Summary
एक flavonol के व्युत्पत्ति स्वास्थ्य देखभाल और खाद्य उद्योग में अपने आवेदन के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ, हम एक flavanone से एक flavonol के biosynthesis के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और महत्वपूर्ण कदम और अन्य दृष्टिकोण पर इसके लाभ पर चर्चा.
Abstract
Flavonols जैविक और औषधीय गतिविधियों की एक किस्म के साथ flavonoids का एक प्रमुख उपवर्ग हैं. यहाँ, हम एक flavonol के इन विट्रो एंजाइमी संश्लेषण के लिए एक विधि प्रदान करते हैं. इस विधि में, एट्फ3ह और एफ्ल्स1, फ्लेवोनोल्स के जैव संश्लेषी मार्ग में दो प्रमुख जीन, एशेरीचिया कोलीमें क्लोन और अतिसंह ित किए जाते हैं. रिकॉमबिनेंट एंजाइमों एक संबंध स्तंभ के माध्यम से शुद्ध कर रहे हैं और फिर एक bienzymatic झरना एक विशिष्ट सिंथेटिक बफर में स्थापित किया गया है. दो flavonols उदाहरण के रूप में इस प्रणाली में संश्लेषित कर रहे हैं और टीएलसी और HPLC/LC/MS विश्लेषण द्वारा निर्धारित. विधि अन्य दृष्टिकोण पर flavonols के व्युत्पत्ति में स्पष्ट लाभ प्रदर्शित करता है. यह समय और श्रम की बचत और अत्यधिक लागत प्रभावी है. प्रतिक्रिया को सही ढंग से नियंत्रित किया जा आसान है और इस प्रकार बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए बढ़ाया. लक्ष्य उत्पाद प्रणाली में सरल घटकों के कारण आसानी से शुद्ध किया जा सकता है. हालांकि, इस प्रणाली को आम तौर पर एक flavanone से एक flavonol के उत्पादन के लिए प्रतिबंधित है.
Introduction
फ्लेवोनोलपाद पादप फ्लेवोनोइड्स का एक प्रमुख उपवर्ग है और यह पादप विकास तथा रंजकता1,2,3में शामिल है . इससे भी महत्वपूर्ण बात, इन यौगिकों में स्वास्थ्य-लाभदायक गतिविधियों की एक विस्तृत श्रृंखला है, जैसे कि एंटी-कैंसर4,5, एंटी-ऑक्सीडेटिव6, एंटी-इंफ्लेमेटरी7, एंटीबेसिटी8, एंटी-हाइपरटेंसिव9 , और स्मृति याद गुण10, इन संयंत्र व्युत्पन्न माध्यमिक चयापचयों पर अध्ययन की एक बड़ी संख्या के लिए अग्रणी. परंपरागत रूप से, इन यौगिकों मुख्य रूप से कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग कर संयंत्र निष्कर्षण से प्राप्त कर रहे हैं। हालांकि, पौधों में उनकी बहुत कम सामग्री के कारण11,12,13, सबसे flavonols के लिए उत्पादन लागत उच्च रहता है, जो स्वास्थ्य देखभाल और भोजन में उनके आवेदन पर काफी प्रतिबंध लगाता है उद्योग.
पिछले दशकों के दौरान वैज्ञानिकों ने फ्लेवोनोइड्स14,15को प्राप्त करने के लिए अनेक तरीके विकसित किए हैं . तथापि, इन जटिल अणुओं के रासायनिक संश्लेषण में विभिन्न प्रकार के आंतरिक नुकसानहोतेहैं। यह न केवल विषाक्त अभिकर्मकों और चरम प्रतिक्रिया की स्थिति की आवश्यकता है , लेकिन यह भी कई कदम एक लक्ष्य flavonoid यौगिक14,17का उत्पादन करने के लिए . इसके अलावा, इस रणनीति में एक और महत्वपूर्ण चुनौती सक्रिय flavonoid अणुओं के चिरल संश्लेषण है. अतः रासायनिक संश्लेषण16,17के माध्यम से वाणिज्यिक स्तर पर फ्लेवोनोइड्स का उत्पादन करना कोई आदर्श कार्यनीति नहीं है।
हाल ही में, वैज्ञानिकों ने इन जटिल प्राकृतिक यौगिकों का उत्पादन करने के लिए एक आशाजनक वैकल्पिक रणनीति विकसित की है, जिसमें फ्लैवोनॉयड बायोसिंथेसिस18,19,20, 21 , 22, जिसे23पौधों में सफलतापूर्वक समझा गया है . उदाहरण के लिए, Duan एट अल. नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae में एक जैव संश्लेषण मार्ग की शुरुआत केलिएम्पफेरॉल (KMF)24का उत्पादन करने के लिए . मल्ल एट अल. का उत्पादन एस्ट्रागैलिन, एक ग्लाइकोसिलेटिड फ्लेवोनोल,flavanone 3-hydroxylase (f3h), flavonol synthase(fla1),और UDP-ग्लूकोज:flavonoid 3-O-glucosyltransferase UGT78K1 जीन में शुरू करने से Escherichia कोलाईBL21(DE3)17| हालांकि वहाँ काफी कुछ प्रतिमान हैं, नहीं सभी आनुवंशिक रूप से इंजीनियर रोगाणुओं एक सेलुलर मंच की जटिलता के कारण ब्याज के उत्पादों का उत्पादन, कृत्रिम रूप से संश्लेषित आनुवंशिक तत्वों और मेजबानों के बीच असंगति, निरोधात्मक मेजबान कोशिकाओं के खिलाफ लक्ष्य उत्पादों का प्रभाव, और एक इंजीनियर सेलुलर प्रणाली की अस्थिरता ही16.
flavonoid उत्पादन के लिए एक और आशाजनक वैकल्पिक रणनीति इन विट्रो में एक multienzymatic झरना स्थापित करने के लिए है. चेंग एट अल की सूचना दी है कि enterocin polyketides सफलतापूर्वक एक बर्तन25में एक पूर्ण एंजाइमी मार्ग कोडांतरण द्वारा संश्लेषित किया जा सकता है. यह सेल-मुक्त संश्लेषी कार्यनीति माइक्रोबियल उत्पादन कारखाने के प्रतिबंधों को दरकिनारकरती है और इस प्रकार बड़ी मात्रा में कुछ फ्लेवोनोइड्स के उत्पादन के लिए संभव है 16 .
हाल ही में, हमने एक बर्तन16में नारिनजेनिन (एनआरएन) को केएमएफ में परिवर्तित करने के लिए एक द्विएंजाइम संश्लेषक प्रणाली सफलतापूर्वक विकसित की है। यहाँ, हम महान विवरण और उत्पादों का विश्लेषण करने में शामिल तरीकों में इस प्रणाली का वर्णन. हम भी दो उदाहरण है कि इस प्रणाली का उपयोग NRN और क्वेरसेटिन से KMF का उत्पादन (QRC) eriodictyol (ERD) से प्रस्तुत करते हैं. इसके अलावा, हम flavonoids के biosynthesis में इस विधि और भविष्य के अनुसंधान दिशाओं के महत्वपूर्ण चरणों पर चर्चा.
