Summary
Ce protocole établit une nouvelle méthode d’isolement de gouttelettes lipidiques et la purification du foie de souris, à l’aide d’un kit d’isolation bien établie du réticulum endoplasmique.
Abstract
Gouttelettes lipidiques (LDs) sont des organites bioactifs trouvés dans le cytosol de la plupart des eucaryotes et certaines cellules procaryotes. LDs sont composées de lipides neutres enveloppés par une monocouche de phospholipides et de protéines. Les lipides LD hépatiques, tels que les céramides et les protéines sont impliquées dans plusieurs maladies qui causent une stéatose hépatique. Bien que les méthodes précédentes ont été établies pour l’isolement de la LD, ils nécessitent une longue préparation des réactifs et ne sont pas conçus pour l’isolement de plusieurs compartiments subcellulaires. Nous avons cherché à établir un nouveau protocole permettant l’isolement de LDs, réticulum endoplasmique (re) et de lysosomes une seule foie de souris.
En outre, tous les réactifs utilisés dans le protocole présenté ici sont disponibles commercialement et requièrent une préparation minimale réactif sans sacrifier la pureté de la LD. Ici, nous présentons des données comparant ce nouveau protocole à un protocole de gradient de saccharose standard, démontrant le rendement, la morphologie et la pureté comparable. En outre, nous pouvons isoler ER et les lysosomes en utilisant le même exemple, donnant un aperçu détaillé dans la formation et le flux intracellulaire des lipides et les protéines associées.
Introduction
LDs sont des organites bioactifs dans le cytosol des cellules eucaryotes plus et certaines cellules procaryotes1,2,3. L’âme de LD est composée de lipides neutres tels que les esters de cholestérol et de triglycérides (TG). Elles contiennent également des céramides, lipides bioactifs impliqués dans cellulaire signalisation voies4,5. LDs sont entourés d’une monocouche de phospholipides et recouvert de protéines, y compris le perilipin protéines perilipin 2 (PLIN2) et 3 (PLIN3)1,5,6. Sont également présents lipogenic enzymes lipases et des protéines membranaires trafic qui ont été associées à plusieurs maladies de stéatose hépatiques, y compris la stéatose hépatique non-alcoolique, maladie alcoolique du foie et l’hépatite C3,5 ,6,7,8,9,10.
LDs sont censés se forment de la membrane externe de l’ER et contiennent nouvellement synthétisée TG provenant des acides gras dérivés ER11. Cependant, il reste inconnu si les lipides regroupées IUN, connectés en permanence, ou sont excisés de l’ER6,11, rendant l’isolement de LDs exempts de ER techniquement difficile. Acides gras libres peut être libérées de LDs par l’action des lipases surfaces de prévoir la production d’énergie ou de la synthèse de la membrane. En outre, LDs peuvent être dégradées par l’intermédiaire de lipophagy comme un mécanisme de régulation et de produire des acides gras libres,12.
Outre l’ER et les lysosomes, il y a des autres organites — comme les mitochondries, endosomes, peroxysomes et la membrane plasmique — qui se trouvent au sein de l’association étroite de LDs11. Cette polygamie serrée, il est difficile d’effectuer une extraction pure de la LD. Cependant, densité faible innée des lipides neutres peut être mises à profit par centrifugation5.
Traditionnellement, le LDs ont été isolés à l’aide d’un saccharose densité gradient1,5,13. Cependant, ces méthodes n’ont pas été conçus pour isoler les autres organites. En outre, ils exigent la longue préparation des réactifs. Ce protocole s’adapte un isolement ER commercialement disponible nécessaire (voir la Table des matières) pour permettre à l’isolement de la LD. Nous utilisons le tampon d’extraction fourni par le kit, en ajoutant une étape d’isolement de LD. En outre, le protocole peut également servir pour ER et l’isolement lysosomal en utilisant les mêmes échantillons, ce qui permet une image plus complète du cycle de vie de LDs. Pour valider cette nouvelle méthode, nous dosage LD rendement, morphologie, taille et la pureté. Nous comparons les résultats présentés ici à celles obtenues avec un protocole largement utilisé en utilisant un gradient de saccharose pour l’isolement de la LD.
