Summary
Dette paper præsenterer en kirurgisk metode til dissekere Drosophila puppe nethinder sammen med protokoller til forarbejdning af væv til immunhistokemi, vestlige analyse og RNA-udvinding.
Abstract
Drosophila puppe nethinden giver en fremragende modelsystem for studiet af morfogenetiske processer under udvikling. I dette papir præsenterer vi en pålidelige protokol til dissektion af den sarte Drosophila puppe nethinden. Vores kirurgisk tilgang udnytter let tilgængelige microdissection værktøjer for at åbne pupper og netop uddrag eye-hjerne komplekser. Disse kan være fast, underkastes Immunhistokemi og nethinder så monteret på objektglas og afbildet hvis målet er at opdage cellulære eller subcellulært strukturer. Alternativt, ikke optagne nethinder kan være isoleret fra hjernevæv, mængden i passende buffere og udnyttet for protein gel elektroforese eller mRNA udvinding (at vurdere protein eller gene expression, henholdsvis). Betydelig øvelse og tålmodighed kan være nødvendigt at beherske microdissection protokollen beskrevet, men når mestret, protokollen giver mulighed for forholdsvis hurtig isolation af hovedsagelig ubeskadigede nethinder.
Introduction
Drosophila nethinden er sammensat af cirka 750 ommatidia omgivet af pigment celler arrangeret i en honeycomb gitter1,2,3,4. Hver ommatidium indeholder otte fotoreceptor neuroner, fire linse-secernerende kegle celler og to primære pigment celler. Omkring hver ommatidium er pigment-producerende gitter celler og sensoriske stritter grupper. På grund af sin post mitotiske natur og stereotype sekskantede arrangement giver Drosophila puppe nethinden en fremragende modelsystem for studiet af morfogenetiske processer herunder celle vedhæftning5,6, 7,8,9,10 og apoptose11,12,13,14,15.
Flere publicerede protokoller udnytter lufttrykket til at udtrække eye-hjerne komplekser fra Drosophila pupper16,17,18. Protokollen beskrevet i stedet udnytter her microdissection værktøjer til omhyggeligt og isolere præcist eye-hjerne komplekser med mål at opnå ubeskadigede retinale væv. Dette er afgørende, hvis nethinder til at blive udnyttet til morfologiske, protein eller genekspression analyserer da skader til nethinder kan resultere i cellulært stress eller død, som kunne ændre den cellulære fænotype eller gen udtryk. Derudover efter praksis, kan 6 til 10 eye-hjerne komplekser være isoleret i 10 til 15 min, at lette mål at minimere variationen i den alder og udviklingsstadiet af dissekerede øjet væv.
Fiksering, immunfarvning og hele-mount protokollen beskrevet nedenfor er velegnet til tilberedning af Drosophila øjne til fluorescerende mikroskopi. Nethinder kan sættes i varmeskab med antistoffer rettet mod proteiner af interesse. For eksempel, kan antistoffer mod adherens junction komponenter udnyttes til at visualisere de apikale omkredse celler, således at egenskaber herunder celletype, form og arrangement kan være vurderet19. Før fiksering, kan øjne i stedet være kløvet fra hjernen med henblik på at udvinde protein til vestlige analyse, eller RNA til brug i qRT-PCR eller RNA-sekvens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. væv forberedelse
- Sæt op Drosophila krydser (som beskrevet tidligere20) eller kultur specifikke Drosophila -stammer for at få pupper af den ønskede genotype. At sikre, at et stort antal pupper opstå tilfældigt, etablere disse flyve kulturer i to eksemplarer på næringsrig mad medier eller standard mad media generøst suppleret med gær-pasta.
- Vedligeholde Drosophila kulturer ved 25 ° C. For krydser udnytte UAS-GAL4 system, er GMR-GAL4 en ideel driver udtrykt i larve øje disc celler posteriort for den morfogenetiske fure og hele puppe udvikling21,22,23, 24. den cross UAS-lacZ X GMR-GAL4 tjener som en ideel kontrol cross som det drev udtryk for ikke-endogene og inert β-galactosidase protein.
- Brug spidsen af en 6" bambus armskinne, der har været våd med destilleret vand til forsigtigt løfte hvid før pupper (figur 1B) fra siden af sund kultur hætteglas (figur 1A) og placere i en 1,5 mL microcentrifuge røret (figur 1 c).