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Protocol
1. संयंत्र के ऊतकों से कुल आरएनए अलग26,27
- पौधे के ऊतकों को होमोजेनाइज करें।
- एक ताजा संयंत्र ऊतक के 100 मिलीग्राम ले लीजिए (जैसे, 4 सप्ताह के Arabidopsis thalianaसे पुराने अंकुर). तरल नाइट्रोजन के साथ ऊतक और एक मूसल और मोर्टार फ्रीज, पाउडर में ऊतक पीसने के बाद.
- आरएनए आइसोलेशन अभिकर्मक का 1 एमएल जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) मोर्टार में। अभिकर्मक तुरंत जमे हुए हो जाएगा. जमे हुए अभिकर्मक पिघला देता है जब मूसल के साथ ऊतक के नमूने Homogenize.
- एक 1.5-एमएल ट्यूब के लिए homogenate स्थानांतरण, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 12,000 x g पर नमूना centrifuge, और फिर एक और ताजा 1.5-एमएल ट्यूब के लिए मंजूरी दे दी homogenate समाधान हस्तांतरण।
- 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर homogenized नमूना इनक्यूबेट करें।
- कुल आरएनए को अलग करें।
- homogenate करने के लिए क्लोरोफॉर्म के 0.2 एमएल जोड़ें, ट्यूब सुरक्षित रूप से टोपी, 15 s के लिए हाथ से जोरदार ट्यूब हिला, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना incubate.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर नमूना सेंट्रीफ्यूज और एक ताजा 1.5-एमएल ट्यूब के लिए बेरंग ऊपरी जलीय चरण हस्तांतरण। अपकेंद्रण के बाद नमूना तीन चरणों में अलग हो जाता है।
- जलीय चरण में आइसोप्रोपिल अल्कोहल का 0.5 एमएल जोड़ें, ट्यूब को एक जोरदार तरीके से हाथ से हिलाएं, और मिश्रण को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर मिश्रण सेंट्रीफ्यूज और supernatant हटा दें।
- एक बार आरएनए गोली को भंवर द्वारा 75% एथेनॉल के 1 एमएल से धोएं, इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 7,500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन किया जाता है।
- चरण 1.2.5 दोहराएँ.
- वायु 5-10 मिनट के लिए गोली सूखी और diethylpyrocarbonate (DEPC) में आरएनए redissolve ऊपर और नीचे pipeting द्वारा पानी का इलाज किया, एक माइक्रो-स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ कुल आरएनए एकाग्रता को मापने के बाद (सामग्री की तालिकादेखें).।
2. पूरक डीएनए (cDNA)28 संश्लेषित करें
- एक किट का उपयोग कर CDNA के पहले किनारा संश्लेषित करें (सामग्री की तालिकादेखें)। सारणी 1 में दर्शाए अनुसार 20-जेडएल अभिक्रिया प्रणाली की स्थापना कीजिए तथा 42 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट के लिए पीसीआर यंत्र में अभिक्रिया नलिका को इनक्यूबेट करें, जिसके बाद जीनों के भावी प्रवर्धन के लिए अभिक्रिया उत्पाद को 85 डिग्री सेल्सियस पर समाप्त किया गया।
| अभिकर्मकों | आयतन |
| डीएनटीपी मिक्स, 2.5mM प्रत्येक | 4.0 $L |
| प्राइमर मिक्स | 2.0 $L |
| आरएनए टेम्पलेट | 1.0 $g |
| रिवर्स ट्रांसक्रिप्टस बफर, 5 डिग्री | 4.0 $L |
| रिवर्स ट्रांसक्रिप्टस, 200 यू/ | 1.0 $L |
| RNase मुक्त एच2हे | 20.0 $L तक |
तालिका 1: सीडीएनए में कुल आरएनए का रिवर्स प्रतिलेखन
3. निर्माण पुनः संयोजक प्लाज्मिड29
- डिजाइन पीसीआर प्राइमर।
- एक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पीसीआर प्राइमर डिजाइन (सामग्री की तालिकादेखें) जनरलबैंक डेटाबेस से प्राप्त प्रमुख एंजाइम जीन के दृश्यों के आधार पर और एक कंपनी द्वारा प्राइमर संश्लेषित (सामग्री की तालिकादेखें )। प्राइमर के 5' अंत में, एक प्रतिबंध एंजाइम साइट जोड़ें (उदा., इस प्रोटोकॉल में बामHI या पारिस्थितिकीआरआई).।
नोट: इस अध्ययन में प्रयुक्त प्राइमर सारणी 2में दर्शाए गए हैं।
- एक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पीसीआर प्राइमर डिजाइन (सामग्री की तालिकादेखें) जनरलबैंक डेटाबेस से प्राप्त प्रमुख एंजाइम जीन के दृश्यों के आधार पर और एक कंपनी द्वारा प्राइमर संश्लेषित (सामग्री की तालिकादेखें )। प्राइमर के 5' अंत में, एक प्रतिबंध एंजाइम साइट जोड़ें (उदा., इस प्रोटोकॉल में बामHI या पारिस्थितिकीआरआई).।
| अनुक्रम, 5' $ 3' | उद्देश्य |
| ए.ए.GGATCCATGGCCAGAACTTGACT | Arabidopsis thaliana से Atf3h जीन के पीसीआर प्रवर्धन के लिए फॉरवर्ड प्राइमर. बाम HI साइट इटैलिक ीकृत और pET32a(+) में क्लोनिंग के लिए संलग्न है। |
| ए.ए.GAATTCCTAAGCGAGATTGGTCGA | ए thaliana से Atf3h जीन के पीसीआर प्रवर्धन के लिए रिवर्स प्राइमर. पारिस्थितिकी आरआई साइट इटैलिक किया गया है और pET32a(+) में क्लोनिंग के लिए संलग्न है। |
| ए.ए.गगाटसीसीए.टी.जी.टी.टी.सी.ए.जी.टी.सी. | ए thaliana से Atfls1 जीन के पीसीआर प्रवर्धन के लिए फॉरवर्ड प्राइमर. बाम HI साइट इटैलिक ीकृत और pET32a(+) में क्लोनिंग के लिए संलग्न है। |
| ए.ए.गटात्तचटीसीएटीसीकागागटाट | ए thaliana से Atfls1 जीन के पीसीआर प्रवर्धन के लिए रिवर्स प्राइमर. पारिस्थितिकी आरआई साइट इटैलिक किया गया है और pET32a(+) में क्लोनिंग के लिए संलग्न है। |
तालिका 2: वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त ओलिगोन्यूक्लिओटाइड प्राइमर
- जीनों को प्रोकैरियोटिक अभिव्यक्ति सदिश में क्लोन करें।
- एक उच्च निष्ठा डीएनए polymerase का उपयोग संश्लेषित CDNA के पहले किनारा से जीन बढ़ाना (सामग्री की तालिकादेखें). तालिका 3 में दिखाए गए के रूप में एक 100-जेडएल पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली की स्थापना की और निम्नलिखित पीसीआर चक्र चलाने: प्रारंभिक विकृतीकरण के लिए 2 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस; तब विकृतीकरण के लिए 30 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, अनीलन के लिए 2 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, और विस्तार के लिए 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; इसके बाद 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम दीर्घीकरण होता है। प्रतिक्रिया मिश्रण को 12 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