Nous avons utilisé un 10 à 12-week-old, souris C57BL/6 femelle de 20 g à jeun pendant 16 h (retrait de nourriture à 17:00 pendant une période d’isolement de LD 09:00) avec un accès gratuit à l’eau. Le rendement typique de TG est de 0,6 mg/g de foie, et pour la protéine LD, c’est 0,25 mg/g de foie. Ceci fournit suffisamment d’éléments pour l’immuno-blot ~ 10 par SDS PAGE. Le protocole ci-dessous détaille les réactifs utilisés et un protocole adapté à un foie unique de 1 g. Le protocole d’isolement dégradé de saccharose est adapté de Sato,14 et15de la Wu.
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Protocol
Toutes les expériences ont été menées sur un banc de laboratoire avec des équipements de protection individuelle appropriés pour la prévention des risques biotechnologiques, niveau 1, y compris une blouse, des gants et des lunettes de sécurité. Des expériences ont été réalisés selon les protocoles approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Pennsylvanie. Tous les efforts ont été faits pour minimiser l’inconfort animale et les animaux ont été traités avec soins compatissants.
1. isolement de LD à l’aide d’un kit d’isolation ER
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Préparation
Remarque : Les montants indiqués sont adaptés pour un foie de souris unique de 1 g.- Préparer 10 mL de 1 x extraction isotonique tampon (buffer IE, de la trousse d’isolement ER) en diluant 2 mL de tampon de IE 5 x 8 ml d’eau ultrapure. Cool le tampon en le plaçant sur la glace.
- Préparer 100 mL 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en diluant 10 mL de PBS de x 10 dans 90 mL d’eau ultrapure. Refroidir en le plaçant sur la glace.
- Préparer 10 mL d’éther de phényle-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) p5 % polyéthylèneglycol (PGPE) en diluant 500 µL du PGPE à 9,5 mL d’eau ultrapure. Utiliser une seringue de 1 mL pour doser comme il est visqueux PGPE. Refroidir en le plaçant sur la glace.
- Cool tous les tubes en les plaçant sur la glace : tubes de microcentrifuge de 1,7 mL, tubes à centrifuger 15 mL, tubes de centrifugeuse à grande vitesse de 50 mL et 13 mL ultracentrifugeuse tubes.
- Cool tous les centrifugeuses à 4 ° c : une micro-centrifugeuse, une centrifugeuse de haute capacité pour 15 mL tubes, une centrifugeuse à grande vitesse pour tubes de 50 mL et une ultracentrifugeuse.
- Stériliser les ciseaux pincette et la dissection à l’autoclave.
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Préparation du tissu
- Euthanasier la souris en le plaçant dans une chambre remplie de 100 % CO2 pendant 10 min. confirmer l’euthanasie en effectuant la dislocation cervicale.
- À l’aide d’une pince stérile et ciseaux de dissection, couper les couches de la peau et des muscles de l’abdomen sur l’axe antérieur/postérieur pour exposer le foie.
- Couper les ligaments reliant le foie à la membrane et l’intestin. Avec pince pour tirer l’intestin de la foie, vers la partie postérieure, d’exposer les ligaments.
- Couper entre le foie et la cage thoracique dorsale, passant d’antérieur postérieur jusqu'à ce que le foie est libéré.
- Transférer le foie d’un froid 5 cm boîte de pétri avec 10 mL de PBS 1 x contre le rhume.
- Laver le foie 2 x sur une plate-forme bascule dans 10 mL de PBS 1 x contre le rhume pendant 5 min à 4 ° C dans la boîte de pétri de 5 cm. Décanter la solution PBS 1 x après le lavage final.