- Sted rør i en plastik pipette tip boks sammen med et lille stykke væv dyppet i destilleret vand til at opretholde kammer ved tilstrækkelig fugtighed til at beskytte pupper fra udtørring (fig. 1 d). Inkuber pupper ved 25 ° C indtil dissektion.
- Bruge en tør 6" bambus armskinne til forsigtigt skubbe pupper ud fra microcentrifuge rør og ind på en sort dissekere parabol. Lå en frisk stykke dobbeltklæbende tape på den dissekere parabol fra pupper.
- Ved hjælp af et par pincet, omhyggeligt placere pupper dorsale side op (dvs. operculums opad, figur 1B) på båndet (figur 2A). Sikre, at pupper hæfter godt til båndet.
Bemærk: Fugt på den puppe sag vil hæmme sikker vedhæftning på båndet, i hvilket tilfælde, tillade pupper blive tør, før du placerer på det dobbeltklæbende tape.
2. dissektion af Eye-hjerne komplekser
- Bruge pincet til at fjerne laag af hver puppe (figur 2 c).
- Bruge microdissection saks til skive eller skære åbne sagen puppe af hver puppe. Klap åben den puppe sag at afsløre hoved, thorax og anterior abdominal segment, sikring af kanterne af puppe sagen til dobbeltsidet tape (figur 2 c).
Bemærk: Det er ikke nødvendigt at helt afsløre pupper. - Gennembore maven af hver puppe med skarpe pincet, at forstå dyret, og fjerne den fra sin puppe sag (figur 2 c).
- Placere pupper på Sort dissektion parabol fra båndet, og dæk med omkring 400 µL af iskold fosfat-buffer-løsning (PBS, pH 7,4).
- Tag fat hver puppe af maven med pincet og microdissection saks, gør en ren tværsnits snit gennem hele brystkassen, skære puppe i halv (figur 2D).
- Fjerne den bageste rest af hver slagtekrop fra PBS og lægge til side på at dissekere parabol (ikke skille sig af med, så se trin 3.2.1).
- Ved hjælp af to par af fine pincet, åbne brystkassen og leder af hver puppe at afsløre eye-hjerne-komplekset (figur 2E). For at gøre dette, forstå cut-kanterne af thorax epitel og gradvist rive for at åbne brystkassen og derefter hovedet kapsel, udsætter det eye-hjerne komplekse og omkringliggende fedtvæv.
- Brug pincet eye-hjerne-komplekset fra resterne af den hoved kapsel eller øse eye-hjerne-komplekset fra revet-lukke op hoved kapsel uden at fatte væv.
Bemærk: Eye-hjerne-komplekset er håndvægt-formet, off-white og mere gennemsigtig end den omkringliggende cremefarvede fedt (figur 2B, E). - Med pincet, forsigtigt fjerne de fleste fedt forbundet med eye-hjerne-komplekser uden at røre øjet væv.
3. behandling af væv til immunfluorescens
- Dissekere mindst 6-10 pupper som beskrevet (trin 2.1-2.9).
Bemærk: Tre uafhængige replikater af hver dissektion tendens til at give tilstrækkelige data til at teste en hypotese. -
Vask og fiksering
- Skær spidsen af et P20 eller P100 pipette spids med en ren barberblad at øge tip-åbning til ~ 1 mm i radius og smøre af pipettering en blanding af PBS og fedt op og ned. Denne fedt kan fås fra slagtet rester fjernes i trin 2.6.
- Overføre eye-hjerne komplekser til ~ 400 µL af PBS i en 9-godt glasfad, på is. Bruge den smurte spids og et P20 eller P100 luft forskydning mikropipette til at overføre.
Bemærk: Eye-hjerne komplekser vil overholde unlubricated tips under pipettering og være beskadiget eller mistet. - Fjerne de resterende fedt forbundet med øjet væv af pipettering PBS op og ned for at forsigtigt swirl eye-hjerne-komplekser. I denne og alle efterfølgende vask skridt og ikke direkte afpipetteres eye-hjerne komplekser op og ned som dette vil skade den skrøbelige øjenvæv.
- Overføre eye-hjerne komplekser i en minimal mængde (< 20 µL) af PBS i mindst 250 µL af fiksativ. Mix af pipettering løsningen op og ned. Ruger i 35 min. på is.
