Summary
Avledning av en flavonol er avgjørende for sin anvendelse i helse og næringsmiddelindustrien. Her gir vi en detaljert protokoll for biosyntesen av en flavonol fra en flavanone og diskuterer de avgjørende trinnene og dens fordeler i forhold til andre tilnærminger.
Abstract
Flavonols er en viktig underklasse av flavonoider med en rekke biologiske og farmakologiske aktiviteter. Her gir vi en metode for in vitro enzymatisk syntese av en flavonol. I denne metoden er Atf3h og Atfls1, to viktige gener i den biosyntetiske veien til flavonols, klonet og overexpressed i Escherichia coli. Rekombinant enzymer er renset via en affinitet kolonne og deretter en bienzymatic kaskade er etablert i en bestemt syntetisk buffer. To flavonols er syntetisert i dette systemet som eksempler og bestemmes av TLC og HPLC/LC/MS analyser. Metoden viser åpenbare fordeler i avledning av flavonols over andre tilnærminger. Det er tid-og arbeidsbesparende og svært kostnadseffektiv. Reaksjonen er lett å bli nøyaktig kontrollert og dermed skaleres opp for masseproduksjon. Målet produktet kan renses lett på grunn av de enkle komponentene i systemet. Dette systemet er imidlertid vanligvis begrenset til produksjon av en flavonol fra en flavanone.
Introduction
Flavonols er en viktig underklasse av plante flavonoider og er involvert i plante utvikling og pigmentering1,2,3. Enda viktigere, disse forbindelsene har et bredt spekter av helse-fordelaktig aktiviteter, slik som anti-kreft4,5, anti-oksidativt6, anti-inflammatorisk7, antiobesity8, anti-hypertensive9 , og hukommelse tilbakekalling egenskaper10, som fører til et stort antall studier på disse plante-avledet sekundære metabolitter. Tradisjonelt disse forbindelsene er i hovedsak avledet fra plante utvinning ved hjelp av organiske løsemidler. På grunn av deres svært lave innholdet i planter11,12,13, er produksjonskostnaden for de fleste flavonols fortsatt høy, noe som pålegger store restriksjoner på deres anvendelse i helsevesenet og maten Industrien.
I løpet av de siste ti årene har forskere utviklet ganske mange metoder for å utlede flavonoider14,15. Men, kjemisk syntese av disse kompliserte molekyler besitter en rekke indre ulemper16. Det krever ikke bare giftige reagenser og ekstreme reaksjonsbetingelser, men også mange tiltak for å produsere et mål flavonoid sammensatte14,17. Videre er en annen viktig utfordring i denne strategien den chiral syntesen av aktive flavonoid molekyler. Derfor er det ikke en ideell strategi for å produsere flavonoider i en kommersiell skala via kjemisk syntese16,17.
Nylig har forskere utviklet en lovende alternativ strategi for å produsere disse kompliserte naturlige forbindelser ved tekniske mikrober med en sti for flavonoid biosyntesen18,19,20, 21 priser og , 22, som har vært vellykket tydet i planter23. For eksempel har Duan et al. innført en biosyntetiske vei inn i den spirende gjær Saccharomyces cerevisiae å produsere KAEMPFEROL (KMF)24. Malla et al. produsert astragalin, en glykosylert flavonol, ved å innføreflavanone 3-hydroksylase (F3H), flavonol syntase (fls1), og UDP-glukose: flavonoid 3-O-glucosyltransferase UGT78K1 gener i Escherichia coliBL21 (DE3)17. Selv om det er ganske mange paradigmer, ikke alle genetisk konstruerte mikrober produserer produkter av interesse på grunn av kompleksiteten i en mobil plattform, den uforlikelighet mellom kunstig syntetisert genetiske elementer og verter, den hemmende effekten av mål produkter mot verts celler, og ustabilitet av en konstruert mobilnettet systemet selv16.
En annen lovende alternativ strategi for flavonoid produksjon er å etablere en multienzymatic Cascade in vitro. Cheng et al. har rapportert at enterocin polyketides kan med hell syntetisert ved å samle en komplett enzymatisk vei i en pott25. Denne celle-fri syntetisk strategi omgår restriksjonene av en mikrobiell produksjon fabrikken og dermed er gjennomførbart for å produsere noen flavonoider i store mengder16.
Nylig har vi med hell utviklet en bienzyme syntetisk system for å konvertere naringenin (NRN) til KMF i en pott16. Her beskriver vi dette systemet i flotte detaljer og metoder involvert i å analysere produktene. Vi presenterer også to eksempler som bruker dette systemet til å produsere KMF fra NRN og quercetin (QRC) fra eriodictyol (ERD). I tillegg diskuterer vi avgjørende skritt av denne metoden og fremtidige forsknings retninger i biosyntesen av flavonoider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isoler total RNA fra plante vev26,27
- Homogenisere anlegget vev.
- Samle 100 mg av en frisk plante vev (f. eks, 4-ukers gamle frøplanter fra Arabidopsis thaliana). Frys vevet og en morter og mørtel med flytende nitrogen, etterfulgt av sliping vevet til pulver.