- Utilisez une lame chirurgicale stérile de taille-10 (voir la Table des matières) à couper en dés le foie en morceaux de 3 à 5 mm dans les 5 cm boîte de pétri (Figure 1 a).
- Laver le foie en dés de 2 x 10 ml de PBS 1 x contre le rhume pendant 5 min à 4 ° C dans la boîte de pétri de 5 cm.
Remarque : Pour l’isolement du lysosome, transférer 0,5 g de foie dans un homogénéisateur propre 45 mL et suivre les indications fournies par l’extraction de lysosome nécessaire (voir la Table des matières). - Décanter la solution 1 PBS x et transférer les morceaux de foie en dés à la froide 45 mL Dounce homogénéisateur. S’assurer que toutes les pièces vont au fond de l’homogénéisateur.
- Ajouter 7 mL de tampon IE froid 1 x (à partir de la trousse d’isolement ER) et homogénéiser sur glace en déplaçant le pilon et descendre de 20 x. Veiller à ce que le pilon va au fond de l’homogénéisateur pendant chaque course.
- Transférer l’homogénat (Figure 1 b) dans un tube à centrifuger froid 15 mL.
- Rincer l’homogénéisateur avec 1 mL de froid 1 x tampon de IE (à partir de la trousse d’isolement ER) et l’ajouter au reste de l’homogénat.
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Isolement de LD
- Enlever les noyaux en CENTRIFUGEANT l’homogénat dans une centrifugeuse de haute capacité à 1 000 x g pendant 10 min à 4 ° C (Figure 1).
- Transférer le surnageant post-nucléaire (PNS) dans un tube à centrifuger nouvelle, froid 50 mL. Pour éviter toute perte de LD, faire en sorte que tout lipide se sont réuni au sommet du tube de 15 mL est resuspendu avant de transférer le PNS.
- Prendre une 100 µL aliquote de la PNS pour analyse de pureté et le placer dans un tube de microcentrifuge froid 1,7 mL. Mettre de coté sur la glace.
- Pour supprimer des mitochondries, centrifuger l’échantillon PNS, pas l’aliquote, dans une centrifugeuse à grande vitesse à 12 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
- En option: pour les isolats de LD (CLD) brut (avec contamination cytosol et membrane cellulaire), recueillir la couche lipidique haut de la page à l’aide d’une pipette de verre et transférez-le dans un tube de microcentrifuge de 1,7 mL. Continuez à la section 1.4.
- Transférer le surnageant postmitochondrial (PMS) dans un tube ultracentrifugeuse. Pour éviter toute perte de LD, veiller à ce que les lipides se sont réunis au sommet est resuspendu avant de transférer le PMS.
- Prendre une 100 µL aliquote de la PMS pour analyse de pureté et le placer dans un tube de microcentrifuge froid 1,7 mL. Mettre de coté sur la glace.
- Remplir un tube ultracentrifugeuse à ras bord avec froid 1 x tampon de IE pour empêcher le tube s’effondrer pendant l’ultracentrifugation.
- Équilibrer les échantillons et les centrifuger dans une ultracentrifugeuse à 100 000 x g pendant 60 min à 4 ° C (Figure 1).
- Pour enlever la couche de LD, le tube à un angle de 45° d’inclinaison et utiliser une pipette de verre pour aspirer. Transférer le culot dans un tube de microcentrifuge froid 1,7 mL.
Remarque : Le culot contient ER isolé. Utilisez cette fraction en aval pour l’isolement de l’ER. - Prélever 100 µL de surnageant post-ER (PER) sous la couche lipidique pour analyse de pureté.
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Lavage de LD
- Ajouter 1 x PBS à la fraction de LD recueillie dans un tube de microcentrifuge 1,7, pour un volume total de 1,3 mL.
- Vortex de l’échantillon.
