Summary

Hurtig Lipid Droplet Isolation protokollen ved hjælp af en almindelig Organelle isolering Kit

Published: April 19, 2019
doi:

Summary

Denne protokol fastsætter en roman metode af lipid droplet isolering og oprensning fra mus lever, ved hjælp af en veletableret endoplasmatiske reticulum isolering kit.

Abstract

Lipid dråber (LDs) er bioaktive organelles fundet i cytosol af den mest eukaryote og nogle Prokaryote celler. LDs er sammensat af neutrale lipider indkapslet af en éncellelag af fosfolipider og proteiner. Hepatisk LD lipider, ceramider og proteiner er involveret i flere sygdomme, der forårsager hepatisk steatose. Selvom tidligere metoder er blevet fastlagt for LD isolation, de kræver en tidskrævende forberedelse af reagenser og er ikke beregnet til isolering af flere subcellulært rum. Vi forsøgte at etablere en ny protokol for at aktivere isolering af LDs, endoplasmatiske reticulum (ER) og lysosomer fra en enkelt mus lever.

Yderligere, alle reagenser, der anvendes i den protokol, der præsenteres her er kommercielt tilgængelige og kræver minimal reagens uden at ofre LD renhed. Her præsenterer vi data sammenligner denne nye protokol til en standard saccharose gradient protokol, demonstrere sammenlignelige renhed, morfologi og udbytte. Derudover kan vi isolere ER og lysosomer ved hjælp af den samme prøve, giver detaljeret indsigt i dannelsen og intracellulære flux af lipider og deres tilknyttede proteiner.

Introduction

LDs er bioaktive organelles fundet i cytosol af mest eukaryote celler og nogle Prokaryote celler1,2,3. LD kernen er sammensat af neutrale lipider som triglycerid (TG) og kolesterol estere. De indeholder også ceramider, bioaktive lipider involveret i cellulære signaling veje4,5. LDs er omgivet af en phospholipid éncellelag og belagt med proteiner, herunder perilipin proteiner perilipin 2 (PLIN2) og 3 (PLIN3)1,5,6. Også til stede er lipogenic enzymer, lipaser og membran menneskehandel proteiner, der har været knyttet til flere hepatisk steatotic sygdomme, herunder ikke-alkoholiske fedtlever sygdom, alkoholisk leversygdom og hepatitis C3,5 ,6,7,8,9,10.

LDs menes at danne fra den ydre membran af Skadestuen og indeholde nyligt syntetiserede TG stammer fra ER-afledte frie fedtsyrer11. Men det er stadig ukendt om de poolede lipider bud, forblive tilsluttet, eller er skåret ud fra de ER6,11, at isolationen af LDs gratis fra ER teknisk udfordrende. Frie fedtsyrer kan blive befriet fra LDs ved hjælp af overflade lipaser at fastsaette energiproduktion eller membran syntese. Derudover kan LDs nedbrydes via lipophagy, som en reguleringsmekanisme og producere frie fedtsyrer12.

Udover ER og lysosomer, findes der andre organeller — som mitokondrier, endosomes, peroxisomer og plasmamembran — der findes inden for nære LDs11. Denne stramme polygami gør det vanskeligt at udføre en ren LD udvinding. Imidlertid kan neutral lipider medfødte lav tæthed udnyttes via centrifugering5.

LDs har traditionelt været isoleret ved hjælp af en saccharose tæthed gradient1,5,13. Men disse metoder ikke er designet til at isolere andre organeller. Desuden kræver de tidskrævende forberedelse af reagenser. Denne protokol tilpasser en kommercielt tilgængelig ER isolering kit (Se Tabel af materialer) for at muliggøre LD isolation. Vi bruger ekstraktionsbuffer leveres af kit, tilføje en LD isolation trin. Protokollen kan desuden også bruges til ER og lysosomale isolation ved hjælp af de samme prøver, giver mulighed for en mere omfattende billede af LDs livscyklus. Hvis du vil validere denne nye metode, assay vi LD udbytte, morfologi, størrelse og renhed. Vi sammenligner resultaterne præsenteres her til dem, der opnås med en udbredte protokol udnytter en saccharose gradient til LD isolation.

Vi brugte en 10 til 12-uger gamle, 20 g kvindelige C57BL/6 mus fastede for 16 h (mad fjernelse i 9:00 A.M. LD isolation tid kl) med fri adgang til vand. Det typiske afkast for TG er 0,6 mg/g lever, og for LD protein, det er 0,25 mg/g lever. Dette giver nok materiale til ~ 10 immunoblots af SDS side. Protokollen under detaljer de reagenser og en protokol, der er egnet til en enkelt 1 g lever. Saccharose gradient isolation protokol er tilpasset fra Sato14 og Wu15.