- Tilsett 1 mL RNA isolasjons reagens (se tabell over materialer) i mørtel. Reagens vil fryses umiddelbart. Homogenisere vevsprøven med morter når den frosne reagensene smelter.
- Overfør homogenate til et 1,5-mL rør, sentrifuger prøven ved 12 000 x g i 5 min ved 4 ° c, og Overfør deretter den tomme homogenate løsningen til et annet friskt 1,5-ml rør.
- Ruge den homogenisert prøven ved romtemperatur i 5 min.
- Isoler total RNA.
- Tilsett 0,2 mL kloroform til homogenate, cap røret sikkert, rist røret kraftig for hånd i 15 s, og ruge prøven ved romtemperatur i 5 min.
- Sentrifuger prøven ved 12 000 x g i 15 min ved 4 ° c og overfør den fargeløs øvre vandige fasen til et friskt 1,5-ml rør. Prøven skiller seg inn i tre faser etter sentrifugering.
- Tilsett 0,5 mL isopropylalkohol alkohol til den vandige fasen, rist slangen for hånd på en energisk måte, og ruge blandingen ved romtemperatur i 10 min.
- Sentrifuger blandingen ved 12 000 x g i 10 min ved 4 ° c og fjern supernatanten.
- Vask RNA pellet en gang med 1 mL 75% etanol ved virvlingen, etterfulgt av sentrifugering ved 7 500 x g i 5 min ved 4 ° c.
- Gjenta trinn-1.2.5.
- Lufttørke pellet i 5-10 minutter og redissolve RNA i diethylpyrocarbonate (DEPC)-behandlet vann ved pipettering opp og ned, etterfulgt av å måle den totale RNA-konsentrasjonen med en mikro-spektrofotometer (se tabell over materialer).
2. syntetisere komplementær DNA (cDNA)28
- Syntetisere den første tråden av cDNA ved hjelp av et Kit (se tabell over materialer). Sett opp et 20-μL reaksjons system som vist i tabell 1 og ruge reaksjonsrøret i et PCR-instrument for 50 min ved 42 ° c, etterfulgt av avslutning av reaksjonen ved 85 ° c i 5 min. Oppbevar reaksjons produktet ved-20 ° c for fremtidig forsterkning av gener.
| Reagenser | Volum |
| dNTP mix, 2,5 mM hver | 4,0 μL |
| Primer Mix | 2,0 μL |
| RNA-mal | 1,0 μg |
| Omvendt transkriptase buffer, 5 × | 4,0 μL |
| Omvendt transkriptase, 200 U/μL | 1,0 μL |
| RNase-ledig H2O | opptil 20,0 μL |
Tabell 1: omvendt transkripsjon av total RNA inn cDNA
3. konstruere rekombinant plasmider29
- Design PCR-primere.
- Design PCR-primere ved hjelp av en programvare (se tabell over materialer) basert på sekvenser av viktige enzym gener Hentet fra GenBank databasen og syntetisere den primere av et selskap (se tabell over materialer). I 5 ' slutten av primer, legge til en begrensning enzym området (f. eks BamHi eller Ecori i denne protokollen).
Merk: primere som brukes i denne studien er vist i tabell 2.
- Design PCR-primere ved hjelp av en programvare (se tabell over materialer) basert på sekvenser av viktige enzym gener Hentet fra GenBank databasen og syntetisere den primere av et selskap (se tabell over materialer). I 5 ' slutten av primer, legge til en begrensning enzym området (f. eks BamHi eller Ecori i denne protokollen).
| Sekvens, 5 ' → 3 ' | Formål |
| AAGGATCCATGGCTCCAGGAACTTTGACT | Forward primer for PCR forsterkning av Atf3h Gene fra Arabidopsis thaliana. Bam HI nettstedet er kursiv og vedlagt for kloning i pET32a (+). |
| AAGAATTCCTAAGCGAAGATTTGGTCGA | Omvendt primer for PCR forsterkning av Atf3h Gene fra A. thaliana. Øko RI nettstedet er kursiv og vedlagt for kloning i pET32a (+). |
| AAGGATCCATGGAGGTCGAAAGAGTCCA | Forward primer for PCR forsterkning av Atfls1 Gene fra A. thaliana. Bam HI nettstedet er kursiv og vedlagt for kloning i pET32a (+). |
| AAGAATTCTCAATCCAGAGGAAGTTTAT | Omvendt primer for PCR forsterkning av Atfls1 Gene fra A. thaliana. Øko RI nettstedet er kursiv og vedlagt for kloning i pET32a (+). |
Tabell 2: Oligonukleotid primere som brukes i den aktuelle studien
- Klon genene til et prokaryote uttrykks vektor.
- Forsterk genene fra den første tråden av syntetisert cDNA ved hjelp av et høyverdig DNA-polymerase (se tabell over materialer). Sett opp et 100-μL PCR-reaksjons system som vist i tabell 3 og Kjør følgende PCR-syklus: 94 ° c i 2 min for første denaturering; deretter 35 sykluser på 94 ° c for 30 s for denaturering, 55 ° c i 2 min for annealing og 72 ° c i 1 min for forlengelse; etterfulgt av en endelig forlengelse ved 72 ° c i 10 min. Avkjøl reaksjonsblandingen til 12 ° c.
