Summary
La dérivation d'un flavonol est cruciale pour son application dans les soins de santé et l'industrie alimentaire. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la biosynthèse d'un flavonol à partir d'un flavanone et discuter des étapes cruciales et de ses avantages par rapport à d'autres approches.
Abstract
Les flavonols sont une sous-classe majeure de flavonoïdes avec une variété d'activités biologiques et pharmacologiques. Ici, nous fournissons une méthode pour la synthèse enzymatique in vitro d'un flavonol. Dans cette méthode, Atf3h et Atfls1, deux gènes clés dans la voie biosynthétique des flavonols, sont clonés et surexprimés dans Escherichia coli. Les enzymes recombinantes sont purifiées via une colonne d'affinité, puis une cascade bienzymatique est établie dans un tampon synthétique spécifique. Deux flavonols sont synthétisés dans ce système à titre d'exemples et déterminés par des analyses TLC et HPLC/LC/MS. La méthode présente des avantages évidents dans la dérivation des flavonols par rapport à d'autres approches. Il est économique en temps et en main-d'œuvre et très rentable. La réaction est facile à contrôler avec précision et donc à l'échelle pour la production de masse. Le produit cible peut être purifié facilement en raison des composants simples du système. Cependant, ce système est généralement limité à la production d'un flavonol à partir d'un flavanone.
Introduction
Les flavonols sont une sous-classe majeure de flavonoïdes végétaux et sont impliqués dans le développement et la pigmentation des plantes1,2,3. Plus important encore, ces composés possèdent un large éventail d'activités bénéfiques pour la santé, telles que l'anticancéreux4,5, anti-oxydatif6, anti-inflammatoire7, antiobésité8, anti-hypertenseur9 , et les propriétés de rappel de mémoire10, menant à un grand nombre d'études sur ces métabolites secondaires d'origine végétale. Traditionnellement, ces composés sont principalement dérivés de l'extraction végétale à l'aide de solvants organiques. Cependant, en raison de leur très faible teneur en plantes11,12,13, le coût de production pour la plupart des flavonols reste élevé, ce qui impose de grandes restrictions sur leur application dans les soins de santé et l'alimentation industrie.
Au cours des dernières décennies, les scientifiques ont développé un certain nombre de méthodes pour dériver des flavonoïdes14,15. Cependant, la synthèse chimique de ces molécules compliquées possède une variété d'inconvénients intrinsèques16. Il nécessite non seulement des réactifs toxiques et des conditions de réaction extrêmes, mais aussi de nombreuses étapes pour produire un composé flavonoïde cible14,17. En outre, un autre défi important dans cette stratégie est la synthèse chirale des molécules flavonoïdes actives. Par conséquent, ce n'est pas une stratégie idéale pour produire des flavonoïdes à une échelle commerciale via la synthèse chimique16,17.
Récemment, les scientifiques ont développé une stratégie alternative prometteuse pour produire ces composés naturels compliqués par l'ingénierie des microbes avec une voie pour la biosynthèse flavonoïde18,19,20, 21 Ans, états-unis , 22, qui a été déchiffré avec succès dans les plantes23. Par exemple, Duan et coll. ont introduit une voie biosynthétique dans la levure en herbe Saccharomyces cerevisiae pour produire du kaempferol (KMF)24. Malla et coll. ont produit de l'astragaline, un flavonol glycosylated, en introduisant laflavanone 3-hydroxylase (f3h),la synthase flavonol (fls1), et UDP-glucose:flavonoid 3-O-glucosyltransferase UGT78K1 gènes dans Escherichia coliBL21(DE3)17. Même s'il existe pas mal de paradigmes, tous les microbes génétiquement modifiés ne produisent pas les produits d'intérêt en raison de la complexité d'une plate-forme cellulaire, de l'incompatibilité entre les éléments génétiques synthétisés artificiellement et les hôtes, l'inhibiteur l'effet des produits cibles contre les cellules hôtes, et l'instabilité d'un système cellulaire conçu lui-même16.
Une autre stratégie alternative prometteuse pour la production de flavonoïdes est d'établir une cascade multienzymatique in vitro. Cheng et coll. ont signalé que les polycécides d'entérocine peuvent être synthétisés avec succès en assemblant une voie enzymatique complète dans un pot25. Cette stratégie synthétique sans cellules contourne les restrictions d'une usine de production microbienne et est donc possible pour produire des flavonoïdes en grande quantité16.
Récemment, nous avons développé avec succès un système synthétique bienzyme pour convertir la naringenine (NRN) en KMF dans un pot16. Ici, nous décrivons ce système en détail et les méthodes impliquées dans l'analyse des produits. Nous présentons également deux exemples qui utilisent ce système pour produire KMF à partir de NRN et de quercétine (QRC) à partir d'ériodictyol (ERD). En outre, nous discutons des étapes cruciales de cette méthode et des orientations futures de recherche dans la biosynthèse des flavonoïdes.
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Protocol
1. Isoler l'ARN total des tissus végétaux26,27
- Homogénéiser les tissus végétaux.
