Summary
Этот Протокол устанавливает новый метод изоляции капелька липидов и очистки от мыши печень, используя набор для изоляции устоявшихся эндоплазматического ретикулума.
Abstract
Липидного капель (LDs) являются биологически органеллы в цитозоле наиболее эукариот и некоторые прокариотических клеток. LDs состоят из нейтральных липиды, заключенная в монослое белков и фосфолипидов. Печеночная LD липиды, церамиды, и белки причастны несколько заболеваний, которые вызывают печеночная стеатоз. Хотя предыдущие методы были созданы для изоляции LD, они требуют длительной подготовки реагентов и не предназначены для изоляции несколько субцеллюлярные отсеков. Мы стремились создать новый протокол для включения изоляции LDs, эндоплазматический ретикулум (ER) и лизосом из одной мыши печени.
Кроме того, все реактивы, используемые в протоколе, представленные здесь являются коммерчески доступными и требуют минимальной реагент подготовки без ущерба для LD чистоты. Здесь мы представляем данные сравнения этот новый протокол к стандартным сахарозы градиента протокол, демонстрируя сопоставимых чистоты, морфология и урожайность. Кроме того мы может изолировать ER и лизосомы, с использованием того же образца, обеспечивая подробное понимание формирования и внутриклеточных потока липидов и их связанные белков.
Introduction
LDs являются биологически органеллы в цитозоле наиболее эукариотических клеток и2,некоторые прокариотических клеток в1,3. LD ядро состоит из нейтральные липиды как эфиры холестерина и триглицеридов (ТГ). Они также содержат Церамиды, биоактивных липиды, участвующих в клеточном сигнальных путей4,5. LDs окружены фосфолипидного монослоя и покрытием с белками, включая perilipin белки perilipin 2 (PLIN2) и 3 (PLIN3)1,5,6. Также присутствуют lipogenic ферменты, липазы и мембранных белков людьми, которые были связаны с несколькими steatotic заболеваниях печени, включая безалкогольного наварного заболевания печени, алкогольная болезнь печени и гепатит C3,5 ,6,,78,9,10.
Подуманы, что LDs от внешней мембраны ER и содержат заново синтезированные TG, получены из11ER-производные свободных жирных кислот. Однако, остается неизвестным, ли Объединенные липиды бутон, остаются подключенными, или вырезана из ER6,11, делает изоляцию LDs от технически сложных ER. Свободные жирные кислоты могут быть освобождены от LDs действием поверхности липазы для производства энергии или синтеза мембранных. Кроме того может снизиться LDs через lipophagy механизм регулирования, а также производить свободные жирные кислоты12.
Помимо ER и лизосомы, есть другие органеллы — например, митохондрии, endosomes, пероксисомы и плазматической мембраны — которые находятся в тесной взаимосвязи LDs11. Этот плотный полигамии делает его трудным для выполнения чисто LD добычи. Тем не менее нейтральные липиды врожденной низкой плотности могут быть приняты преимущество через центрифугирования5.
Традиционно LDs были изолированы с помощью сахарозы плотность градиента1,5,13. Однако эти методы не предназначены для изоляции другие органеллы. Кроме того они требуют длительной подготовки реагентов. Этот протокол адаптируется коммерчески доступных ER изоляции комплект (см. Таблицу материалов) для изоляции LD. Мы используем извлечения буфер, предоставленный набор, добавив LD изоляции шаг. Кроме того протокол может также использоваться для ER и лизосомальных изоляции с помощью же образцы, позволяющие более подробное изображение жизненного цикла LDs. Чтобы проверить этот новый метод, мы пробирного выход LD, морфология, размер и чистоты. Мы сравниваем результаты, представленные здесь для тех, кто получил с широко используемый протокол, используя градиент сахарозы для изоляции LD.
