Summary
Afledningen af en flavonol er afgørende for dens anvendelse i sundhedssektoren og fødevareindustrien. Her giver vi en detaljeret protokol for biosyntesen af en flavonol fra en flavanonglucosid og diskuterer de afgørende skridt og dens fordele i forhold til andre tilgange.
Abstract
Flavonoler er en stor under klasse af flavonoider med en række biologiske og farmakologiske aktiviteter. Her, vi giver en metode til in vitro enzymatiske syntese af en flavonol. I denne metode, Atf3h og Atfls1, to vigtige gener i den biosyntetiske vej af flavonoler, er klonet og overudtrykt i Escherichia coli. De rekombinante enzymer renses via en affinitets kolonne, og derefter etableres en bienzymatisk kaskade i en specifik syntetisk buffer. To flavonoler syntetiseres i dette system som eksempler og bestemmes af TLC og HPLC/LC/MS analyser. Metoden viser indlysende fordele i afledningen af flavonoler over andre tilgange. Det er tid-og arbejdsbesparende og meget omkostningseffektiv. Reaktionen er let at blive præcist kontrolleret og dermed opskaleret til masseproduktion. Målproduktet kan renses let på grund af de enkle komponenter i systemet. Men dette system er normalt begrænset til produktion af en flavonol fra en flavanone.
Introduction
Flavonoler er en stor under klasse af plante flavonoider og er involveret i plante udvikling og pigmentering1,2,3. Endnu vigtigere, disse forbindelser besidder en bred vifte af sundheds-gavnlige aktiviteter, såsom anti-cancer4,5, anti-oxidativ6, anti-inflammatorisk7, anti fedme8, anti-hypertensive9 og hukommelse Recall egenskaber10, hvilket fører til et stort antal undersøgelser af disse plante afledte sekundære metabolitter. Traditionelt er disse forbindelser hovedsageligt afledt af plante ekstraktion med organiske opløsningsmidler. Men på grund af deres meget lave indhold i planter11,12,13, produktionsomkostningerne for de fleste flavonoler fortsat høj, hvilket indebærer store begrænsninger på deres anvendelse i sundhedssektoren og fødevarer Industri.
I løbet af de seneste årtier, forskere har udviklet en hel række metoder til at udlede flavonoider14,15. Men, kemisk syntese af disse komplicerede molekyler besidder en række iboende ulemper16. Det kræver ikke kun giftige reagenser og ekstreme reaktionsbetingelser, men også mange skridt til at producere et mål flavonoid sammensatte14,17. Desuden er en anden vigtig udfordring i denne strategi er den chirale syntese af aktive flavonoid molekyler. Derfor er det ikke en ideel strategi at producere flavonoider i kommerciel målestok via kemisk syntese16,17.
For nylig har forskerne udviklet en lovende alternativ strategi for at producere disse komplicerede naturlige forbindelser ved hjælp af tekniske mikrober med en vej for flavonoid biosyntese18,19,20, 21 , 22, som med succes er blevet dechiseret i planter23. F. eks. indførte Duan et al. en biosyntetisk vej ind i den spirende gær Saccharomyces cerevisiae til fremstilling af kaempferol (kmf)24. Malla et al. produceret astragalin, en glykosyleret flavonol, ved at introducereflavanonglucosid 3-hydroxylase (f3h), flavonol syntase (fls1), og UDP-glucose: flavonoid 3-O-glucosyltransferase UGT78K1 gener i Escherichia coliBL21 (DE3)17. Selv om der er en hel del paradigmer, ikke alle genetisk manipulerede mikrober producere produkter af interesse på grund af kompleksiteten af en cellulære platform, uforenelighed mellem kunstigt syntetiserede genetiske elementer og værter, den hæmmende effekt af Target produkter mod værtsceller, og ustabilitet af en manipuleret cellulære system selv16.
En anden lovende alternativ strategi for flavonoid produktion er at etablere en multienzymatisk kaskade in vitro. Cheng et al. har rapporteret, at enterocin polyketides kan med succes syntetiseres ved at samle en komplet enzymatisk pathway i en pot25. Denne celle frie syntetiske strategi omgår begrænsningerne af en mikrobiel produktionsfabrik og er dermed gennemførlig til at producere nogle flavonoider i store mængder16.
For nylig har vi med succes udviklet et bienzym syntetisk system til at konvertere naringenin (NRN) til KMF i en pot16. Her beskriver vi dette system i store detaljer og de metoder, der er involveret i at analysere produkterne. Vi præsenterer også to eksempler, der bruger dette system til at producere KMF fra NRN og quercetin (QRC) fra eriodictyol (ERD). Derudover diskuterer vi vigtige trin i denne metode og fremtidige forskningsretninger i biosyntesen af flavonoider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isoler totalt RNA fra plantevæv26,27
- Homogenisere plante vævet.
- Saml 100 mg af et frisk plantevæv (f. eks. 4-ugers gamle frøplanter fra Arabidopsis thaliana). Fryse vævet og en Pestle og mørtel med flydende nitrogen, efterfulgt af slibning af vævet i pulver.