Merk: forlengelses tiden er variabel og bestemmes av gen lengden med polymerisering på ca. 1000 baser per min for de fleste DNA-polymerases. - Visualiser PCR-produktene (hyppigst 5 μL) på en 1% agarose gel og rens det spesifikke DNA-fragmentet fra de resterende produktene ved hjelp av et oppryddings sett med DNA (se tabell over materialer).
- Fordøye renset DNA fragment og vektoren (f. eks, pET-32A (+)) med begrensning enzymer (f. eks BamHi eller Ecori i denne protokollen). Sett opp et 50-μL reaksjons system i et 0,2 mL PCR-rør som vist i Tabell 4 og ruge blandingen ved 37 ° c i 3 h. Skill det fordøyd DNA på en 1% agarose gel.
- Gjenopprett DNA-båndet ved hjelp av et gelé avsugs sett (se tabell over materialer). Ytterligere rense DNA ved hjelp av en DNA Clean-up Kit (se tabell over materialer), etterfulgt av å måle KONSENTRASJONEN av DNA med en mikro-spektrofotometer (se tabell over materialer).
- Ombinde genet fragment inn i linearized vektoren DNA ved hjelp av en T4 DNA ligase (se tabell over materialer). Sett opp en ligation reaksjon i et 1,5 mL rør som vist i tabell 5 og ruge røret ved romtemperatur for 2-3 h.
Merk: molar forholdet mellom en innsats og en vektor er variabel og varierte fra 3:1 til 10:1. - Tilsett 2,5 μL av ligation blandingen i 50 μL av kjemisk kompetente Escherichia coli celler (f. eks top10 eller DH5α), bland forsiktig, og holde røret på isen i 30 min. varme sjokk cellene ved 42 ° c for 90 s og umiddelbart plassere røret på isen i 2 min.
- Tilsett 200 μL av flytende LB medium uten antibiotika i røret og ruge i en 37 ° c shaker ved 220 RPM for 1 h. spre 50-100 μL av cellene på en LB-plate som inneholder 100 μg/mL Ampicillin og ruge ved 37 ° c over natten.
- Forsterk genene fra den første tråden av syntetisert cDNA ved hjelp av et høyverdig DNA-polymerase (se tabell over materialer). Sett opp et 100-μL PCR-reaksjons system som vist i tabell 3 og Kjør følgende PCR-syklus: 94 ° c i 2 min for første denaturering; deretter 35 sykluser på 94 ° c for 30 s for denaturering, 55 ° c i 2 min for annealing og 72 ° c i 1 min for forlengelse; etterfulgt av en endelig forlengelse ved 72 ° c i 10 min. Avkjøl reaksjonsblandingen til 12 ° c.
| Reagenser | Volum |
| PFU Master mix, 2 × | 50,0 μL |
| Forover primer, 10 μM | 4,0 μL |
| Omvendt primer, 10 μM | 4,0 μL |
| cDNA | 2,0 μL |
| H2O | 40,0 μL |
Tabell 3: oppsett av et PCR reaksjons system
| Reagenser | Volum |
| DNA-fragment/vektor | 3,0 μg |
| Bam hei | 1,0 μL |
| Øko RI | 1,0 μL |
| Cutsmart buffer, 10 × | 5,0 μL |
| H2O | opptil 50,0 μL |
Tabell 4: dobbel fordøyelse av DNA-fragment/vektor
| Reagenser | Volum |
| Sette inn | X μL (0,09 pmol) |
| Vektor | Y μL (0,03 pmol) |
| Ligation buffer, 10 × | 1,0 μL |
| T4 DNA-Ligase, 400 U/μL | 1,0 μL |
| H2O | opptil 10,0 μL |
Tabell 5: ligation av et gen fragment til en linearized vektor
- Screen positive kolonier.
- Vaksinere en enkelt koloni fra LB-platen til 200 μL av flytende LB medium inneholdende 100 μg/mL Ampicillin og ruge ved 37 ° c, 250 RPM for 2-3 h.
Merk: generelt plukke 4-8 kolonier for screening positive kolonier. - Sett opp en 10-μL koloni PCR-reaksjon som ligner på det i trinn 3.2.1.
Merk: Bruk 1 μL av LB-kultur i stedet for 1 μL av cDNA-mal. - Visualiser PCR-produktene på en 1% agarose gel. Vaksinere den resterende kulturen med et positivt resultat i 3 mL flytende LB medium inneholdende 100 mikrogram/mL Ampicillin og ruge i en 37 ° c shaker ved 250 RPM for 14-16 h.
- Isoler plasmider DNA fra rekombinant E. coli kulturer ved hjelp av en plasmider miniprep Kit (se tabell over materialer).