Мы использовали 10 к 12-week-old, 20 g, женский C57BL/6 мышь постился 16 h (удаление продовольствия в 5:00 вечера время изоляции LD 9.00) с свободный доступ к воде. Типичный выход для TG 0.6 мг/г печени, и LD белка, это 0,25 мг/г печени. Это обеспечивает достаточно материала для ~ 10 иммуноблотов, SDS-страницы. Протокол ниже подробности реагентов, используемых и протокол для одного 1 g печени. Протокол градиента изоляции сахарозы заимствован из Сато14 и15Ву.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились на лабораторном столе с личного защитного оборудования для биобезопасности уровня 1, включая лаборатории пальто, перчатки и защитные очки. Эксперименты были проведены согласно протоколов, одобренных институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета штата Пенсильвания. Все усилия были сделаны для сведения к минимуму дискомфорт животных, а Животные лечились с гуманной помощи.
1. LD изоляции с помощью набора для изоляции ER
-
Подготовка
Примечание: Перечисленные суммы подходят для одного 1 g мыши печени.- Подготовка 10 мл 1 x изотонический экстракция буферу (IE, из комплекта изоляции ER) путем разбавления 2 мл 5 x IE буфера с 8 мл ультрачистая вода. Прохладный буфера, поместив его на льду.
- Подготовка путем разбавления 10 мл 10 x PBS в 90 мл ультрачистая вода 100 мл 1 x фосфат амортизированное saline (PBS). Охладить его, поместив его на льду.
- Подготовка 10 мл 5% полиэтиленгликоль p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-фенил эфира (PGPE) путем разбавления 500 мкл PGPE в 9,5 мл ультрачистая вода. Используйте 1 мл шприц для измерения из PGPE как это вязка. Охладить его, поместив его на льду.
- Прохладный все трубы, поместив их на льду: трубы microcentrifuge 1,7 мл, 15 мл пробирок, 50 мл высокоскоростной пробирок и 13 мл ультрацентрифуга трубы.
- Прохладный все необходимые центрифуги до 4 ° C: microcentrifuge, высокопроизводительные центрифуги для 15 мл пробирок, Высокоскоростные центрифуги для 50 мл трубки и ультрацентрифугирования.
- Стерилизация автоклавированием щипцы и Рассечение ножницами.
-
Подготовка тканей
- Усыпить мыши, поместив его в камере заполнены с 100% CO2 на 10 мин подтверждение эвтаназии, выполняя шейки матки дислокации.
- Использование стерильный пинцет и Рассечение ножницами, вырезать слои кожи и мышц живота на задней/передней оси подвергать печени.
- Вырежьте связки подключения печени диафрагмой и кишечника. Используйте пинцет, чтобы вытащить кишечника от печени, направлении кзади, подвергать связок.
- Режут между печени и спинной грудную клетку, переходя от впереди кзади до печени высвобождается.
- Передать печени холодной 5 см Петри с 10 мл холодного ПБС.
- Вымойте печени 2 x на качающейся платформе в 10 мл холодного ПБС 5 минут при температуре 4 ° C в 5 см Петри. Слить ПБС после окончательной стирки.
- Используйте стерильные хирургические лезвия размер-10 (см. Таблицу материалы) нарезать печень на куски 3 – 5 мм в 5 см Петри (рис. 1A).
- Мыть кубиками печени 2 x 10 мл холодного ПБС 5 минут при температуре 4 ° C в 5 см Петри.
Примечание: Для изоляции Лизосома, передать гомогенизатор чистой 45 мл 0,5 г печени и следуйте инструкциям, поставляемых лизосома добыча комплект (см. Таблицу материалов). - Декант ПБС и передать холодных 45 мл Dounce гомогенизатор нарезанные кусочки печени. Убедитесь, что все кусочки перейдите к нижней части гомогенизатора.
- Добавление 7 мл холодного 1 x IE буфера (из комплекта изоляции ER) и гомогенизации на льду, перемещая пестик вверх и вниз 20 x. Убедитесь, что толкателем идет к нижней части гомогенизатор во время каждого штриха.
- Передать холодной 15 мл пластиковых пробирок огневки (рис. 1B).
- Промойте гомогенизатор с 1 мл холодного 1 x IE буфера (из комплекта изоляции ER) и добавить в остальной части огневки.