Bemærk: Samme smurt spidsen parat i trin 3.1.1 kan bruges til denne overførsel. - Med den samme pipette tip, overføre eye-hjerne komplekser i et godt indeholdende ~ 400 µL af PBS. Mix af pipettering løsningen op og ned og der inkuberes i 5-10 min på is, at vaske. Gentag trinnet vask mindst to gange.
Bemærk: Eye-hjerne komplekser kan opretholdes i flere timer i den endelige PBS vask, på is eller ved 4 ° C, før du fortsætter til trin 3.3.1.
-
Antistoffarvning
- For at blokere væv inden eksponering for antistof løsninger, skal du overføre eye-hjerne komplekser til ~ 400 µL af PBT. Bruge den smurte spids og et P20 eller P100 luft forskydning mikropipette til overførsel. Der inkuberes i 10 til 60 min, på is.
- Forberede den primære antistof løsning ved at fortynde passende antistoffer i PBT. Da eye-hjerne komplekser inkuberes i 10 µL delprøver af antistof løsning, bliver lydstyrken forberedt en replikat af 10.
- Alikvot 10 µL antistof løsning i en ren brønd af en 72-godt microwell bakke (Se diskussion).
- Skær spidsen af en P10 pipette spids med en ren barberblad at øge tip-åbning til ~0.5 mm i radius og smøre af pipettering PBT op og ned.
- Overfør ikke mere end 5 eye-hjerne komplekser, i et volumen på < 3 µL af PBS, i hver 10 µL godt af antistof løsning ved hjælp af en P10 luft forskydning mikropipette og smurt spidsen.
- Homogeniseres antistof løsning af pipettering løsningen op og ned. Tilsæt ikke eye-hjerne komplekser op og ned, da dette vil skade vævet.
- For at minimere fordampning af antistof løsning, placere et lille stykke væv dyppet i destilleret vand i bakken microwell og forsegle bakken (f.eks. med låg leveres). Der inkuberes natten over ved 4 ° C.
- Overføre eye-hjerne komplekser fra bakken microwell til ~ 400 µL af PBT i en 9-vældede glasfad, at vaske. Bruge en P10 luft forskydning mikropipette og PBT-smurt tip (forberede som beskrevet i trin 3.3.4). Mix af pipettering løsningen op og ned. Inkuber i 5-10 min på is.
- Gentag trinnet vask mindst to gange. Bruge et P20 eller P100 luft forskydning mikropipette og PBT-smurt tip til at overføre eye-hjerne komplekser mellem vask løsninger.
- Forberede sekundær antistof løsning ved at fortynde passende fluorophore-tagged sekundære antistoffer i PBT som krævet. 100 µL af sekundær antistof løsning er tilstrækkelig pr. parti af 6-10 pupper. Alikvot sekundær antistof løsning i en 9-vældede glas dissektion skål.
- Overføre eye-hjerne komplekser til sekundær antistof løsning. Bruge et P20 eller P100 luft forskydning mikropipette og PBT-smurt tip til overførsel.
- Inkuber eye-hjerne komplekser i sekundær antistof løsning for 1-2 timer ved stuetemperatur, eller 3-5 h ved 4 ° C. For at forhindre blegning af fluorophores af lys, dække forberedelse med folie.
Bemærk: Optimale varighed af inkubationen i sekundær antistof løsning kan variere efter de primære og sekundære antistoffer bruges. - Overføre eye-hjerne komplekser til ~ 400 µL af PBT i en 9-godt glasfad, at vaske. Mix af pipettering løsningen op og ned. Inkuber i 5-10 min på is. Denne vask skridt bør gentages mindst to gange.
-
Sekundær fiksation
- For en sekundær fiksation, overføre eye-hjerne komplekser til mindst 200 µL af fiksativ og Ruger i 20 min. ved stuetemperatur eller 35 min. ved 4 ° C.
Bemærk: Sekundær fiksation stivner øjet væv, som aids montering (trin 3.5). - Bruge et P20 eller P100 luft forskydning mikropipette og PBT-smurt tip til at overføre eye-hjerne komplekser til ~ 400 µL af PBT i en 9-godt glasfad, på is, at vaske i 5 min.
- Gentag trinnet vask mindst én gang.