नोट: विस्तार समय चर और सबसे डीएनए polymerases के लिए प्रति मिनट के बारे में 1000 ठिकानों के बहुलकीकरण के साथ जीन लंबाई द्वारा निर्धारित किया जाता है। - पीसीआर उत्पादों कल्पना (सबसे अधिक 5 $L) एक 1% agarose जेल पर और एक डीएनए क्लीन-अप किट का उपयोग कर शेष उत्पादों से विशिष्ट डीएनए टुकड़ा शुद्ध (सामग्री की तालिकादेखें)।
- प्रतिबंध एंजाइमों के साथ शुद्ध डीएनए टुकड़ा और वेक्टर (उदाहरण के लिए, pET-32a(+)) डाइजेस्ट (उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में बामHI या पारिस्थितिकीआरआई). सारणी 4 में दर्शाए गए 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में 50-जेडएल प्रतिक्रिया प्रणाली स्थापित करें और मिश्रण को 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए इनक्यूबेट करें। 1% अगारोस जेल पर पचाए गए डीएनए को अलग करें।
- एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर डीएनए बैंड पुनर्प्राप्त करें (सामग्री की तालिकादेखें)। इसके अलावा एक डीएनए क्लीन-अप किट का उपयोग कर डीएनए को शुद्ध (सामग्री की तालिकादेखें), एक माइक्रो-स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ डीएनए की एकाग्रता को मापने के बाद (सामग्री की तालिकादेखें)।
- टी 4 डीएनए लिगेज का उपयोग करके रैखिकीकृत वेक्टर डीएनए में जीन के टुकड़े को लिगेट करें (सामग्री की सारणीदेखें ) । सारणी 5 में दर्शाए अनुसार 1.5-एमएल ट्यूब में लिगेशन अभिक्रिया की स्थापना करें तथा ट्यूब को कमरे के ताप पर 2 - 3 ज के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट: एक वेक्टर करने के लिए एक डालने के मोलर अनुपात चर और 3:1 से 10:1 तक की सीमा है। - रासायनिक रूप से सक्षम Escherichia कोलाई कोशिकाओं (जैसे, TOP10 या DH5]) के 50 डिग्री एल में लिगेशन मिश्रण के 2.5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, धीरे मिश्रण, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब रखने के लिए गर्मी 90 s के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सदमे और तुरंत 2 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब जगह.
- ट्यूब में एंटीबायोटिक दवाओं के बिना तरल एलबी माध्यम के 200 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस शेकर में 220 आरपीएम पर 1 एच के लिए डालें। फैले 50 - 100 डिग्री सेल्सियस कोशिकाओं को एक LB प्लेट पर 100 g/एमएल एम्सिलिन और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
- एक उच्च निष्ठा डीएनए polymerase का उपयोग संश्लेषित CDNA के पहले किनारा से जीन बढ़ाना (सामग्री की तालिकादेखें). तालिका 3 में दिखाए गए के रूप में एक 100-जेडएल पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली की स्थापना की और निम्नलिखित पीसीआर चक्र चलाने: प्रारंभिक विकृतीकरण के लिए 2 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस; तब विकृतीकरण के लिए 30 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, अनीलन के लिए 2 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, और विस्तार के लिए 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; इसके बाद 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम दीर्घीकरण होता है। प्रतिक्रिया मिश्रण को 12 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
| अभिकर्मकों | आयतन |
| Pfu मास्टर मिक्स, 2 $ | 50.0 जेडएल |
| फॉरवर्ड प्राइमर, 10 डिग्री एम | 4.0 $L |
| रिवर्स प्राइमर, 10 डिग्री एम | 4.0 $L |
| सी.डी.ए.ए. | 2.0 $L |
| एच2हे | 40.0 जेडएल |
तालिका 3: पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली की स्थापना
| अभिकर्मकों | आयतन |
| डीएनए अंश/ | 3.0 डिग्री |
| बाम नमस्ते | 1.0 $L |
| पारिस्थितिकी आरआई | 1.0 $L |
| कटस्मार्ट बफर, 10 डिग्री | 5.0 जेडएल |
| एच2हे | 50.0 $L तक |
तालिका 4: एक डीएनए टुकड़ा का डबल पाचन /
| अभिकर्मकों | आयतन |
| सम्मिलित | एक्स जेडएल (0.09 pmol) |
| वेक्टर | वाई जेडएल (0.03 pmol) |
| लिगेशन बफर, 10 डिग्री | 1.0 $L |
| T4 डीएनए लिगाज़, 400 यू / | 1.0 $L |
| एच2हे | 10.0 $L तक |
सारणी 5: एक जीन के टुकड़े को रेखीय सदिश में लिगेशन
- स्क्रीन सकारात्मक कालोनियों.
- एल बी प्लेट से एक एकल कॉलोनी को तरल एलबी माध्यम के 200 डिग्री सेल्सियस में टीका करें जिसमें 100 ग्राम/एमएल एम्पीसिलिन होता है और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट होता है, 2 - 3 ज के लिए 250 आरपीएम।
नोट: सामान्य तौर पर, सकारात्मक कालोनियों की स्क्रीनिंग के लिए 4 - 8 कालोनियों चुनें। - चरण 3.2.1 में इसी प्रकार की 10-जेडएल कॉलोनी पीसीआर प्रतिक्रिया सेट करें।
नोट: CDNA टेम्पलेट के 1 $L के बजाय LB संस्कृति के 1 $L का उपयोग करें। - एक 1% agarose जेल पर पीसीआर उत्पादों कल्पना. शेष संस्कृति को एक सकारात्मक परिणाम के साथ 3 एमएल तरल एलबी माध्यम में टीका लगाएं जिसमें 100 ग्राम/एमएल एम्पीसिलिन और इनक्यूबेट 37 डिग्री सेल्सियस शेकर में 14 - 16 ज के लिए 250 आरपीएम पर।
- रिकॉमबिनेंट ई. कोलाई संस्कृतियों से प्लाज्मिड डीएनए को एक प्लाज्मिड मिनीप्रेप किट का उपयोग करके अलग करें (सामग्री की तालिकादेखें )।
- एक डबल प्रतिबंध एंजाइम विश्लेषण द्वारा शुद्ध रिकॉमबिनेंट प्लाज्मिड की पहचान (उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में बामHI और पारिस्थितिकीआरआई). चरण 3.2.3 में उस के समान एक 10-जेडएल प्रतिक्रिया प्रणाली सेट करें, इसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन द्वारा 3 ज के लिए। एक 1% agarose जेल पर रिकॉमबिनेंट प्लाज्मिड से जारी विशिष्ट बैंड कल्पना।
- एल बी प्लेट से एक एकल कॉलोनी को तरल एलबी माध्यम के 200 डिग्री सेल्सियस में टीका करें जिसमें 100 ग्राम/एमएल एम्पीसिलिन होता है और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट होता है, 2 - 3 ज के लिए 250 आरपीएम।
- सकारात्मक रिकॉमबिनेंट प्लाज्मिड के अनुक्रमों की जाँच करें।
- अनुक्रमण के लिए एक कंपनी को प्लाज्मिड भेजें। एक डीएनए अनुक्रम विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिणामों का विश्लेषण (सामग्री की तालिकादेखें) GenBank डेटाबेस से प्राप्त संदर्भ अनुक्रम के साथ अनुक्रमण कंपनी से प्राप्त अनुक्रम की तुलना करके.
