Aislamiento de LD utilizando el kit de aislamiento ER . (A) en cubos de 5 mm hígado pedazos en un plato de Petri de 5 cm. (B) homogeneizado de hígado después de la homogeneización en un homogeneizador de Dounce. (C) homogeneizado de hígado después de la centrifugación a 1.000 x g; Tenga en cuenta la capa de lípidos leve, el PNS y el sedimento que contiene restos de células y de la fracción nuclear. (D) LD capa después de la ultracentrifugación a 100.000 x g; Tenga en cuenta la capa de lípidos prominente, el PER, y la fracción de ER en la parte inferior. (E) LD lavado fracción antes de la eliminación final de la PBS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: micrografía y análisis cuantitativo comparar la fracción de LD aislado con un kit de ER y la fracción de LD aislado con sacarosa. Representante 20 x micrografía fluorescente de (A) una fracción de LD DPBDI manchado aislado con un kit de ER y de LDs (B) aislados con sacarosa. (C) Brightfield micrografía de la fracción de LD aislado con un kit de ER y (D) la fracción de LD aislada con sacarosa. La barra de escala = 20 μm. (E) ratón peso y (F) peso del hígado. Rendimiento (G) TG de LDs purificadas normalizado para el peso del hígado. Rendimiento de proteína (H) de LDs purificadas normalizados para el peso del hígado. Los datos son la media ± SEM (N = 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Distribución de frecuencia de tamaños de LD. Muestras de cuatro ratones diferentes fueron teñidas con DPBDI y representante x 20 campos fueron cuantificados. Los diámetros fueron medidos usando un software de análisis de imagen. (A) distribución de frecuencias (fracción) de una fracción de LD aislada usando un kit de ER. (B) distribución de frecuencias (fracción) de una fracción de LD aislada usando densidad gradiente de sacarosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Análisis de pureza del LD por immunoblotting. (A) Comparar el protocolo adaptado del aislamiento kit LD ER y el protocolo de aislamiento de sacarosa, 20 μg de proteína por muestra fue immunoblotted. Se han cargado las muestras siguientes: sobrenadante postnuclear (PNS), postmitochondrial sobrenadante (PMS), sobrenadante de retículo postendoplasmic (PER), crudo LDs (EPC) y Sud (LD). Las muestras fueron immunoblotted para LDs (PLIN2 y PLIN3), ER (SEC61A), mitocondrias (VDAC1), lisosomas (LAMP1), membrana de la célula (MEK1), núcleos (histona H3) y marcadores de citosol (GAPDH). (B) protocolo de análisis de pureza de una fracción de ER después la posterior purificación de la ER mediante el aislamiento de kit LD ER (véase la Tabla de materiales). PNS, PMS, ER y LDs fueron cargados y immunoblotted para Sud (PLIN2) y ER (SEC61A). (C) análisis de pureza de una fracción lisosomal después posterior purificación de los lisosomas con el kit de enriquecimiento lisosoma protocolo (véase la Tabla de materiales). PNS y una fracción lysosomal fueron cargados y immunoblotted LDs (PLIN2), ER (SEC61A) y lisosomas (LAMP1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Biología de LD hepático es cada vez más reconocida como un regulador crítico de la fisiología hepatocelular en salud y enfermedad. Como organelos de buena fe, LDs son dinámicos, interactuar con otras estructuras celulares y contienen dentro de los componentes bio-activos involucrados en la homeostasis de lípidos y glucosa. El gradiente de la sucrosa se utiliza habitualmente para el aislamiento de LD y permite a los investigadores a estudiar la estructura de LD, pero requiere hacer numerosas reservas. Hemos demostrado que el uso de un kit de aislamiento disponible en el mercado de ER es otra herramienta que puede ser utilizada para el aislamiento de LD no sólo pero para aislamiento de tándem de ER y el lisosoma, lo que permite una visión más integral de la dinámica celular en respuesta a las diversas condiciones experimentales, sin aumento significativo del flujo de trabajo.

La fuerza de este nuevo protocolo es su facilidad de instalación usando comercialmente o reactivos fácilmente disponibles y su capacidad para aislar organelos múltiples simultáneamente. Sin embargo, hay desventajas potenciales de este nuevo método a tener en cuenta. Varios pasos de este protocolo pueden desfavorecer el aislamiento de las LDs desde el hígado. Dounce homogeneización tiene el potencial de alterar el gran Sud a través de la tensión de esquileo. Conexión configuración de Homogeneizadores Dounce puede aliviar la tensión a gran Sud. Además, se emplea a 100.000 x g spin, lo que permite la separación de LD y ER. Esta velocidad también puede causar una pérdida de LDs grandes, como un informe recomienda 2.000 x g para hígado LD purificación2. Una limitación de este procedimiento es que no puede utilizarse para aislar LDs de diferentes tamaños como recientemente descrito16. Además, aunque búferes de sacarosa pueden mantener LDs frágil intacta mediante homogeneización suave2, homogeneización con tampón de IE x 1 da LDs puros con similar morfología y distribución de tamaño como los derivados del aislamiento de gradiente de sacarosa . Estudios adicionales se necesitarán para determinar si la actividad biológica se ve afectada por el uso de un tampón PBS, que es menos suave que utilizan búferes isotónica2. Debido a estas limitaciones potenciales, es fundamental durante los primeros pasos de dos centrífugas para resuspender completamente el lípido recogido en la parte superior antes de transferir el sobrenadante y determinar empíricamente el efecto de la cantidad de movimiento en la producción del LD para diferentes tejidos. El hígado protocolo presentado aquí utiliza 20 movimientos, produciendo una distribución de tamaño comparable a otros trabajos publicados2.