- Brug et P20 eller P100 luft forskydning mikropipette og PBT-smurt tip til at overføre eye-hjerne komplekser til ~ 400 µL af PBS i en 9-godt glasfad, på is, til at skylle for 1-2 min. holde væv i beslutningsforslag af pipettering PBS, men ikke vævet , op og ned for at forhindre eye-hjerne komplekser fra afregning og overholde glasfad under PBS-skyl.
- For en sekundær fiksation, overføre eye-hjerne komplekser til mindst 200 µL af fiksativ og Ruger i 20 min. ved stuetemperatur eller 35 min. ved 4 ° C.
-
Montering
- Overføre eye-hjerne komplekser til ~ 200 µL af montering medier. Bruge et P20 eller P100 luft forskydning mikropipette og PBT-smurt tip til at overføre eye-hjerne-komplekser. Tillad væv til blandingen henstår i montering medier for 1-2 h.
- Placer en 5-8 µL dråbe frisk montering medier på et rent objektglas.
- Skære en P10 spids med en ren barberblad at øge tip-åbning til ~0.5 mm i radius og bruge dette og en P10 luft forskydning mikropipette til at overføre eye-hjerne komplekser i 5-8 µL montering medier til drop af montering medier på diaset.
- Brug to wolfram nåle til at adskille øjnene fra optik fliger. PIN et eye-hjerne kompleks til diaset med en robust wolfram nål og skær hvert øje væk fra dets tilknyttede optik lap med fine tungsten nål (figur 2F).
- Brug fine tungsten nål til at manøvrere hvert øje på overfladen af objektglas med basal overfladen af hvert øje støder op til diaset. Blidt lavere en ren cover-glide over væv og fastgør med neglelak.
Bemærk: At arrangere øjne på diaset, således at de er tæt på hinanden eller i en linje vil lette efterfølgende mikroskopi. - Image nethinder ved hjælp af fluorescerende eller Konfokal mikroskopi.
Bemærk: Dias bør være opbevares ved 4 ° C, hvis ikke afbildet straks.
4. forberedelse af øjet væv til Western Blotting:
- Dissekere 10-16 pupper (trin 2.1-2.9) med følgende ændringer: a) samle og dissekere pupper i to partier, 10-15 min fra hinanden og b) dissekere i PBS suppleret med protease og fosfatase hæmmere (PBS + pi).
- Overføre eye-hjerne komplekser ved hjælp af et P20 eller P100 luft forskydning mikropipette og smurt tip (parat som trin 3.2.1) i ~ 400 µL af PBS + pi i en 9-godt glasfad, på is, til at skylle kort.
Bemærk: Denne smurt tip kan bruges til efterfølgende trin 4.3 og 4.4. - Gentag trinnet skylles to gange.
- Overføre alle eye-hjerne komplekser til ~ 400 µL af is kold PBS + pi dekanteres over på en ren sort dissekere parabol.
- Fjern hvert øje fra optik lapper ved hjælp af en robust wolfram nål (til støt eye-hjerne-komplekset) og et fint barberblad eller microdissection saks renlig sænke hvert øje fra den optiske lap.
Bemærk: Øjne er 'sticky' på dette tidspunkt og kan overholde let at dissekere fadet. Dette er fordelagtigt, da det kan bidrage til at lette fjernelsen af øjne fra den optiske kamre (Se diskussion). - "Feje" alle øjne i en bunke i PBS + pi på dissekere fadet, ved hjælp af et blad af et fint par pincet.
- Skære en P10 spids med en ren barberblad at udvide tip-åbning til ~0.5 mm i radius og smøre tip-interiør af pipettering Western væv Lysis Buffer (WTLB) op og ned.
- Overføre eye-hjerne komplekser i 5 µL af PBS + pi i en 500 µL microcentrifuge rør. Brug denne smurt spids og en P10 luft forskydning mikropipette til at fuldføre overførslen.
- Microcentrifuge røret anbringes på is. Tilføj 1 volumen (5 µL) af WTLB til prøven, og 10 µL af 2 x koncentreret protein prøvebuffer (eller 2,5 µL af 5 x koncentreret protein prøvebuffer). Bland ved at trykke.
- Vortex microcentrifuge tube kort og spin-ned prøve ved hjælp af en desktop mini centrifuge.
- Opbevares prøven ved-20 ° C indtil analyse. Analysere ved hjælp af standard-protokoller.