- Centrifuger dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale pendant 5 min à 4 ° C pour granuler les débris cellulaires. Chauffer le tube doucement avec les mains afin de remettre la couche de LD. Transférer le surnageant, y compris la couche lipidique, dans un nouveau tube de microcentrifuge de 1,7 mL.
- Répétez les étapes 1.4.1–1.4.3 2 x x-3, jusqu'à ce que le culot n’est plus visible.
- Ajouter 1 x PBS à la LD exempt de pellet surnageant pour un volume final de 1,5 mL. Laver la fraction lipidique par centrifugation dans un microcentrifuge à vitesse maximale pendant 5 min à 4 ° C.
- Retirer 1 mL de solution de 1 PBS x (en dessous de la couche lipidique) avec une pipette de verre sans déranger la couche lipidique.
- Répétez les étapes 1.4.5 et 1.4.6 4 x x-5, jusqu'à ce que le PBS 1 x est visuellement transparent avec aucune turbidité.
- Supprimer tous les PBS 1 x sous la couche de lipides, à l’aide d’une pipette de verre (Figure 1E).
- Utiliser le résultat, une proportion de LD pur pour analyse en aval.
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Dosage de protéines LD par dosage acide bicinchoninic
Remarque : N’utilisez pas un dosage d’acide bicinchoninic (BCA) si la morphologie LD doit être évaluée.- Resuspendre le LD dans 500 μL de PGPE 5 %.
- Faire bouillir les échantillons pendant 5 min à 95 ° C, vortex et incuber les échantillons à la température ambiante pendant 5 min refroidir.
- Répétez l’étape 1.5.2 un x 2 supplémentaires.
- Laisser agir les échantillons pendant 5 min avec un 30 s on/off cycle, à intensité moyenne.
- Normaliser les échantillons en mesurant la concentration de protéines dans tous les échantillons d’analyse de pureté et de la fraction de LD par dosage de la BCA.
2. isolement de LD à l’aide de gradient de densité de saccharose
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Préparation
- Faire 200 mL de tampon TE (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM EDTA [pH 8.0]). Refroidir en le plaçant sur la glace.
- Faire 100 mL de solution de sucrose à 60 % (p/v) dans un tampon TE dissoudre 60 g de saccharose en tampon TE, ce qui porte le volume final à 100 mL. Refroidir en le plaçant sur la glace.
- Faire 6 mL de solution de sucrose à 40 % (p/v) en ajoutant 4 mL de 60 % de sucrose à 2 mL de tampon TE. Refroidir en le plaçant sur la glace.
- Faire 6 mL de solution de saccharose de 25 % (p/v) en ajoutant 2,5 mL de 60 % de sucrose à 3,5 mL de tampon TE. Refroidir en le plaçant sur la glace.
- Faire 4 mL de solution sucrée 10 % (p/v) en ajoutant 0,7 mL de 60 % de sucrose à 3,3 mL de tampon TE. Refroidir en le plaçant sur la glace.
- Faire 10 mL de solution d’inhibiteur de la protéase et la phosphatase en ajoutant une pastille d’inhibiteurs de la protéase et la phosphatase dans 10 mL de tampon de TE.
- Préparer, tampon homogénat tissulaire en ajoutant 4 mL de solution d’inhibiteur de la protéase et la phosphatase à 50 mL de solution mère 60 % de saccharose. Refroidir en le plaçant sur la glace.
- Préparer, tampon de superposition en ajoutant 2 mL de solution d’inhibiteur de la protéase et de la phosphatase dans 50 mL de tampon de TE. Refroidir en le plaçant sur la glace.
- Préparer 100 mL de solution 1 PBS x en diluant 10 mL de PBS de x 10 dans 90 mL d’eau ultrapure. Refroidir en le plaçant sur la glace.
- Préparer 10 mL de 5 % PGPE en diluant 500 µL du PGPE à 9,5 mL d’eau ultrapure. Utiliser une seringue de 1 mL pour doser comme il est visqueux PGPE. Refroidir en le plaçant sur la glace.