4. एक्सप्रेस पुनः संयोजक एंजाइम प्रोटीन30
- सही रिकॉमबिनेंट प्लाज्मिड को सक्षम ई. कोलाई BL21(DE3) में रूपांतरित करें।
- प्लाज्मिड का 0.1 डिग्री सेल्सियस बर्फ पर 1.5-एमएल ट्यूब में सक्षम ई. कोलाई BL21(DE3) के 10 डिग्री सेल्सियस में जोड़ें और ट्यूब को बर्फ पर 5 मिनट के लिए रखें।
- गर्मी 90 s के लिए एक 42 डिग्री सेल्सियस waterbath में कोशिकाओं सदमे और यह बर्फ पर फिर से 2 मिनट के लिए जगह है.
- एंटीबायोटिक दवाओं के बिना एलबी तरल माध्यम के 200 डिग्री एल जोड़ें और 5 मिनट के लिए 220 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस शेकर में इनक्यूबेट करें।
- एक LB agar प्लेट पर परिवर्तन के 50 डिग्री सेल्सियस फैला हुआ है जिसमें 100 ग्राम/एमएल एम्फिसिलिन होता है और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट करता है।
- जीनों की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है।
- प्लेट से 3 - 5 कालोनियों को एक ट्यूब में शामिल किया गया है जिसमें 3 एमएल एल बी तरल माध्यम है जिसमें 100 ग्राम/एमएल एम्फिसिलिन और 250 आरपीएम पर एक 37 डिग्री सेल्सियस शेकर रात में इनक्यूबेट होता है।
- रात भर की संस्कृति को एलबी तरल माध्यम के 300 एमएल में स्थानांतरित करें जिसमें 100 ग्राम/एमएल एम्पीसिलिन और इनक्यूबेट 37 डिग्री सेल्सियस शेकर में 250 आरपीएम पर है जब तक कि 600 एनएम पर संस्कृति का ऑप्टिकल घनत्व 0.4 - 0.6 के बीच है।
- 0.2 मीटर की अंतिम सांद्रता के साथ संस्कृति में आइसोप्रोपिल जेड-डी-डी-थायोगालैक्टोसाइड (IPTG) जोड़ें और 3 ज के लिए 250 आरपीएम, 20 - 22 डिग्री सेल्सियस पर जीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करें।
5. पुनः संयोजक एंजाइम प्रोटीन को शुद्धकरें 31
- 4 डिग्री सेल्सियस, 12,000 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए संस्कृति के centrifugation द्वारा बैक्टीरिया फसल।
- बैक्टीरियल Lysis बफर के 15 एमएल में गोली resuspend 0.1% Triton एक्स-100 युक्त, 1 एमएम EDTA, 10% ग्लिसरॉल, 150 एम एम NaCl, 0.5 एम एम डी टी, 0.1 एम एम पीएम एस एफ, 1 $g/एमएल एप्रोटिनिन, 1 $g/एमएल ल्यूपटिन, और 50 एमएम ट्रास-सीएल (पीएच 8.0) में 1 डिग्री जी/
- रिकॉमबिनेंट एंजाइम प्रोटीन जारी करने के लिए जीवाणु निलंबन Sonicate, 13,000 x gपर centrifugation के बाद, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस.
- फसल और alicot 1.5-एमएल ट्यूबमें supernatant 1 एमएल/ट्यूब पर और उन्हें भविष्य के उपयोग के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- पुन: प्रयोज्य रिक्त आत्मीयता स्तंभ में उसकी टैग शोधन राल के 500 $L लागू करें (सामग्री की तालिकादेखें)। स्टॉक समाधान में इथेनॉल को छोड़ने के लिए 5 बिस्तर की मात्रा deionized पानी के साथ राल धो लें। ट्राइस-सीएल (20 एमएम, पीएच 7.9), इमिडाज़ोल (10 मीटर) और नैक्ल (0.5 मी)।
- ऊपर राल के एक घोल के लिए चरण 5.4 से supernatant के 4 एमएल लागू करें और stopers के साथ स्तंभ के दो सिरों ब्लॉक।
- मिश्रण को 2 ज के लिए कम गति पर एक रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- संलयन प्रोटीन बाध्य राल को बंधन बफर के 15 बिस्तरों की मात्रा के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर धोलें।
- एल्यूशन बफर के 500 डिग्री सेल्सियस (जिसमें 20 एमएम ट्राइस-सीएल (पीएच 7.9), 500 एमएम इमिडाज़ोल, 0.5 एम नासीएल जोड़ें) कॉलम में और 10 मिनट के लिए कम गति पर एक रोटेटर पर गारा को 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। शुद्ध प्रोटीन नमूनों के रूप में एलुएंट को एकत्र करें।
- चरण 5.5 चार बार दोहराएँ.
- deionized पानी के 10 बिस्तर संस्करणों और 20% इथेनॉल के 3 बिस्तर की मात्रा के साथ राल क्रमिक रूप से धो लें। 20% इथेनॉल में राल लेना. स्टॉपर के साथ कॉलम को ब्लॉक करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख द्वारा शुद्ध प्रोटीन की एकाग्रता को मापने. एक 10% एसडीएस-पेज जेल पर प्रोटीन की शुद्धता का निर्धारण और Coomasie नीले धुंधला परख द्वारा बैंड कल्पना.
- एंजाइम गतिविधि को स्थिर करने के लिए 10% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए शुद्ध प्रोटीन समाधान करने के लिए ग्लिसरॉल जोड़ें। अलीकोट और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
6. एक इन विट्रो द्विएंजाइम सिंथेटिक प्रणाली में एक flavanone से एक flavonol का उत्पादन16
- बफ़र तैयार करें.