5. forberedelse af øjet væv til RNA udvinding:
- Iført handsker, ren benchtop, mikroskop, dissektion værktøjer og sort dissekere parabol først med 70% ethanol og derefter RNase dekontaminering reagens. Lad det tørre.
- Dissekere 30-40 pupper som beskrevet (trin 2.1-2.9) med følgende ændringer: en) samles og dissekere 6 til 8 pupper i partier, 15-20 min fra hinanden; b) dissekere i nukleasen-fri PBS og c) isolere hver batch af øjne separat men ophobes alle retinale væv i den samme microcentrifuge tube (trin 5.5).
Bemærk: At have to mennesker dissekere samtidigt vil fremskynde effektiv isolering af gode øjet væv. - For hver batch, isolere eye-hjerne komplekser (trin 2.1-2.9) og overførsel til ~ 400 µL nukleasen-fri PBS i en 9-godt glasfad til at skylle kort, på is, ved hjælp af et P20 eller P100 luft forskydning mikropipette og smurt tip (forberedt som beskrevet i trin 3.1.2).
Bemærk: Denne smurt tip kan bruges til efterfølgende trin 5.4, 5.5 og 5,8. - Gentag trinnet skylles to gange.
- Overføre eye-hjerne komplekser til en frisk 400 µL drop iskold nukleasen-fri PBS på en ren sort dissekere parabol.
- Fjern hvert øje fra optik lapper ved hjælp af en robust wolfram nål (til konstant øje hjernen komplekse) og et fint barberblad eller microdissection saks renlig sænke hvert øje fra den optiske lap.
Bemærk: Øjne er 'sticky' på dette tidspunkt og kan overholde let at dissekere fadet. Dette er fordelagtigt, da det kan bidrage til at lette fjernelsen af øjne fra den optiske kamre (Se diskussion). - "Feje" alle øjne i en bunke i den nukleasen-fri PBS på dissekere fadet, ved hjælp af et blad af et fint par pincet.
- Overføre øjne til en steril RNase-fri microcentrifuge tube og flash-freeze i flydende kvælstof.
- Gentag dissektion (trin 5.3-5.8) af hver batch af pupper. Overføre hver batch af øjne ind i samme microcentrifuge rør, der er blevet opretholdt i flydende kvælstof (trin 5.5) at samle alle øjne i et rør.
- Gemme prøver på-80 ° C indtil RNA udvinding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den puppe eye er et let tilgængeligt væv, der fungerer som en fremragende model til at undersøge udviklingsprocesser at drive morfogenese. Her, vi har dissekeret nethinder og brugt immunofluorescens for at opdage de apikale adherens vejkryds (figur 3A, C) eller Dcp-1-caspase (figur 3D), der er aktiveret under apoptose (figur 3)25. Disse metoder tillader en klart observere celler under nøglen morfogenetiske processer herunder rekruttering og morfogenese af primærelementer (fra 18 h APF), intercalation af gitter celler omkring hver ommatidium (18-24 h APF), etablering af den tertiære niche (21-24 h APF), ændringer i Cellestørrelse og form (fra 18 h til 40 h APF) og apoptose (fra 18 til ~ 33 h APF). Timingen af disse morfogenetiske begivenheder er temperatur afhængige og varierer derfor beskedent i svar til mindre forskelle i inkubator temperaturer i forskellige laboratorium indstillinger. Dog af omkring 40 h APF, den endelige arrangement af celler er normalt opnået (figur 3B, C) og dette er en ideel alder til at vurdere følgerne af genetisk mutation eller ændret genekspression. For eksempel følgende Ektopisk udtryk for Diap1, en kerne hæmmer af apoptose caspase aktivering (figur 3 c)26, vores tilgang gør det muligt at kvantificere den deraf følgende stigning i antallet af gitter celler i forhold til et kontrolelement GMR > lacZ nethinden. Man kan også nemt vurdere apoptose mere direkte ved at udnytte den anti-Dcp-1 antistof eller andre metoder til at opdage døende celler (figur 3D).