- Tilsæt 1 mL RNA-isolations reagens (Se tabel over materialer) til mørtel. Reagenset vil straks blive frosset. Vævsprøven homogeniseres med Pestle, når den frosne reagens smelter.
- Homogeniseres til et 1,5 mL rør, centrifugeres prøven ved 12.000 x g i 5 minutter ved 4 °c, og derefter overføres den fortoldede homogeni opløsning til et andet frisk 1,5 ml rør.
- Den homogeniserede prøve inkubates ved stuetemperatur i 5 minutter.
- Isoler total RNA.
- Tilsæt 0,2 mL chloroform til homogenatet, hætte røret forsvarligt, ryst røret kraftigt i hånden i 15 s, og Inkuber prøven ved stuetemperatur i 5 min.
- Prøven centrifugeres ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4 °c, og den farveløs øvre vandig fase overføres til et frisk 1,5-ml rør. Prøven opdeles i tre faser efter centrifugering.
- Tilsæt 0,5 mL isopropylalkohol til den vandige fase, ryst røret med hånden på en energisk måde, og Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Blandingen centrifugeres ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 °c, og supernatanten fjernes.
- RNA-piller vaskes én gang med 1 mL 75% ethanol af vortexing, efterfulgt af centrifugering ved 7.500 x g i 5 minutter ved 4 °c.
- Gentag trin 1.2.5.
- Luft tør pellet i 5-10 minutter og genopløs RNA i diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandlet vand ved pipettering op og ned, efterfulgt af måling af den totale RNA-koncentration med et mikro-Spektrofotometer (Se tabel over materialer).
2. syntetisere komplementært DNA (cDNA)28
- Syntetisere den første streng af cDNA ved hjælp af et kit (Se tabel over materialer). Der oprettes et 20-μL-reaktionssystem som vist i tabel 1 , og reaktionsrøret inkubates i et PCR-instrument til 50 min ved 42 °c efterfulgt af en afslutning af reaktionen ved 85 °c i 5 min. Opbevar reaktionsproduktet ved-20 °c ved fremtidig forstærkning af gener.
| Reagenser | Volumen |
| dNTP mix, 2.5 mM hver | 4,0 μL |
| Primer mix | 2,0 μL |
| RNA-skabelon | 1,0 μg |
| Reverse transkriptase buffer, 5 × | 4,0 μL |
| Revers transkriptase, 200 U/μL | 1,0 μL |
| RNase-fri H2O | op til 20,0 μL |
Tabel 1: omvendt transskription af totalt RNA til cDNA
3. Konstruer rekombinant plasmider29
- Design PCR Primers.
- Design PCR primere ved hjælp af en software (Se tabel over materialer) baseret på sekvenser af centrale enzym gener opnået fra genbank databasen og syntetisere primere af en virksomhed (Se tabel over materialer). I 5 ' enden af primer tilsættes et Begrænsnings enzym websted (f. eks. Bamhi eller Ecori i denne protokol).
Bemærk: de primere, der anvendes i dette studie, er vist i tabel 2.
- Design PCR primere ved hjælp af en software (Se tabel over materialer) baseret på sekvenser af centrale enzym gener opnået fra genbank databasen og syntetisere primere af en virksomhed (Se tabel over materialer). I 5 ' enden af primer tilsættes et Begrænsnings enzym websted (f. eks. Bamhi eller Ecori i denne protokol).
| Sekvens, 5 ' → 3 ' | Formål |
| AAggatccatggctccaggaactttgact | Forward primer til PCR amplifikation af Atf3h gen fra Arabidopsis thaliana. Bam HI site er kursiseret og fastgjort til kloning i pET32a (+). |
| AAGaattcctaagcgaagatttggtcga | Reverse primer til PCR amplifikation af Atf3h gen fra A. thaliana. Øko RI site er kursiseret og fastgjort til kloning i pET32a (+). |
| AAGgatccatggaggtcgaaagagtcca | Forward primer til PCR amplifikation af Atfls1 gen fra A. thaliana. Bam HI site er kursiseret og fastgjort til kloning i pET32a (+). |
| AAGaattctcaatccagaggaagtttat | Reverse primer til PCR amplifikation af Atfls1 gen fra A. thaliana. Øko RI site er kursiseret og fastgjort til kloning i pET32a (+). |
Tabel 2: Oligonukleotidprimere anvendt i den aktuelle undersøgelse
- Klon gener i en prokaryote Expression vektor.
- Amplificere generne fra den første streng af den syntetiserede cDNA ved hjælp af en high-fidelity DNA Polymerase (Se tabel over materialer). Indstil et 100-μL PCR-reaktionssystem som vist i tabel 3 , og Kør følgende PCR-cyklus: 94 °c i 2 min for Initial denaturering; derefter 35 cyklusser af 94 °C for 30 s til denaturering, 55 °C i 2 min for annealing og 72 °C for 1 min for forlængelse; efterfulgt af en sidste forlængelse ved 72 °C i 10 min. afkøles reaktionsblandingen til 12 °C.