- Refroidir les tubes de centrifugeuse suivants en les plaçant sur la glace : tubes de microcentrifuge de 1,7 mL, tubes à centrifuger 15 mL, tubes de centrifugeuse à grande vitesse de 50 mL et 13 mL ultracentrifugeuse tubes.
- Cool les centrifugeuses nécessaires à 4 ° c : une micro-centrifugeuse, une centrifugeuse de haute capacité (pour les tubes de 15 mL), une centrifugeuse à grande vitesse (pour les tubes de 50 mL) et une ultracentrifugeuse.
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Préparation du tissu
- 1.2.1–1.2.9 étapes permet de préparer le tissu pour l’homogénéisation.
- Ajouter 7 mL de tampon d’homogénat tissulaire froid et il homogénéiser sur glace en déplaçant le pilon et descendre de 20 x. Pendant les cinq premières courses, assurer que le pilon va au fond de l’homogénéisateur.
- Transférer l’homogénat dans un tube à centrifuger froid 15 mL.
- Rincez l’homogénéisateur avec 1 mL de tampon d’homogénat tissulaire froid et transférez-le dans le tube à centrifuger précédemment utilisé 15 mL.
- Porter le volume de l’homogénat jusqu'à 10 mL avec du tampon de l’homogénat tissulaire.
- Centrifuger l’échantillon dans une centrifugeuse de haute capacité à 1 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.
- Transfert 8 mL du surnageant dans un tube à centrifuger 50 mL.
- Transférer 100 µL de surnageant restant comme échantillon PNS pour analyse de pureté.
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Gradient de saccharose
- Incliner le tube de centrifuger de 50 mL contenant les 8 mL de billets à ordre à un angle de 45°. Ajouter avec précaution les 6 mL de solution de sucrose à 40 %, assurant que les deux phases restent séparés.
- De manière similaire, ajouter lentement 6 mL de solution de 25 % de saccharose ; puis, ajouter 4 mL de solution de 10 % de saccharose ; Enfin, ajoutez 8 mL de tampon de superposition.
- Centrifuger l’échantillon dans une centrifugeuse à grande vitesse à 30 000 x g à 4 ° C pendant 30 min.
- Transférer la couche supérieure contenant le LDs dans un tube de microcentrifuge de 1,7 mL.
- Pour le lavage de la LD, suivez les étapes dans la section 1.4.
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Representative Results
Nous avons effectué l’isolement de LD avec le kit ER sur environ 30 souris et comparé les résultats avec ceux qui suivent le protocole d’isolement de saccharose sur environ 40 souris. Les résultats obtenus sont typiques pour les deux protocoles. Souris ont jeûné pendant la nuit avec libre accès à l’eau, pour augmenter le rendement de la LD. Isolement de LD à l’aide d’un gradient de saccharose a été exécuté en parallèle avec le kit ER protocole d’isolement de LD. Échantillons de PNS, PMS, PER, CLD et LDs ont été recueillis dans le kit de ER protocole d’isolement de LD. En raison de la restriction de flux de travail de la protocole d’isolement de saccharose, seulement l’isolat PNS et LD ont été recueillis.
Pour la microscopie de fluorescence, 50 µL de LDs isolées ont été mélangés à un volume égal de 100 µM de 4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene (DPBDI). Des échantillons ont été protégés de la lumière et incubés à température ambiante pendant 30 min. Les échantillons ont été lavés en ajoutant 1 mL de PBS 1 x, suivie à la centrifugation et l’élimination des excès de tampon. De la fraction de la LD, 1 µL a été placé sur une lame de microscope et de la concentration. Représentant 20 x images LD fluorescentes et fond clair ont été prises à la fois l’isolement de kit LD ER et l’isolement de saccharose LD méthodes (Figure 2 a-D), à l’aide d’un microscope de recherche inversée (voir la Table des matières). Les images de fond clair révèlent des niveaux similaires de la matière particulaire, suggérant des puretés similaires en utilisant des protocoles différents.