- Identifiser renset rekombinant plasmider ved en dobbel restriksjon enzym analyse (f. eks Bamhi og Ecori i denne protokollen). Sett opp et 10-μL reaksjons system som ligner på det i trinn 3.2.3, etterfulgt av inkubasjons ved 37 ° c for 3 h. Visualiser det spesifikke båndet som ble frigitt fra rekombinant plasmider på 1% agarose gel.
- Vaksinere en enkelt koloni fra LB-platen til 200 μL av flytende LB medium inneholdende 100 μg/mL Ampicillin og ruge ved 37 ° c, 250 RPM for 2-3 h.
- Kontroller sekvensene av positive rekombinant plasmider.
- Send plasmider til et firma for sekvensering. Analyser resultatene ved hjelp av en analyseprogramvare for DNA-sekvens (se tabell over materialer) ved å sammenligne sekvensen Hentet fra sekvensering selskapet med referanse sekvensen Hentet fra GenBank databasen.
4. Express rekombinant enzym proteiner30
- Transformer riktig rekombinant plasmider til kompetent E. coli BL21 (DE3).
- Tilsett 0,1 μL av plasmider til 10 μL av kompetent E. coli BL21 (DE3) i et 1,5-ml rør på is og hold røret på isen i 5 minutter.
- Heat sjokk cellene i en 42 ° c waterbath for 90 s og legg den på is igjen i 2 min.
- Tilsett 200 μL av LB flytende medium uten antibiotika og ruge i en 37 ° c shaker ved 220 RPM i 5 min.
- Spre 50 μL av transformasjon på en LB agar plate som inneholder 100 μg/mL Ampicillin og ruge platen over natten i en 37 ° c inkubator.
- Indusere uttrykk for gener.
- Vaksinere 3-5 kolonier fra platen inn i et rør som inneholder 3 mL LB flytende medium med 100 μg/mL Ampicillin og ruge ved 250 RPM i en 37 ° c shaker over natten.
- Overfør alle over natten kulturen i 300 mL av LB flytende medium som inneholder 100 μg/mL Ampicillin og ruge ved 250 RPM i en 37 ° c shaker til den optiske tettheten av kulturen ved 600 NM er mellom 0,4-0,6.
- Legg isopropylalkohol β-D-thiogalactoside (IPTH) inn i kulturen med en endelig konsentrasjon på 0,2 mM og indusere uttrykk for gener ved 250 RPM, 20-22 ° c for 3 t.
5. rense rekombinant enzymet proteiner31
- Høste bakteriene ved sentrifugering av kulturen ved 4 ° c, 12 000 x g i 10 min.
- Resuspend pellet i 15 mL bakteriell lyse buffer som inneholder 0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 10% glyserol, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 1 μg/mL aprotinin, 1 μg/mL leupeptin, og 1 μg/mL pepstatin i 50 mM Tris-CL (pH 8,0).
- Sonikere av bakteriell suspensjonen for å løsne rekombinant enzym proteiner, etterfulgt av sentrifugering ved 13 000 x g, 4 ° c i 10 min.
- Høste og alikvot supernatanten i 1,5-mL rør ved 1 mL/rør og oppbevar dem ved-70 ° c for fremtidig bruk.
- Påfør 500 μL av hans-tag rensing harpiks (se tabell over materialer) til en gjenbrukbar tomt affinitet kolonne. Vask harpiks med 5 seng volumer av deionisert vann for å forkaste etanol i aksjen løsningen. Balanser harpiks med 10 Bed volumer av bindingen buffer bestående Tris-CL (20 mM, pH 7,9), imidazole (10 mM), og NaCl (0,5 M).
- Påfør 4 mL av supernatanten fra Step 5,4 til en slurry av ovennevnte harpiks og blokker to endene av søylen med propper.
- Ruge blandingen ved 4 ° c på en Rotator ved lav hastighet for 2 timer.
- Vask Fusion protein bundet harpiks med 15 Senge volumer av bindingen buffer ved 4 ° c ved en strømningshastighet på 1 mL/min før eluering.
- Tilsett 500 μL av eluering buffer (inneholder 20 mM Tris-CL (pH 7,9), 500 mM imidazole, 0,5 M NaCl) til kolonnen og ruge slurry ved 4 ° c på en Rotator ved en lav hastighet i 10 min. samle eluent som renset protein prøver.
- Gjenta trinn 5,5 fire ganger til.
- Vask harpiks sekvensielt med 10 Senge volumer av deionisert vann og 3 Senge volumer på 20% etanol. Sug harpiks i 20% etanol. Blokker kolonnen med propper og oppbevar den ved 4 ° c.
- Mål konsentrasjonen av renset proteiner av Bradford protein analysen. Bestem renheten av proteiner på en 10% SDS-side gel og visualisere bandene ved Coomassie blå farging analysen.
- Legg glyserol til renset protein løsning til en endelig konsentrasjon på 10% for å stabilisere enzymet aktivitet. Alikvot og oppbevar den ved-80 ° c.
6. Produser en flavonol fra en flavanone i et in vitro bienzyme syntetisk system16
- Klargjør buffere.