Bemærk: forlængelses tiden er variabel og bestemmes af genlængden med polymerisering på ca. 1000 baser pr. minut for de fleste DNA-polymeraser. - Visualiser PCR-produkterne (oftest 5 μL) på en 1% agopstået gel, og rens det specifikke DNA-fragment fra de resterende produkter ved hjælp af et DNA-oprydnings Kit (Se tabel over materialer).
- Fordøje det rensede DNA-fragment og vektoren (f. eks. pET-32a (+)) med begrænsnings enzymer (f. eks. Bamhi eller Ecori i denne protokol). Der oprettes et 50-μL-reaktionssystem i et 0,2 mL PCR-rør som vist i tabel 4 , og blandingen inkubates ved 37 °c i 3 timer. Adskil det Ford ØJEDE DNA på en 1% agopstået gel.
- Gendan DNA-båndet ved hjælp af et gel ekstraktions udstyr (Se tabel over materialer). Yderligere rensning af DNA ved hjælp af et DNA-oprydnings Kit (Se tabel over materialer), efterfulgt af måling af DNA-koncentrationen med et mikro-Spektrofotometer (Se tabel over materialer).
- Ligate genfragmentet i det lineariserede vektor-DNA ved hjælp af en T4-DNA-ubiquitinligase (Se tabel over materialer). Der opsættes en ligations reaktion i et 1,5 mL-rør som vist i tabel 5 , og røret inkubes ved stuetemperatur i 2-3 h.
Bemærk: molær forholdet mellem en indsats og en vektor er variabel og varierede fra 3:1 til 10:1. - Tilsæt 2,5 μL af ligations blandingen til 50 μL af kemisk kompetente Escherichia coli -celler (f. eks. top10 eller DH5α), bland forsigtigt, og hold røret på is i 30 min. Opvarm cellerne ved 42 °c for 90 s, og Anbring straks røret på is i 2 minutter.
- Tilsæt 200 μL flydende LB-medium uden antibiotika i røret og Inkuber røret i en 37 °C shaker ved 220 rpm for 1 h. Spred 50-100 μL af cellerne på en LB-plade, der indeholder 100 μg/mL ampicillin og Inkuber ved 37 °C natten over.
- Amplificere generne fra den første streng af den syntetiserede cDNA ved hjælp af en high-fidelity DNA Polymerase (Se tabel over materialer). Indstil et 100-μL PCR-reaktionssystem som vist i tabel 3 , og Kør følgende PCR-cyklus: 94 °c i 2 min for Initial denaturering; derefter 35 cyklusser af 94 °C for 30 s til denaturering, 55 °C i 2 min for annealing og 72 °C for 1 min for forlængelse; efterfulgt af en sidste forlængelse ved 72 °C i 10 min. afkøles reaktionsblandingen til 12 °C.
| Reagenser | Volumen |
| PFU Master Mix, 2 × | 50,0 μL |
| Fremad primer, 10 μM | 4,0 μL |
| Omvendt primer, 10 μM | 4,0 μL |
| cDNA | 2,0 μL |
| H2O | 40,0 μL |
Tabel 3: Opsætning af et PCR-reaktionssystem
| Reagenser | Volumen |
| DNA-fragment/vektor | 3,0 μg |
| Bam Hej | 1,0 μL |
| Øko Ri | 1,0 μL |
| Cutsmart buffer, 10 × | 5,0 μL |
| H2O | op til 50,0 μL |
Tabel 4: dobbelt fordøjelse af et DNA-fragment/vektor
| Reagenser | Volumen |
| Indsætte | X μL (0,09 pmol) |
| Vektor | Y μL (0,03 pmol) |
| Ligations buffer, 10 × | 1,0 μL |
| T4 DNA-Ligase, 400 U/μL | 1,0 μL |
| H2O | op til 10,0 μL |
Tabel 5: ligering af et gen-fragment til en lineariseret vektor
- Skærm positive kolonier.
- Der inokuleres en enkelt koloni fra LB-pladen til 200 μL flydende LB-medium indeholdende 100 μg/mL ampicillin og Inkuber ved 37 °C, 250 rpm for 2-3 h.
Bemærk: i almindelighed, plukke 4-8 kolonier til screening positive kolonier. - Oprette en 10-μL koloni PCR-reaktion svarende til den i trin 3.2.1.
Bemærk: Brug 1 μL LB-kultur i stedet for 1 μL cDNA-skabelon. - Visualiser PCR-produkterne på en 1% agopstået gel. Den resterende kultur inokuleres med et positivt resultat i 3 mL flydende LB-medium indeholdende 100 μg/mL ampicillin og Inkuber i en 37 °C shaker ved 250 rpm for 14-16 h.
- Isoler plasmid-DNA fra rekombinante E. coli -kulturer ved hjælp af et plasmid miniprep-Kit (Se tabel over materialer).
- Identificer de rensede rekombinante plasmider ved en dobbelt begrænsnings enzym analyse (f. eks. BamHi og Ecori i denne protokol). Indstil et 10-μL reaktionssystem svarende til det i trin 3.2.3, efterfulgt af inkubation ved 37 °C i 3 timer. Visualiser det specifikke bånd, der frigives fra det rekombinante plasmid på en 1% agopstået gel.