- 200 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.2), 16.4 एमएम -केटोग्लूटारिक एसिड, 0.8% सोडियम एसकॉर्बेट, और 20% ग्लिसरॉल से मिलकर लौह सल्फेट के बिना 2x सिंथेटिक बफर बनाएं। 1ण्938 ग्राम त्रिस आधार, 0ण्640 ग्राम सोडियम ऐस्कोरबेट, 0ण्250 ग्राम -केटोग्लूटारिक अम्ल तथा 16 एमएल ग्लिसरॉल को 64 एमएल डीआयनित जल में घोलना। हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) द्वारा पीएच को 7-2 तक समायोजित करें और 80 एमएल तक deionized पानी जोड़ें। भविष्य में उपयोग के लिए बफर को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
- 2 m फेरस सल्फेट का 100x स्टॉक समाधान करें। 50 एमएल deionized पानी में लौह सल्फेट हेप्टाहाइड्रेट के 55.6 मिलीग्राम भंग, हलचल, और 100 एमएल तक पानी जोड़ें।
- 25 एमएम flavonoid का एक शेयर समाधान बनाओ. मेथनॉल में एक फ्लेवोनॉयड को अच्छी तरह से भंग करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
- एक flavanone से एक flavonol का उत्पादन करने के लिए एक सिंथेटिक प्रणाली की स्थापना की।
- सारणी 6में दर्शाए गए कृत्रिम तंत्र को तैयार की ंं .
- 40 मिनट के लिए 600 आरपीएम (एक मिलाते हुए गर्मी ब्लॉक में) पर एक खुले 2.0-एमएल ट्यूब में 40 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया इनक्यूबेट करें।
- एथिल एसीटेट के 10 डिग्री सेल्सियस और एथिल एसीटेट के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़कर अभिक्रिया को समाप्त करें।
- दो घंटे बाद, कमरे के तापमान पर एक हुड में हवा सुखाने के लिए 1.5-एमएल ट्यूबों के लिए कार्बनिक चरणों हस्तांतरण।
| अभिकर्मकों | आयतन |
| लौह सल्फेट के बिना 2 ] सिंथेटिक बफर | 50.0 जेडएल |
| 25 एमएम फ्लेवोनोल | 2.0 $L |
| २ एम एम फेरस सल्फेट | 0.5 $एल |
| 1 मिलीग्राम/एमएल AtF3H | 2.5 $एल |
| 1 mg/mL AtFLS1 | 2.5 $एल |
| 25 एमएम फ्लेवेनोन | 2.0 $L |
| एच2हे | 100.0 $L तक |
तालिका 6: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सिंथेटिक सिस्टम।
7. प्रतिक्रिया उत्पादों का विश्लेषण
- पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) विश्लेषण।
- चरण 6.2.4 से flavonoid नमूनों की पूल 5 ट्यूब और हवा सुखाने के लिए 300 डिग्री सेल्सियस बाहर ले। मेथनॉल के 160 डिग्री एल में फ्लेवोनॉयड पाउडर को पुनः भंग करें। 12.5, 25, 50, 100, और 200 एनजी/जेडएल के सीरियल सांद्रता के साथ प्रामाणिक flavonoid नमूने मिथनॉल में तैयार करें। प्रतिक्रिया नमूनों के 1 डिग्री एल और polyamide 6 प्लेटों पर प्रामाणिक flavonoid नमूने लोड.
- एक विलायक प्रणाली में नमूना-लोडेड प्लेटें चलाएं जिसमें क्लोरोफॉर्म/मेथेनॉल/एथिल ऐसीटेट/फॉर्मिक एसिड 5.0:1.5:1.0:0:5 के अनुपात में शामिल हैं।
- हवा कमरे के तापमान पर प्लेटों सूखी. एल्यूमीनियम क्लोराइड (AlCl 3) के 1%इथेनॉलिक समाधान के साथ प्लेटों स्प्रे, कमरे के तापमान पर फिर से हवा सुखाने के बाद।
- तीस मिनट बाद, 254 एनएम पर एक यूवी प्रकाश के तहत प्लेटों पर धब्बे कल्पना और छवियों ले.
- एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों पर प्रत्येक स्थान के ग्रे मूल्य का विश्लेषण करें (उदा., ImageJ v1.51J8 इस प्रोटोकॉल में).
- सॉफ्टवेयर ImageJ खोलें. विश्लेषण किए जाने के लिए छवि को खोलने के लिए फ़ाइल और खोलें क्लिक करें.
- ImageJ उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस में बाईं सबसे Rectangular चयन उपकरण पर क्लिक करें. माउस के साथ छवि में रुचि के क्षेत्र
(ROI) को बाह्यरेखांकित करें और पहले ROI को लेबल करने के लिए दबाएँ. - अगले ROI पर माउस दाईं ओर आयताकार चयन ले जाएँ और दूसरा ROI लेबल करने के लिए दबाएँ.
- अन्य सभी ROIs लेबल करने के लिए पिछले चरण को दोहराएँ।
- पॉप-अप विंडो में सभी ROIs के लिए प्रोफ़ाइल प्लॉट जनरेट करने के लिए दबाएँ.
नोट: इस समय, ImageJ उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस में सीधे लाइन चयन उपकरण स्वचालित रूप से सक्रिय हो जाएगा। - आधार रेखाएँ आरेखित करने के लिए सीधे रेखा चयन उपकरण का उपयोग करें ताकि ब्याज की प्रत्येक चोटी के लिए एक बंद क्षेत्र को परिभाषित किया जा सके.
- ImageJ उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस में इसी चिह्न पर क्लिक करके Wand उपकरण को सक्रिय करें। एक पॉप-अप विंडो में सभी चोटियों के लिए परिणाम प्रदर्शित करने के लिए चोटी के अंदर क्लिक करें।
- चरण 7.1.1 से इसी flavonoid सांद्रता के खिलाफ चरण 7.1.5.7 से ग्रे मूल्यों की साजिश रचने के द्वारा प्रामाणिक flavonoid के एक टीएलसी आधारित मानक वक्र बनाओ. फिर, परिणामी सूत्र के अनुसार इस प्रोटोकॉल में उत्पादित ब्याज के flavonoid की उपज की गणना.