-
LD изоляции
- Удалите ядер центрифугированием огневки в высокопроизводительные центрифуги на 1000 x g 10 мин при температуре 4 ° C (рис. 1 c).
- Передать новый, холодная 50 мл пластиковых пробирок шпагу супернатант (ПНС). Чтобы предотвратить потерю LD, убедитесь, что любой липидов, собрались в верхней части трубки 15 мл высокомобильна перед передачей векселей.
- Взять 100 мкл аликвота векселей для чистоты анализа и поместите его в холодной 1,7 мл microcentrifuge. Отложите на льду.
- Чтобы удалить митохондрий, центрифуга ПНС образца, не Алиготе, в охлажденных высокоскоростной центрифуги на 12000 x g 15 мин при 4 ° C.
- Необязательный: для сырой LD (ХЗЛ) изолятов (загрязненные цитозоле и клеточной мембраны), собирать лучшие липидного слоя с помощью пипетки стеклянные и перенести его на пробки microcentrifuge 1,7 мл. Далее в разделе 1.4.
- Передачи postmitochondrial супернатант (PMS) ультрацентрифуга трубки. Чтобы предотвратить потерю LD, убедитесь, что любой липидов, собрались в верхней высокомобильна перед передачей PMS.
- Взять 100 мкл аликвота ПМС для чистоты анализа и поместите его в холодной 1,7 мл microcentrifuge. Отложите на льду.
- Заполните ультрацентрифуга трубки к brim с холодной 1 x IE буфер для предотвращения трубки, рушится во время ultracentrifugation.
- Баланс образцы и центрифуги их в ультрацентрифуга на 100,000 x g 60 мин при температуре 4 ° C (рис. 1 d).
- Чтобы удалить слой LD, наклона трубы под углом 45° и использовать Пипетки стеклянные для аспирационная. Передать пробки microcentrifuge холодной 1,7 мл гранул.
Примечание: Гранулы содержит изолированные ER. Используйте эту часть по течению для ER изоляции. - Сбор 100 мкл супернатант пост ER (PER) под липидного слоя для чистоты анализа.
-
LD Стиральная
- Добавьте ПБС LD дроби, собранных в 1.7 microcentrifuge трубку, чтобы суммарный объем 1,3 мл.
- Вихрь образца.
- Центрифуга в microcentrifuge за 5 мин при 4 ° C для любой ячейки мусор на гранулах с максимальной скоростью. Теплый трубку осторожно с руки, чтобы помочь Ресуспензируйте LD слой. Передача супернатанта, включая липидного слоя, чтобы новые пробки microcentrifuge 1,7 мл.
- Повторите шаги 1.4.1–1.4.3 2 x x-3, до тех пор, пока гранулы больше не видна.
- Добавьте ПБС в Пелле бесплатно LD супернатанта окончательный объемом 1,5 мл. Вымойте липидная фракция центрифугированием в microcentrifuge на максимальной скорости в течение 5 мин при 4 ° C.
- Удаление 1 мл ПБС (под липидного слоя) с стеклянной пипетки не нарушая липидного слоя.
- Повторите шаги 1.4.5 и 1.4.6 4 x x-5, до тех пор, пока ПБС визуально прозрачный с не мутность.
- Удалить все ПБС ниже липидного слоя, с помощью стеклянной пипетки (Рисунок 1E).
- Используйте результат, чистого долю LD, ниже по течению анализа.
-
LD белка количественный, bicinchoninic кислоты пробирного
Примечание: Не используйте Пробирная bicinchoninic кислоты (BCA) Если LD морфология должна оцениваться.- Ресуспензируйте LD в 500 мкл PGPE 5%.
- Сварить образцы для 5 мин при 95 ° C, вихрь и Проинкубируйте образцы при комнатной температуре на 5 минут для охлаждения.
- Повторите шаг 1.5.2 дополнительные 2 x.
- Sonicate образцы для 5 мин с 30 s/выключения цикла, на средней интенсивности.