- Der inokuleres en enkelt koloni fra LB-pladen til 200 μL flydende LB-medium indeholdende 100 μg/mL ampicillin og Inkuber ved 37 °C, 250 rpm for 2-3 h.
- Kontrollere sekvenser af positive rekombinant Plasmids.
- Send plasmiderne til en virksomhed til sekvensering. Analysér resultaterne ved hjælp af en DNA-Sekvensanalyse software (Se tabel over materialer) ved at sammenligne sekvensen opnået fra sekventering Company med reference sekvensen opnået fra genbank databasen.
4. ekspres rekombinante enzym proteiner30
- Det korrekte rekombinante plasmid omdannes til kompetente E. coli BL21 (DE3).
- Tilsæt 0,1 μL plasmid til 10 μL af den kompetente E. coli BL21 (DE3) i et 1,5 ml rør på is, og hold røret på is i 5 minutter.
- Varmechok cellerne i en 42 °C vandbad for 90 s og Placer det på is igen i 2 min.
- Tilsæt 200 μL LB flydende medium uden antibiotika og Inkuber i en 37 °C shaker ved 220 rpm i 5 min.
- Der spredes 50 μL omdannelse på en LB-agar plade indeholdende 100 μg/mL ampicillin og Inkubér pladen natten over i en 37 °C inkubator.
- Inducere ekspression af gener.
- 3-5 kolonier fra pladen ind i et rør, der indeholder 3 mL LB-væske medium med 100 μg/mL ampicillin og Inkuber ved 250 rpm i en 37 °C shaker natten over.
- Overføre hele natten kultur til 300 mL LB flydende medium indeholdende 100 μg/mL ampicillin og inkubere ved 250 rpm i en 37 °C shaker indtil den optiske tæthed af kulturen ved 600 nm er mellem 0,4-0,6.
- Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) tilsættes til kulturen med en slutkoncentration på 0,2 mM og inducerer generne ved 250 rpm, 20-22 °C i 3 timer.
5. rensning af de rekombinante enzym proteiner31
- Høst bakterierne ved centrifugering af kulturen ved 4 °C, 12.000 x g i 10 min.
- Resuspension af pellet i 15 mL bakteriel lyse buffer indeholdende 0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 1 μg/mL aprotinin, 1 μg/mL leupeptin, og 1 μg/mL pepstatin i 50 mM Tris-CL (pH 8,0).
- Den bakterielle suspension sonigeres for at frigive de rekombinante enzym proteiner, efterfulgt af centrifugering ved 13.000 x g, 4 °c i 10 min.
- Høst og alikvot supernatanten i 1,5 mL rør ved 1 mL/rør og opbevar dem ved-70 °C til fremtidig brug.
- Påfør 500 μL af hans-tag rensning harpiks (Se tabel over materialer) til en genanvendelige tomme affinitet kolonne. Harpiksen vaskes med 5 senge volumener af deioniseret vand for at kassere ethanol i stamopløsningen. Vægten afbalancerer harpiks med 10 senge volumener af bindings bufferen bestående af Tris-CL (20 mM, pH 7,9), imidazol (10 mM) og NaCl (0,5 M).
- Påfør 4 mL af supernatanten fra trin 5,4 til en opslæmning af ovennævnte harpiks, og Blokér to ender af søjlen med propper.
- Blandingen inkubates ved 4 °C på en rotator ved lav hastighed i 2 timer.
- Den fusionsprotein bundne harpiks vaskes med 15 senge volumener af bindings bufferen ved 4 °C ved en strømningshastighed på 1 mL/min før eluering.
- Tilsæt 500 μL elueringsbuffer (indeholdende 20 mM Tris-CL (pH 7,9), 500 mM imidazol, 0,5 M NaCl) til søjlen og Inkubér opslæmningen ved 4 °C på en rotator ved lav hastighed i 10 min. Saml elueringsprøven som oprenset protein prøver.
- Gentag trin 5,5 fire gange mere.
- Harpiksen vaskes sekventielt med 10 senge volumener af deioniseret vand og 3 senge mængder på 20% ethanol. Læg harpiks i blød i 20% ethanol. Bloker kolonnen med propper, og opbevar den ved 4 °C.
- Mål koncentrationen af de rensede proteiner ved Bradford protein assay. Bestem renheden af proteinerne på en 10% SDS-SIDERS gel og Visualiser båndene ved Coomassie blå farvnings analyse.
- Tilsæt glycerol til den oprensede proteinopløsning til en endelig koncentration på 10% for at stabilisere enzymaktiviteten. Og opbevar den ved-80 °C.
6. Fremstil en flavonol fra en flavanonglucosid i et in vitro bienzym syntetisk system16
- Forbered buffere.