- उच्च निष्पादन द्रव क्रोमैटोग्राफी (एचपीसीएलसी) और तरल क्रोमैटोग्राफी/
- नमूने को चरण 7.1.1 से क्रमिक रूप से 0ण्45 डिग्री उ और 0ण्22 डिग्री उ फ़िल्टर के माध्यम से संसाधित करें।
- नमूनों को एचपीएलसी/एल सी/एमएस प्रणाली में लोड करें (सामग्री की सारणीदेखें) और नमूनों को 30 डिग्री सेल्सियस पर अलग करें जिसमें सी 18 (4ण्6 डिग्री 150 मिमी; इ.ड., 5 डिग्री उ) स्तंभ का उपयोग किया गया है। पानी में 10 - 85% (v/v) एसीटोनिट्रिल (एसीएन) (0 - 10 मिनट) की ढाल द्वारा कॉलम को 1.0 एमएल/मिनट पर Elute करें 10 - 25% ACN; 10 - 35 मिनट, 25 - 50% ACN; 35 - 45 मिनट, 50 - 85% ACN; 45 - 50 मिनट, 85 - 10% ACN; 50 - 60 मिनट , 10% ACN) और 200 से 800 एनएम से eluate के अवशोषण की निगरानी. 300 डिग्री सेल्सियस पर 10 L/min के सुखाने नाइट्रोजन प्रवाह और 250 डिग्री सेल्सियस पर 7 L/min के एक म्यान गैस प्रवाह के साथ एक नकारात्मक आयन मोड में LC/MS विश्लेषण प्रदर्शन और एक निर्मित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा एकत्र (सामग्री की तालिकादेखें)।
- एक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रतिक्रिया नमूनों और प्रामाणिक flavonoid यौगिकों के शिखर क्षेत्रों की गणना करने के लिए एकल तरंगदैर्ध्य क्रोमैटोग्राफ निकालें (सामग्री की तालिकादेखें)।
- गुणात्मक विश्लेषण प्रोग्राम खोलें और फ़ाइल क्लिक करें और डेटा फ़ाइल खोलें. खोलें डेटा फ़ाइल विंडो में विश्लेषण किया जा करने के लिए फ़ाइल (फ़ाइल) का चयन करें और फ़ाइल (ओं) को खोलने के लिए खोलें क्लिक करें।
- Chromatogram Results विंडो में माउस राइट-क्लिक करें और उसके बाद एक पॉप-अप मेनू में ईxtract Chromatograms.
- E xtract Chromatograms संवाद बॉक्स खोलें। प्रकार सूची में, अन्य क्रोमैटोग्रामक्लिक करें. वेक्षक कॉम्बो बॉक्स में, DAD1का चयन करें. फिर HPLC परिणाम Chromatogram परिणाम विंडो में प्रदर्शित करने के लिए ठीक क्लिक करें।
- Chromatogram परिणाम विंडो के शीर्ष पर डॉक किए गए Mवार्षिक Integration चिह्न पर क्लिक करें. माउस के साथ मैन्युअल एकीकरण विश्लेषण के लिए आवश्यक शिखर के लिए आधार रेखा आरेखित करें.
- परिणाम प्रदर्शित करने के लिए देखें क्लिक करें और एकीकरण पीक सूची.
- कदम 7.2.3.5 से इसी flavonoid सांद्रता के खिलाफ कदम 7.2.3.5 से चोटी क्षेत्रों की साजिश रचने के द्वारा प्रामाणिक flavonoid के एक HPLC आधारित मानक वक्र बनाओ 7.2.1. फिर, परिणामी सूत्र के अनुसार इस प्रोटोकॉल में उत्पादित ब्याज के flavonoid की उपज की गणना.
- एक सॉफ्टवेयर का उपयोग flavonoid यौगिकों की सटीक द्रव्यमान के लिए एमएस डेटा का विश्लेषण करें (सामग्री की तालिकादेखें) .
- दोहराएँ चरण 7.2.3.1 - 7.2.3.3.
- Chromatogram परिणाम उपकरण पट्टी पर श्रेणी का चयन करें चिह्न पर क्लिक करें।
- ब्याज की चोटी का चयन करें. चयनित श्रेणी में माउस राइट-क्लिक करें और एमएस स्पेक्ट्रम परिणाम विंडो में परिणाम प्रदर्शित करने के लिए पॉप-अप मेनू में निकालें MS स्पेक्ट्रम क्लिक करें।
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Representative Results
एफ 3 एच और एफएलएस1 एक फ्लेवनोन को पौधों में फ्लेवोनोल में परिवर्तित करने में दो महत्वपूर्ण एंजाइम हैं जैसा कि चित्र 1में दर्शाया गया है। एक flavanone, Atf3h (GenBank accession No. से एक flavonol के उत्पादन के लिए एक इन विट्रो बायोसिंथेटिक सिस्टम विकसित करने के लिए. NM$114983.3) और Atfls1 (GenBank accession no. NM$120951.3) जीन 4 सप्ताह पुराने ए thaliana के अंकुर से एक prokaryotic अभिव्यक्ति वेक्टर pET-32a(+) में क्लोन किया गया. रिकॉमबिनेंट प्लाज्मिड ई. कोलाई BL21 (DE3) में तब्दील हो गए थे और संलयन प्रोटीन IPTG प्रेरण के बाद व्यक्त किए गए थे, इसके बाद Ni-IDA agarose रेजिन का उपयोग कर शुद्धि के बाद. जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है , शुद्ध संलयन प्रोटीन ने 10% एसडीएस-पेज जेल पर 95% से अधिक की उच्च शुद्धता दिखाई, जो एक इन विट्रो द्विएंजाइमी झरना की स्थापना के लिए पर्याप्त शुद्ध थे।
चित्र 1:इन विट्रो मेंएक flavanone से एक flavonol के biosynthesis के लिए Schematic प्रतिनिधित्व . F3H, flavanone 3-hydroxylase; FLS1, flavonol synthase 1. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: पुनः संयोजक AtF3H और AtFLS1 प्रोटीन का शुद्धि. Atf3h और Atfls1 जीन एक prokaryotic अभिव्यक्ति वेक्टर pET-32a (+) में Arabidopsis thaliana के 4 सप्ताह पुराने अंकुर से क्लोन किया गया था और Escherichia कोलाई BL21(DE3) में व्यक्त की. रिकॉमबिनेंट प्रोटीन एक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी कॉलम के माध्यम से शुद्ध किया गया नी-आईडीए agarose रेजिन से भरा. शुद्धता एक 10% एसडीएस-पेज जेल पर निर्धारित किया गया था. एम, प्रोटीन मार्करों; 1, पुनः संयोजक AtF3H प्रोटीन; 2, रिकॉमबिनेंट AtFLS1 प्रोटीन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
शुद्ध पुनः संयोजक प्रोटीनों का उपयोग करके एक द्वि-एंजाइमी झरना स्थापित करने के लिए, सारणी 6में दर्शाए अनुसार एक कृत्रिम प्रणाली तैयार की गई थी। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या इस प्रणाली का उपयोग फ्लेवोनोन को फ्लेवोनोल में बदलने के लिए किया जा सकता है, एनआरएन को इस प्रणाली में जोड़ा गया था, और टीएलसी और एचपीएलसी/एलसी/एमएस विश्लेषण द्वारा केएमएफ के जैव संश्लेषण का पता लगाया गया था। जैसा कि चित्र 3कमें दिखाया गया है, एक पॉलीमाइड टीएलसी प्लेट पर दो नए धब्बे उभरे थे। एक स्थान पर एक प्रवास दूरी dihydrokaempferol (DHK) के समान है, और अन्य KMF के समान दिखाया. एचपीएलसी और एलसी/एमएस द्वारा आगे के विश्लेषण से यह पता चला है कि नए रसायनों ने क्रमशः 11.91 मिनट और 20.16 मिनट का प्रतिधारण समय दिखाया (चित्र 3ख) और एक अर्ध-आण्विक आयन शिखर [एम] ख्2z 287.0500 और 285.0500पर क्रमशः (चित्र3C) ), जो क्रमशः DHK और KMF के उन लोगों के समान थे. आंकड़ों से पता चलता है कि इस प्रणाली में एनआरएन से केएमएफ का उत्पादन किया गया था और उपज 3494 मिलीग्राम/एल थी।