- Нормализовать образцов путем измерения концентрации белка во всех пробах анализ чистоты и в LD фракции пробирного BCA.
2. LD изоляции, используя градиент плотности сахарозы
-
Подготовка
- Сделайте 200 мл TE буфера (10 мм трис-HCl [рН 7,4], 1 мм ЭДТА [рН 8,0]). Охладить его, поместив его на льду.
- Сделать 100 мл раствора сахарозы 60% (w/v) в буфере TE, растворяя 60 г сахарозы в TE буфера, в результате чего окончательный объем 100 мл. Охладить его, поместив его на льду.
- Сделайте 6 мл раствора сахарозы 40% (w/v) путем добавления 4 мл 60% сахарозы в 2 мл TE буфера. Охладить его, поместив его на льду.
- Сделайте 6 мл раствора сахарозы 25% (w/v) путем добавления 2,5 мл 60% сахарозы в 3,5 мл TE буфера. Охладить его, поместив его на льду.
- Сделайте 4 мл раствора сахарозы 10% (w/v) путем добавления 0,7 мл 60% сахарозы в 3,3 мл TE буфера. Охладить его, поместив его на льду.
- Сделайте 10 мл раствора ингибитор протеазы и фосфатазы, добавив одну таблетку ингибиторов протеаз и фосфатазы 10 мл TE буфера.
- Подготовка тканей огневки буфера путем добавления 4 мл раствора ингибитор протеазы и фосфатазы 50 мл 60% раствор сахарозы. Охладить его, поместив его на льду.
- Подготовьте оверлея буфера путем добавления 2 мл раствора ингибитор протеазы и фосфатазы 50 мл TE буфера. Охладить его, поместив его на льду.
- Подготовка 100 мл ПБС путем разбавления 10 мл 10 x PBS в 90 мл ультрачистая вода. Охладить его, поместив его на льду.
- Подготовка 10 мл 5% PGPE путем разбавления 500 мкл PGPE в 9,5 мл ультрачистая вода. Используйте 1 мл шприц для измерения из PGPE как это вязка. Охладить его, поместив его на льду.
- Прохладный следующие пробирок, поместив их на льду: трубы microcentrifuge 1,7 мл, 15 мл пробирок, 50 мл высокоскоростной пробирок и 13 мл ультрацентрифуга трубы.
- Прохладный необходимые центрифуги до 4 ° C: в microcentrifuge, высокопроизводительные центрифуги (для 15 мл пробирок), высокоскоростной центрифуги (для 50 мл трубки) и ультрацентрифугирования.
-
Подготовка тканей
- Используйте 1.2.1–1.2.9 шаги для подготовки ткани для гомогенизации.
- Добавление 7 мл холодного ткани огневки буфера и гомогенизации на льду, перемещая пестик вверх и вниз 20 x. В течение первых пяти штрихов убедитесь, что толкателем идет к нижней части гомогенизатора.
- Гомогенат трутневых передать холодной 15 мл пластиковых пробирок.
- Промойте гомогенизатор с 1 мл холодного ткани огневки буфера и перенести его на ранее использовавшихся 15 мл пластиковых пробирок.
- Довести объем огневки до 10 мл с буфером огневки ткани.
- Центрифугуйте образцы в высокопроизводительные центрифуги на 1000 x g 10 мин при 4 ° C.
- Передача 8 мл супернатант 50 мл пластиковых пробирок.
- Передачи 100 мкл оставшиеся супернатанта как ПНС образца для чистоты анализа.
-
Сахароза градиент
- Регулировка пластиковых пробирок 50 мл, содержащие 8 мл ПНС под углом 45°. Аккуратно добавьте 6 мл раствора 40%-ая сахароза, гарантируя два этапа оставаться отдельной.
- Аналогичным образом медленно добавьте 6 мл 25% раствора сахарозы; Затем добавьте 4 мл 10% раствора сахарозы; Наконец добавьте 8 мл буфера оверлея.
- Центрифугуйте образцы в высокоскоростной центрифуги на 30000 x g при 4 ° C за 30 мин.