- Recueillir 100 mg d'un tissu végétal frais (p. ex., les semis de 4 semaines d'Arabidopsis thaliana). Congeler le tissu, un pilon et un mortier avec de l'azote liquide, puis le broyer en poudre.
- Ajouter 1 ml de réactif d'isolement d'ARN (voir Tableau des matériaux) dans le mortier. Le réactif sera immédiatement gelé. Homogénéiser l'échantillon de tissu avec le pilon lorsque le réactif congelé fond.
- Transférer l'homogénéisme dans un tube de 1,5 mL, centrifuger l'échantillon à 12 000 x g pendant 5 min à 4 oC, puis transférer la solution homogénéique dégagée dans un autre tube frais de 1,5 mL.
- Incuber l'échantillon homogénéisé à température ambiante pendant 5 min.
- Isoler l'ARN total.
- Ajouter 0,2 ml de chloroforme à l'homogénéisme, couronner le tube solidement, secouer le tube vigoureusement à la main pendant 15 s, et couver l'échantillon à température ambiante pendant 5 min.
- Centrifuger l'échantillon à 12 000 x g pendant 15 min à 4 oC et transférer la phase aqueuse supérieure incolore dans un tube frais de 1,5 ml. L'échantillon se sépare en trois phases suivant la centrifugation.
- Ajouter 0,5 ml d'alcool isopropyl à la phase aqueuse, serrer le tube à la main d'une manière vigoureuse, et couver le mélange à température ambiante pendant 10 min.
- Centrifuger le mélange à 12 000 x g pendant 10 min à 4 oC et retirer le supernatant.
- Laver la pastille d'ARN une fois avec 1 ml d'éthanol à 75 % par vortex, puis centrifugation à 7 500 x g pendant 5 min à 4 oC.
- Répétez l'étape 1.2.5.
- Sécher à l'air le granule pendant 5-10 minutes et redissoudre l'ARN dans l'eau traitée par pipethèque de haut en bas, suivie de mesurer la concentration totale d'ARN avec un micro-spectrophotomètre (voir Tableau des matériaux).
2. Synthétiser l'ADN complémentaire (ADNc)28
- Synthétiser le premier brin d'ADNc à l'aide d'un kit (voir Tableau des matériaux). Mettre en place un système de réaction de 20 oL, comme le montre le tableau 1, et incuber le tube de réaction dans un instrument PCR pendant 50 min à 42 oC, puis mettre fin à la réaction à 85 oC pendant 5 min. Entreposez le produit de réaction à -20 oC pour l'amplification future des gènes.
| Réactifs | volume |
| mix dNTP, 2,5 mM chacun | 4.0 L |
| Mix D'apprêt | 2.0 L |
| Modèle d'ARN | 1,0 g |
| Tampon de Transcriptase inversé, 5 | 4.0 L |
| Transcription inverse, 200 U/L | 1.0 L |
| RNase-Free H2O | jusqu'à 20,0 L |
Tableau 1 : Transcription inversée de l'ARN total en ADNc
3. Construire des plasmides recombinants29
- Concevoir des amorces PCR.
- Concevoir les amorces PCR à l'aide d'un logiciel (voir Tableau des matériaux) basé sur les séquences de gènes enzymatiques clés obtenus à partir de la base de données GenBank et synthétiser les amorces par une entreprise (voir Tableau des matériaux). À l'extrémité 5' de l'amorce, ajoutez un site d'enzymes de restriction (par exemple, BamHI ou EcoRI dans ce protocole).
REMARQUE : Les amorces utilisées dans cette étude sont indiquées dans le tableau 2.
- Concevoir les amorces PCR à l'aide d'un logiciel (voir Tableau des matériaux) basé sur les séquences de gènes enzymatiques clés obtenus à partir de la base de données GenBank et synthétiser les amorces par une entreprise (voir Tableau des matériaux). À l'extrémité 5' de l'amorce, ajoutez un site d'enzymes de restriction (par exemple, BamHI ou EcoRI dans ce protocole).
| Séquence, 5' et 3' | objet |
| AAGGATCCATGGCTCCAGGAACTTTGACT | Apprêt avant pour l'amplification PCR du gène Atf3h d'Arabidopsis thaliana. Bam Bam Hi site est italique et attaché pour le clonage en pET32a( ( . |
| AAGAATTCCTAAGCGAAGATTTGGTCGA | Amorce inverse pour l'amplification PCR du gène Atf3h de A. thaliana. Eco (Eco) Le site de l'IR est italique et attaché pour le clonage en pET32a. |
| AAGGATCCATGGAGGTCGAAGAGTCCA | Apprêt avant pour l'amplification PCR du gène Atfls1 de A. thaliana. Bam Bam Hi site est italique et attaché pour le clonage en pET32a( ( . |
| AAGAATTCTCAATCCAGAGGAAGTTTAT | Amorce inverse pour l'amplification PCR du gène Atfls1 de A. thaliana. Eco (Eco) Le site de l'IR est italique et attaché pour le clonage en pET32a. |
Tableau 2 : Amorces d'oligonucléotide utilisées dans la présente étude
- Clonez les gènes dans un vecteur d'expression procaryotique.