Pour déterminer les différences de rendement entre les deux protocoles, nous avons utilisé des souris de tailles comparable et le foie de souris (Figure 2EF). Niveaux de purification, LD TG et protéine suivants ont été mesurés à l’aide de tests colorimétriques (voir la Table des matières) et les données ont été normalisées pour le poids du foie (Figure 2H). Nous avons trouvé, quand nous avons normalisé le matériel de départ, que la protéine LD et la TG le rendement après l’isolement LD grâce au kit de ER et saccharose ressemblaient. Pour déterminer si la taille de la LD était aussi similaire, nous avons quantifié les diamètres de LD avec logiciel d’analyse image (voir la Table des matières). LDs varies de 0,27 à 6,37 µm. La distribution des fréquences de diamètre LD montre que l’isolement de kit LD ER (Figure 3 a) et l’isolement de LD de saccharose (Figure 3 b) rendement LDs de tailles similaires.
Pour évaluer la pureté de la LD, les échantillons ont été dosés par immunoblotting. Un montant de 20 µg de protéines par échantillon a été analysé par SDS PAGE. Les échantillons ont été hybridés avec marqueurs d’anticorps pour LDs (PLIN2 et PLIN3), ER (Sec61), (CAVD) les mitochondries, lysosomes (LAMP1), membrane plasmique (MEK1), noyaux (histone H3) et cytosol (GAPDH) (Figure 4 a). PLIN2 a été détecté dans tous les échantillons à l’exception de la trousse ER isolement LD PER et PNS du saccharose. Le LDs dérivé du kit ER isolement LD et le saccharose gradient protocole deux avait une pureté égale. Aucune bande a comparu pour l’ER (Sec61), (VDAC1) les mitochondries, lysosomes (LAMP1), membrane plasmique (Mek1) ou le cytosol (GAPDH). Le CLD a membrane plasmique et contamination du cytosol mais sans contamination apparente de l’ER, les mitochondries ou les lysosomes. L’intensité de la bande de PLIN2 dans le protocole adapté de ER indique que le protocole ER avait environ 14 fois plus élevé PLIN2 expression dans la fraction de la LD contre le PNS, alors que le protocole de saccharose a une expression de PLIN2 six fois plus élevée dans la fraction de LD ( données non présentées).
Parce que ce protocole a également l’option pour purifier les ER et lysosomes, nous avons effectué également éponger occidental pour évaluer la pureté de ces organites. Figure 4 b montre que l’immuno-blot de ER purifiée du même échantillon à l’aide de l’ER nécessaire (voir la Table des matières) n’était pas PLIN2, mais avait des niveaux significatifs de la protéine ER Sec61A. À l’aide de l’enrichissement lysosomal kit (voir la Table des matières), lysosomes ont été isolés et immunoblotted pour marqueurs lysosome (LAMP1) (Figure 4), ER (Sec61A) et LD (PLIN2). Ensemble, ces données montrent que le protocole présenté ici, en combinaison avec les kits de purification lysosome disponibles dans le commerce, permettent d’isoler pur foie LDs, ER et les lysosomes provenant d’un animal unique.