- Перенести верхний слой, содержащий LDs до 1,7 мл microcentrifuge.
- Для мытья LD, выполните действия, описанные в разделе 1.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы выступали LD изоляции с ER комплект на приблизительно 30 мышей и сравнили результаты с теми, кто после Протокол изоляции сахарозы на приблизительно 40 мышей. Сообщил результаты типичны для обоих протоколов. Мышей были постились ночь со свободным доступом к воде, чтобы увеличить выход LD. LD изоляции с помощью градиента сахароза была параллельно с ER комплект LD Протокол изоляции. Образцы ПНС, PMS, %, расширена и LDs были собраны на протяжении ER комплект LD Протокол изоляции. Из-за ограничений рабочего протокола изоляции сахарозы были собраны только ПНС и LD изолировать.
Для флуоресцентной микроскопии 50 мкл изолированных LDs были смешаны с равным объемом 100 мкм 4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene (DPBDI). Образцы были защищены от света и инкубировали при комнатной температуре за 30 мин. Образцы были смыты, добавив 1 мл ПБС, следуют центрифугирования и удаления избыточных буфера. LD фракции 1 мкл был помещен на микроскопа и coverslipped. Представитель 20 x люминесцентных и brightfield LD изображения были взяты из изоляции комплект LD ER и изоляции сахарозы LD (рисунок 2A-D) методы, с помощью микроскопа Перевернутый исследований (см. Таблицу материалов). Brightfield изображения показывают аналогичные уровни твердых частиц, предлагая аналогичные чистоты, используя различные протоколы.
Чтобы определить различия в урожайности между двумя протоколами, мы использовали сопоставимого размера мыши и мыши печень (Рисунок 2EF). Следующие уровни очистки, LD ТГ и белка были измерены с помощью колориметрических анализов (см. Таблицу материалы), и данные были нормализованы в веса печени (Рисунок 2 gH). Мы нашли, когда мы нормализованный исходный материал, что LD белка и TG выход после LD изоляции с помощью комплекта ER и сахароза были похожи. Чтобы определить, если размер LD также был похож, мы количественно LD диаметров с использованием программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов). LDs варьировались от 0.27 до 6,37 мкм. Распределение частот LD диаметра показывает, что ER комплект LD изоляции (Рисунок 3А) и сахароза LD изоляции (рисунок 3B) выход LDs аналогичных размеров.
Чтобы оценить чистоту LD, образцы дубликатах, immunoblotting. Количество 20 мкг белка на образец был assayed SDS-страницы. Образцы были зондируемой с маркерами антитела для LDs (PLIN2 и PLIN3), ER (Sec61), митохондрии (VDAC), лизосом (LAMP1), плазматической мембраны (MEK1), ядра (гистонов H3) и цитозоле (GAPDH) (рис. 4A). PLIN2 был обнаружен во всех пробах, за исключением ER комплект изоляции LD процентов и сахароза ПНС. LDs производным от ER комплект LD изоляции и сахарозы градиента протокол оба имели равный чистоты. Нет ленты появился для ER (Sec61), митохондрии (VDAC1), лизосом (LAMP1), плазматической мембраны (Mek1) или цитозоле (GAPDH). ЦРМ был плазматической мембраны и цитозоле загрязнение, но нет явного загрязнения от ER, митохондрии или лизосом. Интенсивность PLIN2 группы в протоколе адаптированы ER указывает, что протокол ER выражение приблизительно четырнадцатикратное выше PLIN2 в LD дроби, по сравнению с ПНС, в то время как протокол сахарозы имело шестикратный выше PLIN2 выражение в LD (фракция данные не показаны).
Поскольку этот протокол также имеет опцию для очистки ER и лизосомы, мы также выполняются Западный blotting оценить чистоту эти органеллы. Рисунок 4B показывает, что иммуноблотов очищенный ER от того же образца, используя ER комплекта (см. Таблицу материалов) были свободны от PLIN2 но, обнаружены значительные уровни белка ER Sec61A. С помощью лизосомальных обогащения комплекта (см. Таблицу материалы), лизосомы были дополнительно изолированные и immunoblotted LD (PLIN2), ER (Sec61A) и маркеры Лизосома (LAMP1) (рис. 4 c). Вместе эти данные показывают, что протокол, представленные здесь, в сочетании с коммерчески доступных Лизосома очистки наборы, позволяют для чистого изоляции и печени LDs, ER, лизосомы от одного животного.