- Lag 2x syntetisk buffer uten jernholdige sulfat bestående av 200 mM Tris-HCl (pH 7,2), 16,4 mM α-ketoglutaric syre, 0,8% natrium ascorbate, og 20% glyserol. Oppløse 1,938 g Tris base, 0,640 g natrium ascorbate, 0,250 g av α-ketoglutaric syre, og 16 mL glyserol til 64 mL deionisert vann. Juster pH til 7,2 ved saltsyre (HCl) og tilsett deionisert vann opp til 80 mL. Oppbevar bufferen ved 4 ° c for fremtidig bruk.
- Lag en 100-lagerløsning på 2 mM jernholdige sulfat. Løs opp 55,6 mg av jernholdige sulfat heptahydrat i 50 mL deionisert vann, rør og tilsett vann opptil 100 mL.
- Lag en lagerløsning på 25 mM flavonoid. Løs opp en flavonoid i metanol grundig og oppbevares ved-20 ° C.
- Sett opp et syntetisk system for å produsere en flavonol fra en flavanone.
- Klargjør det syntetiske systemet som vist i tabell 6.
- Ruge reaksjonen ved 40 ° c i et åpent 2,0-mL rør ved 600 RPM (i en riste varme blokk) for 40 min.
- Avslutt reaksjonen ved å tilsette 10 μL av eddiksyre og 100 μL av etanol.
- To timer senere, overføre de organiske fasene til 1,5-mL rør for lufttørking i en hette ved romtemperatur.
| Reagenser | Volum |
| 2 × syntetisk buffer uten jernholdige sulfat | 50,0 μL |
| 25 mM flavonol | 2,0 μL |
| 2 mM jernholdige sulfat | 0,5 μL |
| 1 mg/mL AtF3H | 2,5 μL |
| 1 mg/mL AtFLS1 | 2,5 μL |
| 25 mM flavanone | 2,0 μL |
| H2O | opptil 100,0 μL |
Tabell 6: det syntetiske systemet som brukes i denne protokollen.
7. analysere reaksjons produkter
- Tynn lag kromatografi (TLC) analyse.
- Pool 5 rør av flavonoid prøvene fra trinn 6.2.4 og ta ut 300 μL for lufttørking. Redissolve det flavonoid pulveret i 160 μL av metanol. Forbered autentiske flavonoid prøver med serie konsentrasjoner på 12,5, 25, 50, 100 og 200 ng/μL i metanol. Legg 1 μL av reaksjons prøvene og de autentiske flavonoid prøvene på polyamid 6 plater.
- Kjør prøve platene i et løsningsmiddel system bestående av kloroform/metanol/maursyre syre i forholdet 5,0:1.5:1,0:0.5.
- Luft tørker platene ved romtemperatur. Spray platene med 1% ethanolic løsning av aluminium klorid (AlCl3), etterfulgt av lufttørking igjen ved romtemperatur.
- Tretti minutter senere, visualisere flekker på platene under et UV-lys på 254 NM og ta bilder.
- Analysere den grå verdien av hvert sted på bildene ved hjelp av en bildebehandling programvare (f. eks, ImageJ v 1.51 J8 i denne protokollen).
- Åpne programvaren ImageJ. Klikk på fil > Åpne for å åpne bildet som skal analyseres.
- Klikk det venstre mest REctangUlar utvalg verktøyet i ImageJ brukergrensesnitt. Skissere regionen av interesse (ROI) i bildet med musen og trykk
for å merke den første avkastningen. - Flytt det rektangulære valget med musen rett til neste ROI, og trykk
for å merke den andre avkastningen. - Gjenta det forrige trinnet for å merke alle andre ROIs.
- Trykk
for å generere profil plott for alle ROIs i et popup-vindu.
Merk: på dette tidspunktet vil den lineære markeringsverktøyet i ImageJ-brukergrensesnittet automatisk aktiveres. - Bruk det lineære markeringsverktøyet til å tegne basis linjer for å definere et lukket område for hver topp av interesse.
- Aktiver tryllestaven Tool ved å klikke på det tilhørende ikonet i ImageJ brukergrensesnitt. Klikk inne i toppen for å vise resultater for alle toppene i et popup-vindu.
- Lag en TLC-basert standard kurve av den autentiske flavonoid ved å plotte de grå verdiene fra trinn 7.1.5.7 mot de tilsvarende flavonoid konsentrasjonene fra trinn 7.1.1. Deretter beregner du avkastningen av flavonoid som produseres i denne protokollen, i henhold til den resulterende formelen.
- Høyytelses flytende kromatografi (HPLC) og flytende kromatografi/masse massespektrometri (LC/MS) analyser
- Behandle prøvene fra trinn 7.1.1 sekvensielt gjennom 0,45 μm og 0,22 μm filtre.
- Legg prøvene i et HPLC/LC/MS-system (se tabell over materialer) og Skill prøvene ved 30 ° c med en C18-kolonne (4,6 × 150 mm; ID, 5 μm). Eluere kolonnen ved 1,0 mL/min ved en stigning på 10-85% (v/v) acetonitril (ACN) i vann (0-10 min., 10-25% ACN; 10-35 min., 25-50% ACN; 35-45 min, 50-85% ACN; 45-50 min, 85-10% ACN; 50-60 min , 10% ACN) og overvåke absorbansen av eluatet fra 200 til 800 NM. Utfør LC/MS-analysen i en negativ ion-modus med en tørking nitrogen strøm på 10 L/min ved 300 ° c og en skjede gass strøm på 7 L/min ved 250 ° c og samle inn data ved hjelp av en innebygd programvare (se tabell over materialer).