Figure 1 : référencer les photos prises au cours de la Isolement de LD à l’aide d’un kit d’isolation ER . (A) en dés de 5 mm du foie pièces dans une boîte de pétri de 5 cm. (B) homogénat de foie après homogénéisation dans un homogénéisateur Dounce. (C) homogénat de foie après centrifugation à 1 000 x g; noter la couche lipidique légère sur le dessus, des billets à ordre et le culot contenant les débris cellulaires et fraction nucléaire. (D) LD couche après ultracentrifugation à 100 000 x g; noter la couche lipidique proéminent sur le dessus, le rap et la fraction ER sur le fond. Fraction (E) LD lavé avant la suppression définitive de la PBS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : micrographie et analyse quantitative en comparant la fraction de LD isolée avec un kit d’ER et la fraction de LD isolée avec saccharose. Représentant 20 x fluorescent micrographie de (A) une fraction de LD teinté DPBDI isolé avec une trousse d’ER et LDs (B) isolés avec saccharose. (C) fond clair micrographie de la fraction de LD isolé avec un kit de ER et (D) la fraction de LD isolée avec saccharose. La barre d’échelle = 20 µm. (E) poids de la souris et (F) du poids du foie. (G), TG rendement de LDs purifiées normalisé au poids du foie. Protéine (H) rendement de LDs purifiées normalisés au poids du foie. Les données sont moyenne ± SEM (N = 4). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Distribution de fréquence des tailles LD. Échantillons provenant de quatre différentes souris ont été colorées avec DPBDI et représentant 20 x champs ont été quantifiées. Les diamètres ont été mesurés à l’aide d’un logiciel d’analyse image. (A) distribution de fréquences (fraction) d’une fraction de LD isolée à l’aide d’un kit d’ER. (B) distribution de fréquences (fraction) d’une fraction de LD isolée à l’aide de densité de gradient de saccharose. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : analyse de pureté LD par immunoblotting. (A) pour comparer le protocole adapté de l’isolement de kit LD ER et le protocole d’isolement de saccharose, 20 µg de protéines par exemple a été immunoblotted. Les exemples suivants ont été chargées : surnageant post-nucléaire (PNS), surnageant postmitochondrial (PMS), surnageant réticulum postendoplasmic (PER), brut LDs (CLD) et LDs (LD). Des échantillons ont été immunoblotted pour LDs (PLIN2 et PLIN3), ER (SEC61A), les mitochondries (VDAC1), lysosome (LAMP1), membrane cellulaire (MEK1), noyaux (histone H3) et marqueurs de cytosol (GAPDH). (B) analyse de pureté d’une fraction de ER après davantage de purification de l’ER à l’aide de l’isolement de kit LD ER protocole (voir la Table des matières). PNS, PMS, ER et LDs ont été chargés et immunoblotted pour LDs (PLIN2) et ER (SEC61A). (C) analyse de pureté de la fraction lysosomiale après davantage de purification des lysosomes grâce au kit d’enrichissement lysosome protocole (voir la Table des matières). PNS et une fraction lysosomale étaient chargés et immunoblotted pour LDs (PLIN2), ER (SEC61A) et les lysosomes (LAMP1). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Biologie hépatique de LD n’est plus en plus reconnue comme un régulateur critique de physiologie hépatocellulaire dans santé et maladie. Organites de bonne foi, LDs sont dynamiques, interagir avec d’autres structures cellulaires et contiennent au sein des composants bioactifs eux impliqués dans l’homéostasie des lipides et de glucose. Le gradient de saccharose est couramment utilisé pour l’isolement de la LD et permet aux chercheurs d’étudier la structure de la LD, mais aurait besoin de faire de nombreux tampons. Nous avons démontré que l’utilisation d’un kit d’isolation ER disponible dans le commerce est un autre outil qui peut être utilisé pour non seulement LD d’isolement mais pour isoler en tandem ER et lysosome, permettant une vue plus complète de la dynamique cellulaire en réponse aux différentes conditions expérimentales, sans augmentation significative des flux de travail.