Рисунок 1: ссылки на фотографии, сделанные во время LD изоляции с помощью набора для изоляции ER . (A) кубиками 5 мм печени штук в 5 см Петри. (B) огневки печени после гомогенизации в гомогенизатор Dounce. (C) огневки печени после центрифугирования в 1000 x g; Обратите внимание на небольшие липидного слоя на верхней, векселей и гранулы, содержащие ячейки мусор и ядерных дроби. (D) LD слой после ultracentrifugation на 100000 x g; Обратите внимание видных липидного слоя на верхней, процентов и ER дроби на дне. (E) мыть LD фракция до окончательного удаления PBS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Микрофотография и количественный анализ, сравнение LD фракции изолированных с ER комплект и LD фракции изолированных с сахарозой. Представитель 20 x флуоресцентные микрофотография (A) DPBDI-витражи LD фракции изолированных с ER kit и (B) LDs изолированных с сахарозой. (C) Brightfield Микрофотография LD фракции изолированных с ER kit и (D) LD фракции изолированных с сахарозой. В баре шкалы = 20 мыши вес мкм. (E) и (F) вес печени. (G) TG доходность от очищенной LDs, нормализации веса печени. Белка (H) выход из очищенного LDs, нормализации веса печени. Данные являются среднее ± SEM (N = 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Распределение частот размеров LD. Образцы из четырех разных мышей окрашивали DPBDI и представитель 20 x, когда поля были количественно. Диаметры были измерены с помощью программного обеспечения для анализа изображений. (A) распределение частот (фракция) фракции LD, изолированы с помощью ER-kit. (B) распределение частот (фракция) фракции LD, изолированные, с использованием градиента плотности сахарозы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: анализ чистоты LD, immunoblotting. (A) для сравнения адаптированы изоляции комплект LD ER и протокол сахарозы изоляции, 20 мкг белка на образец был immunoblotted. Следующие образцы были загружены: шпагу супернатант (ПНС), postmitochondrial супернатант (PMS), postendoplasmic ретикулума супернатант (пер), сырой LDs (ХЗЛ) и LDs (LD). Образцы были immunoblotted для LDs (PLIN2 и PLIN3), ER (SEC61A), митохондрии (VDAC1), лизосома (LAMP1), клеточной мембраны (MEK1), ядра (гистонов H3) и маркеры цитозоле (GAPDH). (B) анализ чистоты ER фракции после дальнейшей очистки с помощью изоляции комплект LD ER ER протокола (см. Таблицу материалы). ПНС, PMS, ER и LDs были загружены и immunoblotted для LDs (PLIN2) и ER (SEC61A). (C) анализ чистоты лизосомальных фракции после дальнейшей очистки лизосомы, используя комплект для обогащения Лизосома протокола (см. Таблицу материалов). Загружались векселей и небольшая лизосомальных и immunoblotted для LDs (PLIN2), ER (SEC61A) и лизосом (LAMP1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Печеночная LD биологии все чаще признается как критический регулятор гепатоцеллюлярной физиологии в здоровье и болезни. Как bona fide органеллы LDs являются динамическими, взаимодействуют с другими клеточных структур и содержат в них биологически активных компонентов, вовлеченных в гомеостаз глюкозы и липидов. Градиент сахарозы обычно используется для изоляции LD и позволяет следователей для изучения структуры LD, но он требует, чтобы сделать многочисленные буферов. Мы показали, что использование коммерчески доступных комплект изоляции ER является еще одним инструментом, который может использоваться для не только LD изоляции, но и для изоляции тандем ER и Лизосома, позволяя для более полное представление о сотовых динамики в ответ на меняющиеся экспериментальных условиях, без значительного увеличения в рабочем процессе.