- Pakk enkelt bølgelengde kromatografer å beregne topp områder av reaksjons prøver og autentiske flavonoid forbindelser ved hjelp av en programvare (se tabell over materialer).
- Åpne programmet kvalitativ analyse, og klikk fil ≫ åpne data fil. Velg filen (e) som skal analyseres i vinduet Åpne data fil , og klikk Åpne for å åpne filen (e).
- Høyreklikk på musen i vinduet kromatogram Results og deretter Extract Chromatograms i en lokalmeny.
- Åpne dialogboksen Extract Chromatograms . Klikk andre kromatogrammenei type -listen. I kombinasjonsboksen detektor velger du DAD1. Klikk deretter OK for å vise HPLC resultater i vinduet hromatogram resultater .
- Klikk på Mårlig jegntegration ikonet forankret øverst i Chromatogram resultat vinduet. Tegn en grunnlinje for toppen som kreves for manuell integrasjons analyse med musen.
- Klikk vis > Integration peak-listen for å vise resultatene.
- Lag en HPLC-basert standard kurve av den autentiske flavonoid ved å plotte topp områdene fra trinn 7.2.3.5 mot de tilsvarende flavonoid konsentrasjonene fra trinn 7.2.1. Deretter beregner du avkastningen av flavonoid som produseres i denne protokollen, i henhold til den resulterende formelen.
- Analysere MS data for nøyaktig massen av flavonoid forbindelser ved hjelp av en programvare (se tabell over materialer).
- Gjenta trinn 7.2.3.1-7.2.3.3.
- Klikk på område Velg -ikonet på verktøylinjen i Chromatogram Results .
- Velg toppen av interesse. Høyreklikk musen i det merkede området, og klikk Pakk ut MS Spectrum i hurtigmenyen for å vise resultatene i vinduet MS Spectrum Results .
for å merke den første avkastningen.
for å merke den andre avkastningen.
for å generere profil plott for alle ROIs i et popup-vindu.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
F3H og FLS1 er to viktige nøkkel enzymer i konverteringen av en flavanone til en flavonol i planter som vist i figur 1. For å utvikle en in vitro biosyntetiske system for å produsere en flavonol fra en flavanone, Atf3h (GenBank tiltredelse no. NM_ 114983.3) og Atfls1 (GenBank tiltredelse no. NM_ 120951.3) gener ble klonet fra frøplanter av 4-ukers-gamle A. thaliana inn i en prokaryote uttrykk vektor pET-32A (+). Rekombinant plasmider ble forvandlet til E. coli BL21 (DE3) og Fusion proteinene ble uttrykt etter ipth induksjon, etterfulgt av rensing ved hjelp av ni-Ida agarose harpiks. Som vist i figur 2, viste renset Fusion proteiner en høy renhet på over 95% på en 10% SDS-side gel, som var rene nok for etablering av en in vitro bienzymatic Cascade.
Figur 1: skjematisk fremstilling for biosyntesen av en flavonol fra en flavanonein vitro. F3H, flavanone 3-hydroksylase; FLS1, flavonol syntase 1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: rensing av rekombinant AtF3H og AtFLS1 proteiner. Den Atf3h og Atfls1 gener ble klonet fra 4-ukers gamle frøplanter av Arabidopsis thaliana inn i en prokaryote uttrykk vektor pET-32A (+) og uttrykt i Escherichia coli BL21 (DE3). Rekombinant proteiner ble renset gjennom en affinitet kromatografi kolonne fylt med ni-IDA agarose harpiks. Renheten ble bestemt på en 10% SDS-side gel. M, protein markører; 1, rekombinant AtF3H protein; 2, rekombinant AtFLS1 protein. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For å etablere en bienzymatic kaskade ved hjelp av renset rekombinant proteiner, ble et syntetisk system utarbeidet som vist i tabell 6. For å finne ut om dette systemet kan brukes til konvertering av en flavanone til en flavonol, NRN ble lagt inn i systemet, og biosyntesen av KMF ble oppdaget av TLC og HPLC/LC/MS analyser. Som vist i figur 3a, var det to nye prikker på en TLC-plate med polyamid. Ett sted viste en overføringsavstand som ligner på dihydrokaempferol (DHK), og den andre ligner på KMF. Videre analyse av HPLC og LC/MS viste at de nye kjemikaliene viste en oppbevaringstid på 11,91 min. og 20,16 min, henholdsvis (figur 3b) og en kvasi-molekylær ion Peak [M − H]− ved M/z 287,0500 og 285,0500, henholdsvis (figur 3c ), som var identiske med HENHOLDSVIS DHK og KMF. Dataene tyder på at KMF ble produsert fra NRN i dette systemet og avkastningen var så høy som 34,94 mg/L.