- Lav 2x syntetisk buffer uden jernholdige sulfat bestående af 200 mM Tris-HCl (pH 7,2), 16,4 mM α-ketoglusyre, 0,8% natriumascorbat og 20% glycerol. 1,938 g Tris base opløses, 0,640 g natriumascorbat, 0,250 g α-ketoglusyre og 16 mL glycerol til 64 mL deioniseret vand. Justér pH til 7,2 med saltsyre (HCl), og tilsæt deioniseret vand op til 80 mL. Opbevar bufferen ved 4 °C til fremtidig brug.
- Lav en 100x stamopløsning af 2 mM jernholdige sulfat. 55,6 mg ferrosulfat heptahydrat opløses i 50 mL deioniseret vand, omrøres og tilsættes vand op til 100 mL.
- Lav en bestand opløsning af 25 mM flavonoid. En flavonoid opløses i methanol grundigt og opbevares ved-20 ° C.
- Oprette et syntetisk system til at producere en flavonol fra en flavanone.
- Klargør det syntetiske system som vist i tabel 6.
- Reaktionen inkubates ved 40 °C i et åbent 2,0-mL rør ved 600 rpm (i en ryste varmeblok) i 40 min.
- Reaktionen afsluttes ved tilsætning af 10 μL eddikesyre og 100 μL ethylacetat.
- To timer senere overføres de organiske faser til 1,5 mL-rør til lufttørring i en hætte ved stuetemperatur.
| Reagenser | Volumen |
| 2 × syntetisk buffer uden jernholdige sulfat | 50,0 μL |
| 25 mM flavonol | 2,0 μL |
| 2 mM ferrosulfat | 0,5 μL |
| 1 mg/mL AtF3H | 2,5 μL |
| 1 mg/mL AtFLS1 | 2,5 μL |
| 25 mm flavanonglucosid | 2,0 μL |
| H2O | op til 100,0 μL |
Tabel 6: det syntetiske system, der anvendes i denne protokol.
7. Analysér reaktionsprodukterne
- Analyse af tyndtlagkromatografi (TLC).
- Pool 5 rør af flavonoide prøver fra trin 6.2.4 og tage 300 μL til lufttørring. Det flavonoide pulver opløses i 160 μL methanol. De autentiske flavonoid-prøver forberedes med serie koncentrationer på 12,5, 25, 50, 100 og 200 ng/μL i methanol. 1 μL af reaktions prøverne og de autentiske flavonoide prøver belastes på polyamid 6 plader.
- De prøve belastede plader køres i et opløsningsmiddelsystem bestående af chloroform/methanol/ethylacetat/myresyre i et forhold på 5,0:1,5:1,0:0,5.
- Lufttørre pladerne ved stuetemperatur. Pladerne sprøjtes med 1% ethanolisk opløsning af aluminiumchlorid (AlCl3), efterfulgt af lufttørring igen ved stuetemperatur.
- Tredive minutter senere, visualisere pletter på pladerne under et UV-lys på 254 nm og tage billeder.
- Analysér den grå værdi af hvert sted på billederne ved hjælp af en billedbehandlings software (f. eks. ImageJ v 1.51 J8 i denne protokol).
- Åbn softwaren ImageJ. Klik på filer > Åbn for at åbne det billede, der skal analyseres.
- Klik på det venstre, mest Rectang - markeringsværktøj i ImageJ-brugergrænsefladen. Skitsere interesseområdet (ROI) i billedet med musen og tryk
for at mærke det første Roi. - Flyt den rektangulære markering med musen til højre for den næste ROI
, og tryk på for at mærke det andet Roi. - Gentag det forrige trin for at mærke alle andre ROIs.
- Tryk
for at generere profil plot for alle Rois i et pop-up vindue.
Bemærk: på dette tidspunkt vil det lige linje markeringsværktøj i ImageJ-brugergrænsefladen automatisk blive aktiveret. - Brug det lige linje markeringsværktøj til at tegne grundlinjer, så du kan definere et lukket område for hvert højdepunkt.
- Aktivér stav værktøjet ved at klikke på det tilsvarende ikon i ImageJ-brugergrænsefladen. Klik inden i toppen for at få vist resultater for alle toppe i et pop op-vindue.
- Lav en TLC-baseret standardkurve af det autentiske flavonoid ved at plotte de grå værdier fra trin 7.1.5.7 mod de tilsvarende flavonoid-koncentrationer fra trin 7.1.1. Derefter beregnes udbyttet af flavonoid af interesse produceret i denne protokol i henhold til den resulterende formel.
- Analyse af højtydende væskekromatografi (HPLC) og væskekromatografi/massespektrometri (LC/MS)
- Behandl prøverne fra trin 7.1.1 sekventielt gennem 0,45 μm-og 0,22 μm-filtre.
- Prøverne indlà ¦ ses i et HPLC/LC/MS-system (Se tabel over materialer), og prøverne adskilles ved 30 °c ved anvendelse af en C18-kolonne (4,6 × 150 mm; id, 5 μm). Elute kolonnen med 1,0 mL/min med en gradient på 10-85% (v/v) acetonitril (ACN) i vand (0-10 min, 10-25% ACN; 10-35 min, 25-50% ACN; 35-45 min, 50-85% ACN; 45-50 min, 85-10% ACN; 50-60 min , 10% ACN) og monitorere eluatens absorbans fra 200 til 800 nm. Udfør LC/MS-analysen i en negativ ion-tilstand med en tørring af nitrogenstrømmen på 10 L/min ved 300 °C og en kappe gasstrøm på 7 L/min ved 250 °C, og Indsaml data ved hjælp af en indbygget software (Se tabel over materialer).