चित्र 3: एक द्विएंजाइमी झरना में एनआरएन से KMF का संश्लेषण. (क) पॉलीमाइड टीएलसी द्वारा एक-पोट प्रतिक्रिया उत्पादों का विश्लेषण। 1, एनआरएन मानक; 2, DHK मानक; 3, KMF मानक; 4, प्रतिक्रिया मिश्रण. (बी) HPLC प्रतिक्रिया उत्पादों के विश्लेषण प्रोफाइल. NRN, DHK, और KMF क्रमशः 18.74 मिनट, 11.91 मिनट, और 20.16 मिनट की एक प्रतिधारण समय दिखाया. (ग) एमएस विश्लेषण प्रतिक्रिया मिश्रण में flavonoid यौगिकों की प्रोफाइल. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
आगे यह निर्धारित करने के लिए कि क्या यह इन विट्रो प्रणाली का उपयोग अन्य flavanones के उनके इसी flavonols में रूपांतरण के लिए किया जा सकता है, eriodictyol (ईआरडी) प्रणाली में जोड़ा गया था निर्धारित करने के लिए कि क्या ERD क्वेरसेटिन में परिवर्तित किया जा सकता है (QRC). जैसा कि चित्र 4कमें दर्शाया गया है, एक पॉलीमाइड टीएलसी प्लेट पर दो नए धब्बे क्रमशः डाइहाइड्रोक्यूरसेटिन (डीएचक्यू) और क्यूआरसी के समान प्रवास दूरी प्रदर्शित करते हैं। एचपीएलसी और एलसी/एमएस विश्लेषणों से पता चलता है कि इन नए रसायनों ने क्रमशः 10.03 मिनट और 16.23 मिनट का प्रतिधारण समय (चित्र 4B) और एक अर्ध-आण्विक आयन शिखर [एम] ख्03.1000 और 301.1000पर क्रमशः ( चित्र4C) का अवधारण समय प्रकट किया। , जो वास्तव में क्रमशः DHQ और QRC के उन लोगों के अनुरूप है. आंकड़ों से संकेत मिलता है कि इस प्रणाली QRC में ERD परिवर्तित कर सकते हैं और उपज 25.55 मिलीग्राम /
चित्र 4: एक द्विएंजाइम संश् लेषण प्रणाली में ईआरडी से क्यूआरसी का उत्पादन। (क) पॉलीमाइड टीएलसी द्वारा अभिक्रिया उत्पादों का विश्लेषण। 1, ईआरडी मानक; 2, DHQ मानक; 3, QRC मानक; 4, प्रतिक्रिया मिश्रण. (बी) HPLC प्रतिक्रिया उत्पादों के विश्लेषण प्रोफाइल. ईआरडी, DHQ, और QRC क्रमशः 15.45 मिनट, 10.03 मिनट, और 16.23 मिनट की एक प्रतिधारण समय प्रदर्शित किया. (ग) एमएस विश्लेषण अभिक्रिया मिश्रण में यौगिकों की प्रोफाइल। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
काफी अध्ययन के एक नंबर स्वास्थ्य देखभाल और खाद्य उद्योग में उनके संभावित आवेदन के कारण flavonols के व्युत्पत्ति पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं. हालांकि, कार्बनिक सॉल्वैंट्स और रासायनिक संश्लेषण का उपयोग कर पारंपरिक संयंत्र निष्कर्षण आंतरिक नुकसान है, जो flavonols के उत्पादन में उनके उपयोग को प्रतिबंधित अधिकारी। यहाँ, हम एक में इन विट्रो bienzymatic झरना की स्थापना के द्वारा एक बर्तन में एक flavanone से एक flavonol के उत्पादन के लिए एक विस्तृत विधि की रिपोर्ट. इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) उच्च गतिविधियों के साथ शुद्ध रिकॉमबिनेंट एंजाइमों प्राप्त करने और 2) एक एक पॉट bienzymatic प्रतिक्रिया झरना की स्थापना. आम तौर पर, बैक्टीरिया में पौधे व्युत्पन्न जीन की अभिव्यक्ति को शामिल करने के शरीर के रूप में पसंद करती है, जो एंजाइम गतिविधि के नुकसान का कारण बनेगी। जैसा कि हम जानते हैं, कुछ पेप्टाइड्स, जैसे TrxA और SUMO, बैक्टीरिया में व्यक्त पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति और घुलनशीलता को बढ़ाने में मदद16. इसलिए, इन अभिव्यक्ति टैग वाले प्लाज्मिड में लक्ष्य जीनों का क्लोन बनाना सहायक होगा, जैसे pET-32a(+) और pET SUMO (चरण 3.2.3)। यह सर्वविदित है कि आई पी जी सांद्रता और प्रेरण तापमान एक अन्य दो महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं जो प्रोकरोटिकरूपत रूप से व्यक्त प्रोटीनों की विलेयता को प्रभावितकरतेहैं . आगे शामिल किए जाने के शरीर के गठन को कम करने के लिए, IPTG एकाग्रता और प्रेरण तापमान अनुकूलित किया जाना चाहिए। इष्टतम IPTG एकाग्रता और प्रेरण तापमान मुख्य रूप से प्लाज्मिड और बैक्टीरिया उपभेदों के प्रकार पर निर्भर करता है. इस प्रोटोकॉल में, IPTG एकाग्रता और प्रेरण तापमान 0.2 MM और 20 - 22 डिग्री सेल्सियस, क्रमशः (चरण 4.2.3) पर अनुकूलित कर रहे हैं। इसके अलावा, तापमान और ग्लिसरोल स्थिरता और गतिविधि को बनाए रखने के लिए दो महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं जब शुद्ध और पुनः संयोजक एंजाइमों भंडारण. इस प्रोटोकॉल में, रिकॉमबिनेंट प्रोटीन को 4 डिग्री सेल्सियस (चरण 5.5 - 5.12) में शुद्ध करना महत्वपूर्ण है, शुद्ध एंजाइमों के समाधान में 10% ग्लिसरोल जोड़ें (चरण 5.13), और तुरंत अलीकोट और समाधान को -80 डिग्री सेल्सियस (चरण 5.13) पर संग्रहीत करें। एक एक पॉट प्रतिक्रिया झरना की स्थापना में, पीएच और तापमान दो महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं. यह स्पष्ट है कि बहुत अधिक पीएच रूपांतरण के लिए हानिकारक है क्योंकि लौह आयनों (Fe2+), रिकॉमबिनेंट F3H और FLS116,32,33के एंजाइम गतिविधि के लिए एक आवश्यक घटक द्वारा वेग कर रहे हैं ऐसी स्थिति के तहत लौह हाइड्रॉक्साइड का घोल बनाते हैं। हालांकि एक अपेक्षाकृत उच्च तापमान एक एंजाइम उत्प्रेरक प्रतिक्रिया की प्रगति की सुविधा, बहुत अधिक तापमान एंजाइम निष्क्रिय होगा. इसलिए, यह रूपांतरण के लिए महत्वपूर्ण है पीएच और प्रतिक्रिया तापमान को स्थिर करने के लिए. हमारे पिछले प्रकाशन इष्टतम पीएच और तापमान 7.2 और 40 डिग्री सेल्सियस पर सेट करता है, क्रमशः (चरण 6)16.