La force de ce nouveau protocole est sa facilité d’installation en utilisant commercialement ou réactifs facilement disponibles et sa capacité à isoler plusieurs organites simultanément. Cependant, il y a des inconvénients potentiels de cette nouvelle méthode de garder à l’esprit. Plusieurs étapes dans le présent protocole peuvent désavantager l’isolement de LDs supersized du foie. Dounce homogénéisation a le potentiel de perturber la grandes LDs grâce à la contrainte de cisaillement. Un raccord lâche Dounce homogénéisateur le programme d’installation peut alléger le stress de grandes LDs. en outre, un 100 000 x g spin est employé, ce qui permet la séparation de LD et ER. Cette vitesse peut aussi causer une perte de si grandes, comme le préconise un rapport 2 000 x g pendant de purification du foie LD2. Une des limites de cette procédure sont qu’elle ne peut pas servir à isoler LDs de différentes tailles comme décrit récemment16. En outre, bien que les tampons de saccharose peuvent conserver LDs fragiles intacte grâce à l’utilisation d’homogénéisation doux2, homogénéisant avec 1 tampon de IE x donne LDs pures avec une morphologie semblable et de la distribution de taille comme celles dérivées d’isolement dégradé de saccharose . Autres études seront nécessaires pour déterminer si l’activité biologique est affectée par l’utilisation d’un tampon PBS, qui est moins doux que couramment utilisé des tampons isotonique2. En raison de ces limitations potentielles, il est essentiel pendant les premières étapes de deux centrifugation entièrement remettre en suspension le lipide recueilli dans la partie supérieure avant de transférer le surnageant et déterminer empiriquement l’effet du nombre AVC sur le rendement de la LD pour différentes tissus. Le protocole du foie présenté ici utilise 20 coups, ce qui donne une distribution de taille comparable aux autres travaux publiés2.
Isolement de LD grâce au kit d’isolation de réticulum endoplasmique rendements isolats LD brutes et pures. CLD isolats contiennent la membrane cellulaire et composants de cytosol mais peuvent s’avérer suffisants pour certaines applications, telles que l’évaluation de la morphologie de la LD au microscope. L’isolat pur de LD, tel que déterminé par l’expression PLIN2, manque de ER, mitochondrie, lysosomes, membrane cellulaire ou la contamination du cytosol. En effet, l’isolat pur du kit ER protocole d’isolement de LD enrichit PLIN2 plus du double par rapport à la méthode d’isolement de saccharose LD. Cette différence était inattendue, compte tenu de la similitude en protéines et TG céder, mais peut être due à l’utilisation de PBS comme un tampon de resuspension par opposition au saccharose ou tampon isotonique.
Isolement de LD par les méthodes traditionnelles peut souffrent aussi de contamination de la fraction de LD par la membrane plasmique2. Bien que cet isolement co est commun à toutes les méthodes d’isolement de LD et devrait garder à l’esprit lors de l’analyse LD isolats2, les données présentées ici montrent qu’ultracentrifugation supplémentaire de l’isolat CLD débarrasse l’échantillonnage de ces contaminants ( Figure 4). Futures adaptations peuvent inclure l’utilisation d’une presse Français ou bombe d’azote afin de perturber la membrane cellulaire plus doucement et réduire toute contamination du CLD isoler2.
En conclusion, le kit ER méthode d’isolement de LD est une nouvelle application d’un outil couramment utilisé de biologie cellulaire. Cette méthode effectue de la même façon à l’isolement dégradé de saccharose, avec moins de préparation réactif. En outre, l’inclusion des réactifs préparés dans le kit de ER protocole d’isolement de LD améliore la rigueur et la reproductibilité des conditions expérimentales.
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Disclosures
Dr Carr bénéficie du soutien de la recherche de produits pharmaceutiques d’intercepter.
Acknowledgments
Nous remercions la famille de Abramson Cancer Research Institute. Ce travail est soutenu par les subventions suivantes : NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos Medical Faculty Development Award, 7158, IDOM RDC pilote prix P30 DK019525 (R.M.C.) ; NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Ce travail a été soutenu en partie par le NIH P30-DK050306 et ses installations de base (pathologie moléculaire et Imaging Core, biologie moléculaire/Gene Expression Core et Core de Culture de cellules) et son projet pilote du programme de subventions. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
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