- Uddrag enkelt bølgelængde kromatografer til at beregne peak områder af reaktions prøver og autentiske flavonoid forbindelser ved hjælp af en software (Se tabel over materialer).
- Åbn det kvalitative analyseprogram, og klik på filer > Åbn datafil. Vælg den eller de filer, der skal analyseres, i vinduet Åbn datafil , og klik på Åbn for at åbne filen (e).
- Højreklik på musen i chromatogram Resultatbaseret vinduet og derefter EXtract Chromatograms i en pop-up-menu.
- Åbn dialogboksen EXtract Chromatograms . Klik på andre kromatogrammerpå listen type . I kombinationsboksen detektor skal du vælge DAD1. Klik derefter på OK for at få vist HPLC-resultaterne i vinduet Chromatogram Results .
- Klik på ikonet MAnnual INTEGRATION forankret øverst i vinduet Chromatogram Results . Tegn en basislinje for den spidsbelastning, der kræves til manuel integrations analyse med musen.
- Klik på vis ≫ integrations Topliste for at få vist resultaterne.
- Lav en HPLC-baseret standardkurve over det autentiske flavonoid ved at plotte spids områderne fra trin 7.2.3.5 mod de tilsvarende flavonoid-koncentrationer fra trin 7.2.1. Derefter beregnes udbyttet af flavonoid af interesse produceret i denne protokol i henhold til den resulterende formel.
- Analysere MS data for den nøjagtige masse af flavonoid forbindelser ved hjælp af en software (Se tabel over materialer).
- Gentag trin 7.2.3.1-7.2.3.3.
- Klik på ikonet Range Select på værktøjslinjen Chromatogram Results .
- Vælg den højeste rente. Højreklik på musen i det valgte område, og klik på ekstraktet MS Spectrum i pop-up-menuen for at vise resultaterne i MS Spectrum resultater vindue.
for at mærke det første Roi.
, og tryk på for at mærke det andet Roi.
for at generere profil plot for alle Rois i et pop-up vindue.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
F3H og FLS1 er to vigtige nøgle enzymer i omdannelsen af en flavanonglucosid til en flavonol i planter som vist i figur 1. At udvikle et in vitro biosyntetisk system til fremstilling af en flavonol fra en flavanone, Atf3h (genbank tiltraedelsesnr. NM_ 114983.3) og Atfls1 (genbanks tiltraedelsesnr. Nm_ 120951.3) gener blev klonet fra frøplanterne af 4-ugers-gamle A. thaliana i en prokaryote udtryk vektor pET-32a (+). De rekombinante plasmider blev omdannet til E. coli BL21 (DE3), og fusions proteinerne blev udtrykt efter iptg-induktion, efterfulgt af rensning med ni-Ida agopstået harpiks. Som vist i figur 2viste de rensede fusions proteiner en høj renhed på over 95% på en 10% SDS-siders gel, som var ren nok til at etablere en in vitro bienzymatisk kaskade.
Figur 1: skematisk repræsentation for biosyntesen af en flavonol fra en flavanonglucosidin vitro. F3H, flavanonglucosid 3-hydroxylase; FLS1, flavonol syntase 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: rensning af rekombinant AtF3H og AtFLS1 proteiner. Atf3h og Atfls1 gener blev klonet fra 4-ugers gamle frøplanter af Arabidopsis thaliana i en prokaryote Expression vektor pET-32a (+) og udtrykt i Escherichia coli BL21 (DE3). De rekombinante proteiner blev renset gennem en affinitets kromatografikolonne fyldt med ni-IDA agopstået harpiks. Renheden blev fastlagt på en 10% SDS-SIDERS gel. M, protein markører; 1, rekombinant AtF3H protein; 2, rekombinant AtFLS1 protein. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
For at etablere en bienzymatisk kaskade ved hjælp af de rensede rekombinante proteiner blev der fremstillet et syntetisk system som vist i tabel 6. For at afgøre, om dette system kan anvendes til omdannelse af en flavanonglucosid til en flavonol, blev NRN tilføjet til systemet, og biosyntesen af kmf blev påvist af TLC og HPLC/LC/MS analyser. Som vist i figur 3aopstod der to nye pletter på en POLYAMID TLC-plade. Et sted viste en migrations afstand svarende til dihydrokaempferol (DHK) og den anden, der ligner KMF. Yderligere analyse af HPLC og LC/MS viste, at de nye kemikalier viste en retentions tid på henholdsvis 11,91 min og 20,16 min (figur 3b) og en kvasimolekylær ion peak [M − H]− ved M/z 287,0500 og 285,0500 (figur 3c ), som var identiske med henholdsvis DHK og KMF. Dataene indikerer, at KMF blev fremstillet af NRN i dette system, og at udbyttet var så højt som 34,94 mg/L.