इस प्रोटोकॉल आसानी से विभिन्न substrates का उपयोग कर विभिन्न flavanones से flavonols के एक नंबर biosynthesize करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में, दो उदाहरण प्रदान किए जाते हैं। जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है, जब इस प्रणाली में एक सब्सट्रेट के रूप में एनआरएन को जोड़ते समय, नए रसायनों का उत्पादन किया गया। टीएलसी और एचपीएलसी/एलसी/एमएस विश्लेषण से पता चलता है कि नए रसायन डीएचके और केएमएफ थे और एनआरएन को इस प्रणाली में केएमएफ में बदल दिया गया था। परिणामों में विश्वास को और मजबूत करने के लिए, 1एच एनएमआर (हाइड्रोजन-1 परमाणु चुंबकीय अनुनाद), 13सी एनएमआर (कार्बन-13 परमाणु चुंबकीय अनुनाद), NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY), XRD (X-ray) की वर्णक्रमीय विशेषता पाउडर विवर्तन), CHN विश्लेषक और इस तरह के लिए एक नई इकाई में रसायनों की उपस्थिति attest की आवश्यकता हो सकती है. इसी प्रकार, ईआरडी को इस द्वि-जायजीय झरना में क्यूआरसी में सफलतापूर्वक परिवर्तित किया जा सकता है (चित्र 4)।
इस विधि के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा है. flavonoids के ज्ञात जैव संश्लेषण मार्ग के अनुसार, एक flavonol एक खुशबूदार एमिनो एसिड या उसके बहाव डेरिवेटिव से इस प्रणाली द्वारा उत्पादित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, KMF प्रमुख एंजाइमों की एक श्रृंखला द्वारा पी-कोमेरिक एसिड से उत्पादन किया जा सकता है, सहित 4-coumaroyl:CoA-ligase (4CL), chalcone synthase (CHS), chalcone isomerase (CHI), F3H और FLS23. इसी तरह, QRC प्रमुख एंजाइमों (अप्रकाशित डेटा) का एक ही पैनल का उपयोग कैफेइक एसिड से उत्पादन किया जा सकता है. हालांकि, कोएंजाइम ए (सीओए), एटीपी, और मैनोनिल-सीओए को पी-कोमिक एसिड को केएमएफ में परिवर्तित करने के लिए प्रणाली में शामिल किए जाने की आवश्यकता है, जिससे उत्पादन लागत में काफी वृद्धि होगी। इसलिए, इस प्रणाली को आम तौर पर एक flavanone एक dihydroflavonol या एक flavonol में परिवर्तित करने के लिए प्रतिबंधित है. इसके अलावा, शुरू सामग्री का पूरा रूपांतरण एक और चुनौती है. आगे इस प्रणाली की दक्षता में सुधार करने के लिए, भविष्य के अनुसंधान अन्य पौधों से उच्च गतिविधियों के साथ प्रमुख एंजाइमों स्क्रीनिंग पर ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए, जीन एन्कोडिंग कुंजी एंजाइमों के उत्परिवर्तन, निष्क्रिय वाहक के लिए अत्यधिक सक्रिय एंजाइमों के स्थिरीकरण, और एक बेहतर बफर प्रणाली का विकास.
यह एक पॉट bienzyme सिंथेटिक प्रणाली अन्य दृष्टिकोण पर स्पष्ट आंतरिक लाभ के पास एक flavonol का उत्पादन करने के लिए, जैसे रासायनिक संश्लेषण, माइक्रोबियल सेल कारखाने, और संयंत्र निष्कर्षण कार्बनिक सॉल्वैंट्स16का उपयोग कर. सबसे पहले, प्रतिक्रिया समय बहुत कम है और केवल 40 मिनट की जरूरत है, तो इस उत्पादन प्रणाली श्रम और समय की बचत है. दूसरे, इस प्रणाली में कोई जटिल शारीरिक विनियमन नहीं है जैसा कि माइक्रोबियल सेल कारखाने में हुआ है और इसके अलावा, सभी घटक स्पष्ट हैं। इसलिए, यह सही प्रतिक्रिया को नियंत्रित करने के लिए आसान है और इस तरह भविष्य में आगे अनुकूलन बनाने के लिए सुविधाजनक है। तीसरे, चूंकि इस प्रतिक्रिया प्रणाली में केवल सरल रसायन और शुद्ध पुनः संयोजक एंजाइम होते हैं और केवल चित्र 3 और चित्र 4में दर्शाए अनुसार एक प्रमुख मध्यवर्ती उत्पन्न होता है, यह आशा की जाती है कि लक्ष्य अणुओं को शुद्ध करना आसान है सेल कारखानों और पौधों से उन लोगों की तुलना में इस प्रणाली में उत्पन्न. चौथे, प्रणाली के प्रमुख घटक आम और सस्ते रसायन और prokaryotically व्यक्त पुनः संयोजक एंजाइमों हैं, तो यह अत्यधिक लागत प्रभावी इस विधि के लिए वांछित flavonoids प्राप्त करने के लिए है. पांचवें, इस प्रणाली के घटकों की सादगी के कारण, यह लक्ष्य flavonoids के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए पैमाने पर आसान है, एक विशाल औद्योगिकीकरण क्षमता का संकेत. इसके अलावा, इस प्रणाली के अन्य माध्यमिक चयापचयों के किफायती उत्पादन के लिए एक गाइड प्रदान करता है.
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Disclosures
लेखक घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।
Acknowledgments
यह काम वित्तीय रूप से Yangzhou विश्वविद्यालय विशेष रूप से नियुक्त प्रोफेसर स्टार्ट-अप फंड, Jiangsu विशेष रूप से नियुक्त प्रोफेसर स्टार्ट-अप फंड, Jiangsu प्रांत में छह प्रतिभा चोटियों परियोजना (ग्रेंट नंबर 2014-SWYY-016) द्वारा समर्थित किया गया था, और एक परियोजना द्वारा वित्त पोषित Jiangsu उच्च शिक्षा संस्थानों (Veterinary चिकित्सा) की प्राथमिकता शैक्षणिक कार्यक्रम विकास. हम HPLC और एमएस flavonoids के विश्लेषण के लिए Yangzhou विश्वविद्यालय के परीक्षण केंद्र धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
References
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