Figur 3: syntese av KMF fra NRN i en bienzymatic kaskade. (A) analyse av en-pott reaksjons produkter av polyamid TLC. 1, NRN standard; 2, DHK standard; 3, KMF standard; 4, reaksjons blanding. (B) HPLC analyse profiler av reaksjons produktene. NRN, DHK og KMF viste en oppbevaringstid på henholdsvis 18,74 min, 11,91 min og 20,16 min. (C) MS analyse profiler av flavonoid forbindelser i reaksjonsblandinger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For ytterligere å fastslå om dette in vitro-systemet kan brukes til konvertering av andre flavanones i deres tilsvarende flavonols, ble eriodictyol (ERD) lagt inn i systemet for å avgjøre om ERD kan konverteres til quercetin (QRC). Som vist i figur 4a, viste to nye flekker på en TLC-tallerken en overføringsavstand som ligner på henholdsvis DIHYDROQUERCETIN (DHQ) og QRC. HPLC-og LC/MS-analyser viste at disse nye kjemikaliene avslørte en oppbevaringstid på 10,03 min. og 16,23 min, henholdsvis (figur 4b) og en kvasi-molekylær ion Peak [M − H]− ved M/z 303,1000 og 301,1000, henholdsvis (figur 4c) , som nøyaktig tilsvarte de av DHQ og QRC, henholdsvis. Dataene tyder på at dette systemet kan konvertere ERD til QRC og avkastningen var 25,55 mg/L.
Figur 4: produksjon av QRC fra ERD i et bienzyme syntetisk system. (A) analyse av reaksjons produkter av polyamid TLC. 1, ERD-standard; 2, DHQ standard; 3, QRC standard; 4, reaksjons blanding. (B) HPLC analyse profiler av reaksjons produktene. ERD, DHQ og QRC viste en oppbevaringstid på henholdsvis 15,45 min, 10,03 min og 16,23 min. (C) MS analyse profiler av forbindelsene i reaksjonsblandinger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ganske mange studier er fokusert på avledning av flavonols på grunn av deres potensielle anvendelse i helsevesenet og næringsmiddelindustrien. Men, tradisjonelle plante utvinning ved hjelp av organiske løsemidler og kjemisk syntese besitter indre ulemper, som begrenser deres bruk i produksjon av flavonols. Her rapporterer vi en detaljert metode for å produsere en flavonol fra en flavanone i en pott ved å etablere en in vitro bienzymatic kaskade. De kritiske trinnene i denne protokollen er: 1) å få rene rekombinant enzymer med høy aktivitet og 2) etablere en en-pott bienzymatic reaksjon Cascade. Generelt sett, uttrykk for plante-avledet gener i bakterier foretrekker å danne inkludering kroppen, noe som vil føre til tap av enzym aktivitet. Som vi vet, noen peptider, som TrxA og SUMO, bidra til å forbedre uttrykket og løselighet av rekombinant proteiner uttrykt i bakterier16. Derfor vil det være nyttig å klone mål gener i plasmider inneholder disse uttrykk koder, for eksempel pET-32A (+) og pET SUMO (trinn 3.2.3). Det er velkjent at IPTH konsentrasjon og induksjon temperatur er ytterligere to viktige parametre som påvirker løselighet av prokaryotically uttrykt proteiner16. For ytterligere å redusere dannelsen av inkludering kroppen, IPTH konsentrasjon og induksjon temperatur bør optimaliseres. Den optimale IPTH konsentrasjon og induksjon temperatur avhenger i hovedsak av den type plasmider og bakterier stammer. I denne protokollen er IPTH konsentrasjon og induksjon temperatur optimalisert ved 0,2 mM og 20-22 ° c, henholdsvis (trinn 4.2.3). I tillegg, temperatur og glyserol er to viktige parametre for å opprettholde stabilitet og aktivitet ved rensing og lagring av rekombinant enzymer. I denne protokollen er det avgjørende å rense rekombinant proteiner ved 4 ° c (trinn 5,5-5,12), tilsett 10% glyserol i løsningen av renset enzymer (trinn 5,13), og umiddelbart alikvot og lagre løsningen ved-80 ° c (trinn 5,13). I etableringen av en en-pott reaksjon kaskade, pH og temperatur er to vitale parametre. Det er åpenbart at for høy pH er skadelig for konverteringen fordi jernholdige ioner (Fe2 +), en nødvendig komponent for enzymet aktiviteten til rekombinant F3H og FLS116,32,33, er utløst av danner en slurry av jernholdige natriumhydroksid under en slik tilstand. Selv om en relativt høyere temperatur forenkler fremdriften av en enzym-katalysert reaksjon, vil for høy temperatur deaktivere enzymet. Derfor er det avgjørende for konverteringen å stabilisere pH og reaksjonstemperatur. Vår forrige utgivelse setter den optimale pH og temperatur på 7,2 og 40 ° c, henholdsvis (trinn 6)16.