Øje lysate kan blive afhørt ved hjælp af vestlige analyse til at bestemme tilstedeværelsen og/eller relative udtryk af proteiner af interesse. Her viser vi påvisning af DE-cadherin, den kernekomponent af adherens vejkryds, i vildtype Canton S nethinder dissekeret på 21 og 40 h APF øjne (figur 4A). Kvantificering af denne prøve vestlige skamplet (højre, figur 4A) afslørede, at den relative udtryk for DE-Cadherin, ikke afviger væsentligt i disse to tidspunkter, når bandet intensitet er normaliseret efter udtryk af GAPDH (en kerne metaboliske enzym). Sådanne analyser vil normalt udføres i tredobbelt i stedet for bare én gang, som vist her.
Det er vigtigt at isolere høj renhed mRNA fra Drosophila puppe nethinder, hvis ens formål er at analysere genekspression ved hjælp af avancerede sekventering programmer (f.eks. Next-Gen, RNA-seq). Vi har fundet, at dissekere mere end 60 øjne pr. genotype eller eksperimenterende tilstand er optimal, hvis ens mål er at isolere > 1 mg af høj kvalitet RNA (figur 4B). Her viser vi et eksempel på en absorbans spektre af et RNA prøve isoleret fra 57 vildtype Canton S øjne, dissekeret på 40 h APF (figur 4B, top panel). Peak absorbans på 260 nm svarer til absorbans bølgelængde af RNA. Vi præsenterer også en tabel afspejler RNA udbytte og A260/A280 og A260/A230 renhed nøgletal af seks RNA prøver, samledes på enten 21 h eller 40 h APF. Disse data afspejler subtile forskelle i RNA udbytte i forbindelse med udvinding RNA.
Figur 1 : Udvalg og kultur af pupper til dissektion. (A) vandrer tredje larve instar (L3) larver og pupper finde langs siderne af sunde Drosophila kulturer. (B) før pupper kan identificeres ved deres gennemskinnelig hvid farve pigment har endnu at blive genereret i den puppe etui. Anterior-posterior og dorsal-ventral akse af puppe er vist med blåt. En fugtig bambus armskinne bruges til at løsne og vælge pre pupper fra hætteglas vægge. (C) pupper er placeret inde i 1,5 mL microcentrifuge rør, der er mærket korrekt (genotype, dato for indsamling, og tidspunktet for indsamlingen) og (D) kulturperler inde en befugtet kammer samlet fra en tom pipette-tip box. Luftfugtigheden opretholdes ved at placere et stykke fugtigt væv inde i kassen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Dissekere den puppe øje. (A) pupper overholdes dobbeltklæbende tape på en sort dissekere parabol. Anterior, posterior, og dorsale koordinater er angivet med blåt. (B) at isolere eye-hjerne komplekser (en enkelt ene er vist her), (C) puppe er først fjernet fra sin puppe sag. Vigtige skridt i denne proces er vist. Røde linjer angiver, hvor at rive og åbne den puppe sagen efter laag er fjernet. Pupper derefter fjernes fra revet puppe tilfældet med pincet. (D) en udsat puppe er først klippe langs brystkassen med microdissection saks (placering er angivet med stiplet rød linje) og hovedet epitel derefter omhyggeligt revet åben (røde pile), som vist i (E) at afsløre uigennemsigtig eye-hjerne-komplekset. (F) efter inkubation med passende antistoffer, nethinder er skåret fra eye-hjerne komplekser. Vigtige skridt i denne proces er vist. Eye-hjerne er stabiliseret med en robust wolfram nål (venstre) og nethinder fjernes med en fin wolfram nål (til højre). For proteiner og RNA analyser, kan ikke optagne nethinder skæres rent fra optik lapper ved hjælp af et fint barberblad eller microdissection saks, snarere end en fine tungsten nål. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Immunfluorescens af puppe øjet. (A) antistoffer mod DE-cadherin etiket apikale adherens kryds af celler i puppe øjet. Alle billeder i panelet A var samlet i den centrale region af en nethinden bruger Konfokal mikroskopi, minimalt modificeret med en billedbehandlingsprogram, og præsenteres på samme skala (skalalinjen = 5 µm). Bemærk vækst og omlægning af celler fra 18 h APF til 27 h APF. (B) tegneserie af den apikale opfattelse af en enkelt fuldt mønstrede ommatidium på 40 h APF (venstre) og en ommatidium i tværsnit. Celletyper er farvekodede som angivet i nøglen. Fotoreceptorer er begravet under overfladen af den pseudostratified neuroepithlium og omgivet af kegle