Figur 3: syntese af KMF fra NRN i en bienzymatisk kaskade. A) analyse af en-pot-reaktionsprodukter fra POLYAMID TLC. 1, NRN standard; 2, DHK standard; 3, KMF-standard; 4, reaktionsblanding. B) HPLC-analyse profiler for reaktionsprodukterne. NRN, DHK og KMF viste en retentions tid på henholdsvis 18,74 min, 11,91 min og 20,16 min. C) MS-analyse profiler af flavonoide forbindelser i reaktions blandingerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
For yderligere at afgøre, om dette in vitro-system kan anvendes til omdannelse af andre flavanoner til deres tilsvarende flavonoler, blev eriodictyol (ERD) tilføjet til systemet for at afgøre, om ERD kan konverteres til quercetin (QRC). Som vist i figur 4aviste to nye pletter på en POLYAMID TLC-plade en migrations afstand svarende til henholdsvis dihydroquercetin (DHQ) og QRC. HPLC-og LC/MS-analyser viste, at disse nye kemikalier afslørede en retentions tid på henholdsvis 10,03 min og 16,23 min (figur 4b) og et kvasimolekylær iontoppunkt [m − H]− i henholdsvis M/z 303,1000 og 301,1000 (figur 4c). , som nøjagtigt svarede til henholdsvis DHQ og QRC. Dataene indikerer, at dette system kan konvertere ERD til QRC, og udbyttet var 25,55 mg/L.
Figur 4: produktion af QRC fra ERD i et bienzym syntetisk system. A) analyse af reaktionsprodukterne ved POLYAMID TLC. 1, ERD standard; 2, DHQ standard; 3, QRC standard; 4, reaktionsblanding. B) HPLC-analyse profiler for reaktionsprodukterne. ERD, DHQ og QRC viste en retentions tid på henholdsvis 15,45 min, 10,03 min og 16,23 min. C) MS-analyse profiler for forbindelserne i reaktions blandingerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En hel række undersøgelser er fokuseret på derisering af flavonoler på grund af deres potentielle anvendelse i sundhedssektoren og fødevareindustrien. Men traditionel plante ekstraktion med organiske opløsningsmidler og kemisk syntese besidder iboende ulemper, som begrænser deres anvendelse i produktionen af flavonoler. Her rapporterer vi en detaljeret metode til fremstilling af en flavonol fra en flavanonglucosid i en gryde ved at etablere en in vitro bienzymatisk kaskade. De kritiske trin i denne protokol er: 1) opnåelse af rene rekombinante enzymer med høje aktiviteter og 2) etablering af en en-pot bienzymatisk reaktions kaskade. Generelt, udtrykket af plante-afledte gener i bakterier foretrækker at danne inklusions organ, som vil føre til tab af enzymaktivitet. Som vi ved, nogle peptider, såsom TrxA og SUMO, bidrage til at forbedre udtryk og Opløselighed af rekombinante proteiner udtrykt i bakterier16. Derfor vil det være nyttigt at klone målgener i plasmiderne, der indeholder disse udtryks koder, såsom pET-32a (+) og pET SUMO (trin 3.2.3). Det er velkendt, at IPTG-koncentrationen og induktions temperaturen er endnu to afgørende parametre, der påvirker opløseligheden af prokaryotisk udtrykte proteiner16. For yderligere at nedsætte dannelsen af inklusions organ skal IPTG-koncentrationen og induktions temperaturen optimeres. Den optimale IPTG-koncentration og induktions temperaturen afhænger hovedsageligt af typen af plasmid'er og bakteriestammerne. I denne protokol optimeres IPTG-koncentrationen og induktions temperaturen til henholdsvis 0,2 mM og 20-22 °C (trin 4.2.3). Desuden er temperatur og glycerol to vigtige parametre for opretholdelse af stabiliteten og aktiviteten ved rensning og opbevaring af de rekombinante enzymer. I denne protokol er det afgørende at rense de rekombinante proteiner ved 4 °c (trin 5,5-5,12), tilsæt 10% glycerol til opløsningen af rensede enzymer (trin 5,13), og straks alikvot og opbevar opløsningen ved-80 °c (trin 5,13). I etableringen af en en-pot reaktion Cascade, pH og temperatur er to vitale parametre. Det er indlysende, at for høj pH er skadelig for omdannelsen, fordi de jernholdige ioner (fe2 +), en nødvendig komponent til enzymaktiviteten af rekombinant F3H og FLS116,32,33, er fremskyndet af der danner en gylle af jernholdigt hydroxid under en sådan betingelse. Selv om en relativt højere temperatur letter udviklingen af en enzym katalyseret reaktion, vil for høj temperatur inaktivere enzymet. Derfor er det afgørende for konverteringen at stabilisere pH og reaktionstemperatur. Vores tidligere publikation indstiller den optimale pH og temperatur ved henholdsvis 7,2 og 40 °C (trin 6)16.