Сила этого нового протокола является его простота установки с использованием коммерчески или легко доступных реагентов и его способность изолировать несколько органеллы одновременно. Однако есть потенциальные недостатки этого нового метода, чтобы иметь в виду. Несколько шагов в этом протоколе может недостаток изоляции суперсайзд LDs из печени. Dounce гомогенизации имеет возможность сорвать большой LDs через напряжение сдвига. Слабо фитинг Dounce гомогенизатор установки может облегчить некоторые из стресса для больших LDs. Кроме того, размером 100 x g спина работает, позволяя для разделения LD и ER. Эта скорость может также привести к потере больших LDs, как один доклад рекомендует 2000 x g для очищения печени LD2. Одно ограничение этой процедуры является, что он не может использоваться для изоляции LDs различных размеров как недавно описан16. Кроме того хотя сахарозы буферы можно сохранить хрупкие LDs нетронутыми с помощью нежный гомогенизации2, гомогенизации с 1 x IE буфера дает чистый LDs с аналогичными морфологии и распределение по размеру как производные от сахарозы градиента изоляции . Дальнейшие исследования необходимо будет определить, если биологическая активность зависит от использования PBS буфера, который является менее нежные, чем обычно используются изотонические буферов2. Поскольку эти потенциальные ограничения, важно во время первых шагов две центрифуги полностью Ресуспензируйте липидов, собранные в верхней перед передачей супернатант и эмпирически определить эффект инсульта номер на выход LD для различных тканей. Печени протокола, представленные здесь использует 20 ударов, уступая сопоставимого размера распределение другие опубликованные работы2.
LD изоляции с помощью комплекта изоляции эндоплазматического ретикулума дает как нефти, так и чисто LD изолятов. ХЗЛ изолятов содержат клеточной мембраны и цитозоле компонентов, но может оказаться достаточно для некоторых приложений, таких как оценки морфологии LD с помощью микроскопии. Чистый изолят LD, как определено PLIN2 выражение, не хватает ER, митохондриальных, лизосомных, клеточной мембраны или цитозоль загрязнения. Действительно Чистый изолят из комплекта ER Протокол изоляции LD обогащает PLIN2 более чем вдвое по сравнению с методом изоляции сахарозы LD. Это различие было неожиданным, учитывая схожесть белка и TG доходность, но может быть за счет использования PBS как ресуспендирования буфер в отличие от сахарозы или изотонический буфер.
LD изоляции традиционными методами могут также страдать от загрязнения фракции LD плазматической мембраны2. Хотя это сопредседатель изоляции встречается во всех методов изоляции LD и следует иметь в виду при анализе LD изолятов2, данные, представленные здесь продемонстрировать что дальнейшее ultracentrifugation ХЗЛ изолировать избавляет образец таких загрязнителей ( Рисунок 4). Будущие варианты адаптации могут включать в себя использование французской прессе или азота бомбу, чтобы нарушить клеточные мембраны более нежно и дальнейшего сокращения загрязнения ЦРМ изолировать2.
В заключение ER комплект LD метод изоляции является роман применение инструмента часто используемые клеточной биологии. Этот метод выполняет аналогично сахарозы градиента изоляции, с менее подготовка реагента. Кроме того включение подготовленных реагентов в ER комплект Протокол изоляции LD улучшает строгости и воспроизводимости результатов экспериментальных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Д-р Карр получает поддержку исследований от перехвата Фармацевтика.
Acknowledgments
Мы благодарим Абрамсон семьи рака научно-исследовательский институт. Эта работа поддерживается следующие гранты: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Роберта Вуда Джонсона Фонда, Гарольд Амос медицинский факультет премии в области развития, 7158, IDOM ДРК пилот премии Р30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Эта работа была поддержана в части NIH P30-DK050306 и его основной зал (молекулярной патологии и изображений ядра, молекулярной биологии/ген выражение ядра и ядро культуры клеток) и его пилот грантовой программы. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
- Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
- Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
- Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
- Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
- Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
- Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
- Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
- Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
- Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).