og pigment celler. Tre stritter grupper omgiver hver ommatidium. (C) små områder af en kontrol nethinden i hvilke lacZ blev udtrykt (til venstre) eller Diap1 (højre) til at hæmme apoptose af sekundære og tertiære pigment celler. Mærkning af adherens vejkryds med anti-DE-cadherin muliggør analysen af celle nummer, arrangement og form. Billeder blev fanget ved hjælp af standard fluorescerende mikroskopi. (D) en hele nethinden inkuberes med antistoffer mod aktiveret Dcp-1, en caspase aktiveret under apoptose, som svesker talrige celler fra øjet. Billedet blev taget ved hjælp af Konfokal mikroskopi. Hvide stiplede linje skitserer øjet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Protein og gen expression analyser af den puppe øje. (A) vestlige skamplet (til venstre) af 28 øjne dissekeret på 21 h APF eller 40 h APF, aftestede med antistoffer til nedtrapning cad og som lastning kontrol, GAPDH. Analyser af protein band intensiteter (højre) afslører sammenlignelige koncentrationer af nedtrapning cad til stede i disse grupper af nethinder, i forhold til GAPDH. (B) enkelt absorbans spektrum af et RNA prøve udvundet fra Canton S nethinder dissekeret på 40 h APF (øverst). Bemærk absorbans peak på 260 nm. Tabel dokumenterer beløb og renhed nøgletal af RNA ekstraheret fra Canton S puppe nethinder isoleret på 21 og 40 h APF (nederst). Disse data stammer fra tre uafhængige prøve sæt. Pupper for hver stikprøve blev rejst og inkuberes i de samme betingelser og dissekeret på samme dag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden for Drosophila puppe øje dissektion beskrevet her giver mulighed for dyrkning af 6 til 10 eye-hjerne komplekser i 10 til 15 min. Men tålmodighed og praksis er nødvendig for at beherske dissektion teknik og forbedre kvaliteten og hastigheden af dissektioner. Denne korte dissektion tid sikrer, at hvert øje er ca samme udviklingsmæssige stadie, at reducere variation i fænotype eller gen udtryk for nethinder i et datasæt. Mens alternative protokoller kan kræve mindre praksis at mestre, er vores protokol designet til at metodisk isolere delikat retinale væv og minimere risikoen for at rive eller klipning, fordi skader på øjet kan fremkalde stress aktiveringsvej eller endda celledød. Anbefaler vi begyndere at første master dissektion af pupper kulturperler til 40 h APF før du forsøger at dissekere yngre øjne. Vi anbefaler at oprette replikat krydser for alle eksperimenter (trin 1.1), som vil sikre at der findes altid tilstrækkelig pupper til samling (trin 1.3). Nethinder kan blive dissekeret på en bred vifte af timepoints under puppe udvikling, afhængigt af de forskellige morfogenetiske begivenheder af interesse for forskeren. Disse kan omfatte rekruttering og morfogenese af primærelementer (fra 18 h APF), intercalation af gitter celler (18-24 h APF), etablering af den tertiære niche (21-24 h APF), ændringer i Cellestørrelse og form (fra 18 h til 40 h APF) og apoptose (fra 18 til ~ 33 h APF) (Figur 3A).
Hvis under første åbning af den puppe sag (trin 2.2, fig. 2 c), punkteret thorax af en puppe, bør forskeren stadig kunne fortsætte med dissektion. Men hvis hovedet er i første omgang punkteret, udvinding ubeskadigede eye-hjerne komplekser kan være vanskeligt. Når du fjerner en puppe fra sin puppe sag (trin 2.3, fig. 2 c, højre panel), kan abdominal puppe tilfældet nogle gange løsne fra den dobbeltklæbende tape og forblive ombrudt omkring den puppe maven. Dette er næppe en hindring, selv om puppe kan flyde når omgivet af PBS indtil maven og vedlagt puppe sag er afskåret fra puppe (trin 2.6). For at bevare integriteten af den retinale væv, er det bydende nødvendigt, at det er fast eller frosset så hurtigt som muligt efter den indledende punktering af pupper. Derudover bruger iskold løsninger og opretholde væv på is (eller ved 4 ° C), hvor det er muligt i hele protokollen vil bevare væv og cellulære integritet, hvilket fører til bedre immunofluorescens, protein-analyse eller RNA-analyse. For de sidstnævnte programmer, er det vigtigt at fjerne alle hjernen og fedtvæv fra øjne som disse væv vil forurene analyser (trin 2.9 og 4.3 eller 5.4).