Protocol

Alle eksperimenter blev udført på et laboratoriebænk med personlige værnemidler, der er relevante for Biosikkerhed niveau 1, herunder en laboratoriekittel, handsker og beskyttelsesbriller. Eksperimenter blev udført efter protokoller, godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) fra University of Pennsylvania. Alle bestræbelser var at minimere animalske ubehag, og dyrene blev behandlet med human pleje. 1. LD isolation ved hjælp af en ER isolering kit …

Representative Results

Vi har udført LD isolation ER Kit på ca. 30 mus og sammenlignet resultaterne med dem efter saccharose isolation protokol på ca 40 mus. De rapporterede resultater er typiske for begge protokoller. Mus blev fastede natten med fri adgang til vand, til at øge LD udbyttet. LD isolation ved hjælp af en saccharose gradient blev kørt sideløbende med ER kit LD isolation protokol. Prøver af PNS, PMS, PER, CLDs og LDs blev indsamlet i hele ER kit LD isolation protokol. På grund af arbejdspr…

Discussion

Hepatisk LD biologi anerkendes i stigende grad som en kritisk regulator af hepatocellulært fysiologi i både sundhed og sygdom. Som bona fide organeller, LDs er dynamiske, interagere med andre cellulære strukturer og indeholde inden for dem bioaktive komponenter involveret i både lipid og glukose homøostase. Saccharose gradient bruges rutinemæssigt til LD isolation og gør det muligt for efterforskerne at studere LD struktur, men det kræver dem til at gøre mange buffere. Vi har vist, at brug af et kommercielt tilg…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Abramson familie Cancer Research Institute. Dette arbejde støttes af følgende tilskud: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos medicinske fakultet udvikling Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (JC). Dette arbejde blev delvist understøttet af NIH P30-DK050306 og dens kerne faciliteter (Molekylær Patologi og Imaging Core, molekylær biologi/gen Expression kerne og celle kultur Core) og dens pilot tilskud program. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.

Materials

BioExpress Vortex Mixer GeneMate S-3200-1 Vortex Mixer
Centrifuge 54242 R Eppendorf 54242 R Refrigerated Counter Microcentrifuge
Rotor: FA-45-24-11
Centrifuge Sorvall RC6 + Thermo Scientific RC6+ Refrigerated High Speed Centrifuge
Rotor: F21S-8x50y
Centrifuge Sorvall Legend RT+ Thermo Scientific Legend RT+ Refrigerated High Capacity Centrifuge
Rotor: 75006445 Bucket: 75006441
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich 04 693 116 001 Protease Inhibitor Tablets
Diagenode Bioruptur UCD-200 Diagenode UCD-200 Sonication System
Dounce Tissue Grinder (45 mL) Wheaton 357546 Use Loose pestle
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) Corning 21-031-CM
Endoplasmic Reticulum Isolation Kit Sigma Aldrich ER0100 For ER kit Extraction:
Contains:
Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL
Hypotonic Extraction Buffer 10 mL
Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL
OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL
Blunt Nosed Needle 1 ea.
External light source for flourescent excitation Leica Leica EL6000
Hydrochloric acid Sigma Aldrich H1758 Hydrochloric Acid
ImageJ Image Analysis Software
Inverted Modulating Contrast Microscope Leica Leica DM IRB
Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells Thermo Fisher Scientific 89839 For Lysosome Isolation
Microscope Camera Qimaging QICAM fast 1394
Optima XL-100K Ultracentrifuge Beckman-Coulter XL-100K Ultracentrifuge
Rotor: SW41Ti
Pasteur Pipettes Fisher Scientific 22-042817
Petri Dish 5 cm Fisher Scientific FB0875713A 
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
PhosSTOP Sigma Aldrich 04 906 845 001 Phosphatase Inhibior Tablets
Sterile Surgical Blade #10 Pioneer S2646
Sucrose Fisher Scientific S5-500 Crystalline/Certified ACS
Triglyceride Liquicolor Kit Stanbio  2200-225 Colorimetric Triglyceride kit
Tris Base Fisher Scientific BP152-1 For TE buffer
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151-100 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent
UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) Thermo Fisher Scientific 15575-038 For TE buffer

References

  1. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
  2. Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
  3. Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
  4. Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
  5. Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
  6. Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
  7. Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
  8. Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
  9. Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
  10. Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
  11. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
  12. Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
  13. Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
  14. Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
  15. Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
  16. Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).

Play Video

Cite This Article
Brettschneider, J., Correnti, J. M., Lin, C., Williams, B., Oranu, A., Kuriakose, A., McIver-Jenkins, D., Haba, A., Kaneza, I., Jeon, S., Scorletti, E., Carr, R. M. Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit. J. Vis. Exp. (146), e59290, doi:10.3791/59290 (2019).

View Video