Aislamiento de LD utilizando el kit de aislamiento de retículo endoplasmático produce aislamientos LD crudos y puros. Aislamientos de EPC contienen componentes del citosol y membrana celular pero pueden ser suficientes para algunas aplicaciones, como la evaluación de la morfología de LD con microscopía. El aislante puro de la LD, según expresión de PLIN2, carece de ER, mitocondrial, lysosomal, membrana de la célula o contaminación del citosol. De hecho, la cepa pura del kit ER protocolo de aislamiento de LD enriquece PLIN2 más que doble en comparación con el método de aislamiento de sacarosa LD. Esta diferencia fue inesperada, dada la similitud en la proteína y TG rendimiento, pero puede ser debido al uso de PBS como un buffer de resuspensión en lugar de sacarosa o buffer isotónico.

Aislamiento de LD por métodos tradicionales puede sufrir también de la contaminación de la fracción de LD por la membrana plasmática2. Aunque este aislamiento Co es común en todos los métodos de aislamiento LD y la debe tenerse en cuenta al analizar LD aislamientos2, los datos presentados aquí demuestran más ultracentrifugación de la cepa de EPC se deshace la muestra de estos contaminantes ( Figura 4). Adaptaciones futuras pueden incluir el uso de una prensa francesa o bomba de nitrógeno alteran la membrana celular más suavemente y reducir aún más cualquier tipo de contaminación de la EPC aislar2.

En conclusión, el kit de ER método de aislamiento de la LD es un uso nuevo de una herramienta de uso general biología celular. Este método se realiza semejantemente a aislamiento gradiente de sacarosa, con menos preparación del reactivo. Además, la inclusión de reactivos preparados en el kit de ER protocolo de aislamiento de LD mejora el rigor y la reproducibilidad de las condiciones experimentales.

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Disclosures

El Dr. Carr recibe apoyo a la investigación de productos farmacéuticos interceptar.

Acknowledgments

Agradecemos a la familia de Abramson Cancer Research Institute. Este trabajo es apoyado por las subvenciones siguientes: NIAAA/NIH R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, la Fundación Robert Wood Johnson, Harold Amos Facultad desarrollo Premio médicos, 7158, IDOM RDC piloto Premio P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Este trabajo fue financiado en parte por el NIH P30-DK050306 y sus instalaciones de la base (Patología Molecular y Imaging Core, Biología Molecular del Gene expresión núcleo y base de la cultura de célula) y su piloto programa de subvenciones. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioExpress Vortex Mixer GeneMate S-3200-1 Vortex Mixer
Centrifuge 54242 R Eppendorf 54242 R Refrigerated Counter Microcentrifuge
Rotor: FA-45-24-11
Centrifuge Sorvall RC6 + Thermo Scientific RC6+ Refrigerated High Speed Centrifuge
Rotor: F21S-8x50y
Centrifuge Sorvall Legend RT+ Thermo Scientific Legend RT+ Refrigerated High Capacity Centrifuge
Rotor: 75006445 Bucket: 75006441
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich 04 693 116 001 Protease Inhibitor Tablets
Diagenode Bioruptur UCD-200 Diagenode UCD-200 Sonication System
Dounce Tissue Grinder (45 mL) Wheaton 357546 Use Loose pestle
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) Corning 21-031-CM
Endoplasmic Reticulum Isolation Kit Sigma Aldrich ER0100 For ER kit Extraction:
Contains:
Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL
Hypotonic Extraction Buffer 10 mL
Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL
OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL
Blunt Nosed Needle 1 ea.
External light source for flourescent excitation Leica Leica EL6000
Hydrochloric acid Sigma Aldrich H1758 Hydrochloric Acid
ImageJ Image Analysis Software
Inverted Modulating Contrast Microscope Leica Leica DM IRB
Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells Thermo Fisher Scientific 89839 For Lysosome Isolation
Microscope Camera Qimaging QICAM fast 1394
Optima XL-100K Ultracentrifuge Beckman-Coulter XL-100K Ultracentrifuge
Rotor: SW41Ti
Pasteur Pipettes Fisher Scientific 22-042817
Petri Dish 5 cm Fisher Scientific FB0875713A
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
PhosSTOP Sigma Aldrich 04 906 845 001 Phosphatase Inhibior Tablets
Sterile Surgical Blade #10 Pioneer S2646
Sucrose Fisher Scientific S5-500 Crystalline/Certified ACS
Triglyceride Liquicolor Kit Stanbio  2200-225 Colorimetric Triglyceride kit
Tris Base Fisher Scientific BP152-1 For TE buffer
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151-100 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent
UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) Thermo Fisher Scientific 15575-038 For TE buffer

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References

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Biología número 146 lípido gotitas aislamiento hígado perilipin 2 retículo endoplasmático tampón de extracción degradado isotónica de sacarosa
Lipídico rápido gota protocolo de aislamiento utilizando un Kit de aislamiento de organelas bien establecidas
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Brettschneider, J., Correnti, J. M., … More

Brettschneider, J., Correnti, J. M., Lin, C., Williams, B., Oranu, A., Kuriakose, A., McIver-Jenkins, D., Haba, A., Kaneza, I., Jeon, S., Scorletti, E., Carr, R. M. Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit. J. Vis. Exp. (146), e59290, doi:10.3791/59290 (2019).

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