Puppe eye-hjerne-komplekset kan overholde unlubricated pipette tips, glas og dissektion værktøjer når unfixed eller under PBS vasker/skylninger, fører til vævsskader. For at forhindre dette, anbefales omhyggelig smøring af pipette tips og ikke vaske 9-godt glas op med ethanol (opvaskesæbe bør også undgås). I stedet blot rene glas retter med destilleret H2O og smøre, hvis det er nødvendigt med et PBT skylles før anvendelsen. Dissektion pincet, saks og nåle bør også hovedsagelig rengøres med destilleret H2O, undtagen ved udarbejdelsen af disse for RNA-udvinding dissektioner (trin 5.1). Dog kan lys vedhæftning mellem nethinder og glas objektglas bistå i udfolder øjne og Placer dem på dias når adskiller øjne fra optik lapper under montering (trin 3.5.4 og 3.5.5). På samme måde, lys vedhæftning af øjne for sort dissekere retter kan bruges til at flade og meget let stretch i vævet, som letter rent overskæring af eye-optisk lap forbindelser når isolere nethinder for protein eller RNA analyser (trin 4,5 og 5,6). Vi har konstateret, at microdissection saks eller et fint barberblad er fremragende værktøjer til hurtigt og rent spaltes ikke optagne øjne fra optik fliger.
Under primær antistoffarvning, snarere end at inkubere eye-hjerne komplekser i 72-godt mikro-godt bakker (trin 3.3.5), kan en 9-godt glasfad i stedet anvendes. For at forhindre fordampning af antistof løsning natten over, være sikker på at cap glas fad brønde med en cover slip eller dias. Denne tilgang kræver dog 40-50 µL af primære antistof løsning for en batch af 6-10 eye-hjerne komplekser inkuberes i en godt af 9-godt glasfad, snarere end 20 µL af primære antistof løsning fordelt mellem 2 brønde i en 72-godt mikro-godt bakke.
Sekundær fiksation af eye-hjerne komplekser (trin 3,4) før montering øjne på objektglas (trin 3,5) vil marginalt stivne væv, således at det er lettere at kløve øjnene fra optik lapper og øjnene er mindre tilbøjelige til at folde eller overholde dissektion nåle. Efter en 1-2 h inkubation i montering medium (trin 3.5.1) blive eye-hjerne komplekser lidt uigennemsigtig og dermed lettere at se mens montering. Derudover efter 1-2 h i montering medium, vil de fleste sekundære antistoffer beskyttes fra foto-blegning under fluorescerende billeddannelse. Inkubere nethinder overnatning i montering media før montering ikke anbefales, da dette gør nethinder bløde, virkningsløs afstivende virkning af sekundær fiksation.
Vestlige analyser kræves en lysate af mindst 20 øjne at pålideligt registrere proteiner ved hjælp af antistoffer, der håndfast genkende Drosophila proteiner (f.eks. figur 4A). Dog kan et større antal øjne være påkrævet, hvis der er lav udtryk for target proteinet af interesse. Hvis lysering af væv til efterfølgende Western blotting er ufuldstændig (trin 4.7), mængden af WTLB tilsættes prøven kan øges marginalt, og mængden af koncentreret prøvebuffer justeres i overensstemmelse hermed (trin 4.9). For RNA ekstraktion, hurtig dissektion af et betydeligt antal øjne kan være nødvendig hvis målet er at isolere en stor mængde af høj kvalitet RNA (trin 5.2, se figur 4B). Denne potentielle ulempe kan overvindes, hvis to forskere, der har mestret Drosophila puppe-øjne dissektion samarbejder om at dissekere disse stort antal fly nethinder samtidigt. Men det samlede antal RNA kræves vil afhænge af kravene i den institution eller anlæg udfører RNA analyse, typen RNA analyse eller sekventering, og RNA udvinding kit, der er brugt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Zack tromme og vores korrekturlæsere for nyttige kommentarer på manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af R15GM114729.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
References
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
- Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
- Carthew, R. W.
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
- Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647 (2004).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
- Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
- Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
- Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796 (2017).
- Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
- Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
- Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
- Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).
- Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).
- Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008 (2009).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
- Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
- Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
- Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).