Denne protokol kunne bekvemt modificeret til biosyntetisere en række flavonoler fra forskellige flavanones ved hjælp af forskellige substrater. I denne protokol er der to eksempler. Som vist i figur 3, når der tilføjes NRN som et substrat i dette system, nye kemikalier blev produceret. Af TLC-og HPLC/LC/MS-analyser fremgår det, at de nye kemikalier var DHK og KMF, og NRN blev omdannet til KMF i dette system. For yderligere at styrke tilliden til resultaterne, spektral karakterisering af 1H NMR (hydrogen-1 nuklear magnetisk resonans), 13C NMR (carbon-13 nuklear magnetisk resonans), Noesy (nuklear Overhauser effekt SPEKTROSKOPI), xrd (X-ray pulver diffraktion), CHN Analyzer og lignende kan være forpligtet til at attestere tilstedeværelsen af kemikalier i en ny enhed. På samme måde kan ERD med succes omdannes til QRC i denne bienzymatiske kaskade (figur 4).
Der er en vigtig begrænsning for denne metode. Ifølge den kendte biosyntetiske vej af flavonoider, kan en flavonol produceres af dette system fra en aromatisk aminosyre eller dens downstream derivater. F. eks. kan KMF produceres af p-coumarsyre ved en række nøgle enzymer, herunder 4-coumaroyl: COA-Ligase (4cl), chalcone syntase (CHS), chalcone ISOMERIASE (Chi), F3H og FLS23. Tilsvarende kan QRC fremstilles af caffeinsyre ved hjælp af det samme panel af nøgle enzymer (ikke-offentliggjorte data). Dog skal coenzym A (CoA), ATP og manonyl-CoA inkluderes i systemet for at omdanne p-coumarsyre til kmf, hvilket i høj grad vil øge produktionsomkostningerne. Derfor er dette system er normalt begrænset til at konvertere en flavanonglucosid til en dihydroflavonol eller en flavonol. Desuden er fuldstændig omdannelse af råvarer en anden udfordring. For yderligere at forbedre effektiviteten af dette system bør fremtidig forskning fokusere på screening af nøgle enzymer med høje aktiviteter fra andre planter, mutation af gener, der koder nøgle enzymer, immobilisering af de meget aktive enzymer til inaktive bærere, og udvikling af et bedre buffersystem.
Denne One-pot bienzym syntetisk system besidder indlysende iboende fordele i forhold til andre tilgange til at producere en flavonol, såsom kemisk syntese, mikrobiel cellefabrik, og plante ekstraktion ved hjælp af organiske opløsningsmidler16. For det første er reaktionstiden meget kort og behøver kun 40 min, så dette produktionssystem er arbejdskraft-og tidsbesparende. For det andet er der ingen kompleks fysiologisk regulering i dette system, som det forekom i den mikrobielle cellefabrik, og desuden er alle komponenter klare. Derfor er det nemt at styre reaktionen præcist og dermed bekvemt at gøre yderligere optimering i fremtiden. For det tredje, da dette reaktionssystem kun indeholder simple kemikalier og rensede rekombinante enzymer og kun genererer et større mellemprodukt som vist i figur 3 og figur 4, forventes det, at det er lettere at rense målmolekylerne genereret i dette system end dem fra cellefabrikker og anlæg. For det fjerde, de vigtigste komponenter i systemet er fælles og billige kemikalier og prokaryotisk udtrykte rekombinante enzymer, så det er meget omkostningseffektivt for denne metode til at udlede ønskede flavonoider. For det femte er det på grund af enkelheden af komponenterne i dette system let at skalere op til masseproduktion af mål flavonoider, hvilket indikerer et enormt industrialiserings potentiale. Desuden giver dette system en vejledning til økonomisk produktion af andre sekundære metabolitter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansielt støttet af Yangzhou University Special udnævnt professor start-up fonde, Jiangsu specielt udnævnt professor start-up fonde, seks talent Peaks projekt i Jiangsu provinsen (Grant No. 2014-SWYY-016), og et projekt finansieret af den prioriterede akademiske program udvikling af Jiangsu videregående uddannelsesinstitutioner (veterinærmedicin). Vi takker test Center for Yangzhou University for HPLC og MS analyser af flavonoider.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
References
- Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).
- Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development. European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).
- Cui, B., et al. Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods. Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).
- Li, X., et al. A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).
- Kim, H., et al. Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells. International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).
- Kimura, H., et al. Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME). Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).
- Cassidy, A., et al. Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).
- Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats. Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).
- Serban, M. C., et al. Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).
- Nakagawa, T., et al. Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients. Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).
- Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis. Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).
- Agar, O. T., et al. Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey. Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).
- Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).
- Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T.
- Lu, Y. H., et al. Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl). Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).
- Zhang, Z., et al. Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).
- Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).
- Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).
- Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).
- Miyahisa, I., et al. Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).
- Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).
- Koopman, F., et al. De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).
- Winkel-Shirley, B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).
- Duan, L., et al. Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).
- Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S.
- Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. Preparation of RNA from plant tissue using trizol. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Directional cloning into plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Halbwirth, H., et al. Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).
- Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).