Denne protokollen kan enkelt endres for å biosynthesize en rekke flavonols fra ulike flavanones ved hjelp av ulike underlag. I denne protokollen finnes det to eksempler. Som vist i Figur 3, når du legger til NRN som et substrat i dette systemet, ble det produsert nye kjemikalier. TLC-og HPLC/LC/MS-analysene tyder på at de nye kjemikaliene var DHK og KMF, og NRN ble omdannet til KMF i dette systemet. For ytterligere å styrke tilliten til resultatene, Spectral karakterisering av 1H NMR (hydrogen-1 kjernefysisk magnetisk resonans), 13C NMR (Carbon-13 kjernefysisk MAGNETISK resonans), NOESY (Nuclear Overhauser Effect spektroskopi), XRD (røntgen pulver Diffraksjon), CHN analysator og lignende kan være nødvendig å bevitne tilstedeværelsen av kjemikalier i en ny enhet. På samme måte kan ERD bli vellykket konvertert til QRC i denne bienzymatic Cascade (Figur 4).
Det er en viktig begrensning for denne metoden. Ifølge den kjente biosyntetiske veien av flavonoider, en flavonol kan produseres av dette systemet fra en aromatisk aminosyre eller dens nedstrøms derivater. For eksempel kan KMF produseres fra p-coumaric acid av en rekke viktige enzymer, inkludert 4-Coumaroyl: COA-LIGASE (4CL), kalkon SYNTASE (CHS), kalkon ISOMERASE (Chi), F3H og FLS23. Tilsvarende kan QRC produseres fra caffeic syre ved hjelp av samme panel av viktige enzymer (upubliserte data). Imidlertid, koenzym A (CoA), ATP, og manonyl-CoA nød å bli inkludert inne systemet å konvertere p-coumaric syren i KMF, hvilke ville høyeste forhøye det produksjon bekostning. Derfor er dette systemet vanligvis begrenset til å konvertere en flavanone til en dihydroflavonol eller en flavonol. I tillegg er fullstendig konvertering av Start materiale en annen utfordring. For ytterligere å forbedre effektiviteten i dette systemet, bør fremtidig forskning være fokusert på screening nøkkel enzymer med høy aktivitet fra andre planter, mutasjon av gener som koder nøkkel enzymer, immobilisering av de svært aktive enzymer til inert bærere, og utvikling av et bedre buffer system.
Dette en-pott bienzyme syntetisk system besitter åpenbare indre fordeler fremfor andre tilnærminger for å produsere en flavonol, slik som kjemisk syntese, mikrobiell celle fabrikk, og plante utvinning ved hjelp av organiske løsemidler16. For det første er reaksjonstiden svært kort og trenger bare 40 min, så dette produksjonssystemet er arbeids-og tidsbesparende. Dernest er det ingen kompliserte fysiologiske regulering i dette systemet som skjedde i den mikrobielle celle fabrikken og dessuten, alle komponenter er klare. Derfor er det lett å kontrollere reaksjonen nøyaktig og dermed praktisk å gjøre ytterligere optimalisering i fremtiden. For det tredje, siden denne reaksjonen systemet inneholder bare enkle kjemikalier og renset rekombinant enzymer og bare genererer en større mellomliggende som vist i Figur 3 og Figur 4, er det forventet at det er lettere å rense målet molekyler generert i dette systemet enn de fra celle fabrikker og planter. Det fjerde, de viktigste komponentene i systemet er vanlige og billige kjemikalier og prokaryotically uttrykt rekombinant enzymer, så det er svært kostnadseffektivt for denne metoden for å utlede ønsket flavonoider. Femte, på grunn av enkelheten av komponentene i dette systemet, er det lett å skalere opp for masseproduksjon av målet flavonoider, som indikerer en enorm industrialisering potensial. I tillegg gir dette systemet en veiledning for økonomisk produksjon av andre sekundære metabolitter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble økonomisk støttet av Yangzhou University spesial-utnevnt professor oppstart Funds, Jiangsu spesiallaget professor start-up midler, Six talent Peaks Project i Jiangsu Province (Grant no. 2014-SWYY-016), og et prosjekt finansiert av den prioriterte akademiske program utvikling av Jiangsu høyere utdanningsinstitusjoner (Veterinary Medicine). Vi takker testing Center of Yangzhou University for HPLC og MS analyser av flavonoider.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
References
- Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).
- Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development. European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).
- Cui, B., et al. Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods. Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).
- Li, X., et al. A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).
- Kim, H., et al. Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells. International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).
- Kimura, H., et al. Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME). Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).
- Cassidy, A., et al. Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).
- Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats. Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).
- Serban, M. C., et al. Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).
- Nakagawa, T., et al. Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients. Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).
- Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis. Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).
- Agar, O. T., et al. Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey. Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).
- Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).
- Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T.
- Lu, Y. H., et al. Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl). Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).
- Zhang, Z., et al. Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).
- Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).
- Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).
- Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).
- Miyahisa, I., et al. Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).
- Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).
- Koopman, F., et al. De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).
- Winkel-Shirley, B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).
- Duan, L., et al. Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).
- Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S.
- Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. Preparation of RNA from plant tissue using trizol. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Directional cloning into plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Halbwirth, H., et al. Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).
- Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).