- Amplifier les gènes du premier brin de l'ADNc synthétisé à l'aide d'une polymérase d'ADN haute fidélité (voir Tableau des matériaux). Mettre en place un système de réaction PCR de 100 l comme indiqué dans le tableau 3 et exécuter le cycle PCR suivant : 94 oC pendant 2 min pour la dénaturation initiale; puis 35 cycles de 94 oC pour 30 s pour la dénaturation, 55 oC pour 2 min pour l'annealing, et 72 oC pour 1 min pour l'extension; suivie d'une élongation finale à 72 oC pendant 10 min. Refroidir le mélange de réaction à 12 oC.
REMARQUE : Le temps d'extension est variable et déterminé par la longueur du gène avec une polymérisation d'environ 1000 bases par min pour la plupart des polymères d'ADN. - Visualisez les produits PCR (le plus souvent 5 l)) sur un gel d'agarose de 1 % et purifiez le fragment d'ADN spécifique des autres produits à l'aide d'un kit de nettoyage de l'ADN (voir Tableau des matériaux).
- Digdez le fragment d'ADN purifié et le vecteur (p. ex., pET-32a)) avec des enzymes de restriction (p. ex., BamHI ou EcoRI dans ce protocole). Mettre en place un système de réaction de 50 oL dans un tube PCR de 0,2 ml, comme le montre le tableau 4, et incuber le mélange à 37 oC pendant 3 h. Séparer l'ADN digéré sur un gel d'agarose de 1 %.
- Récupérer la bande d'ADN à l'aide d'un kit d'extraction de gel (voir Tableau des matériaux). Purifier davantage l'ADN à l'aide d'un kit de nettoyage de l'ADN (voir Tableau des matériaux),suivi de la mesure de la concentration d'ADN à l'aide d'un micro-spectrophotomètre (voir Tableau des matériaux).
- Ligate le fragment de gène dans l'ADN vectorieux linéaire à l'aide d'une ligase d'ADN T4 (voir Tableau des matériaux). Configurez une réaction de ligature dans un tube de 1,5 ml comme le montre le tableau 5 et incubez le tube à température ambiante pendant 2 à 3 h.
REMARQUE : Le rapport molaire d'un insert à un vecteur est variable et varie de 3:1 à 10:1. - Ajouter 2,5 l du mélange de ligature dans 50 l de cellules Escherichia coli chimiquement compétentes (p. ex., TOP10 ou DH5MD), mélanger délicatement et garder le tube sur la glace pendant 30 min. Chauffer les cellules à 42 oC pendant 90 s et placer immédiatement le tube sur la glace pendant 2 min.
- Ajouter 200 l de liquide LB moyen sans antibiotiques dans le tube et incuber le tube dans un shaker de 37 oC à 220 tr/min pendant 1 h. Étendre 50 à 100 l des cellules sur une plaque LB contenant 100 'g/mL d'ampicilline et incuber à 37 'C pendant la nuit.
- Amplifier les gènes du premier brin de l'ADNc synthétisé à l'aide d'une polymérase d'ADN haute fidélité (voir Tableau des matériaux). Mettre en place un système de réaction PCR de 100 l comme indiqué dans le tableau 3 et exécuter le cycle PCR suivant : 94 oC pendant 2 min pour la dénaturation initiale; puis 35 cycles de 94 oC pour 30 s pour la dénaturation, 55 oC pour 2 min pour l'annealing, et 72 oC pour 1 min pour l'extension; suivie d'une élongation finale à 72 oC pendant 10 min. Refroidir le mélange de réaction à 12 oC.
| Réactifs | volume |
| Pfu Master Mix, 2 | 50,0 l |
| Amorce avant, 10 M | 4.0 L |
| Amorce inverse, 10 M | 4.0 L |
| Arnc | 2.0 L |
| H2O | 40,0 l |
Tableau 3 : Mise en place d'un système de réaction PCR
| Réactifs | volume |
| Fragment d'ADN/Vector | 3,0 g |
| Bam Bam Salut | 1.0 L |
| Eco (Eco) Ri | 1.0 L |
| Tampon Cutsmart, 10 ans et plus | 5.0 L |
| H2O | jusqu'à 50,0 L |
Tableau 4 : Double digestion d'un fragment d'ADN/vecteur
| Réactifs | volume |
| insérer | X l (0,09 pmol) |
| vecteur | Y l (0,03 pmol) |
| Tampon de ligation, 10 ans et plus | 1.0 L |
| T4 DNA Ligase, 400 U/L | 1.0 L |
| H2O | jusqu'à 10,0 L |
Tableau 5 : Ligation d'un fragment de gène en vecteur linéaire
- Écran des colonies positives.
- Inoculer une seule colonie de la plaque LB en 200 oL de milieu LB liquide contenant 100 'g/mL d'ampicilline et incuber à 37 oC, 250 tr/min pour 2 - 3 h.
REMARQUE : En général, choisissez 4 à 8 colonies pour le dépistage des colonies positives. - Configurez une réaction PCR de la colonie de 10 l similaire à celle de l'étape 3.2.1.
REMARQUE : Utilisez 1 L de culture LB au lieu de 1 l de modèle d'ADNc. - Visualisez les produits PCR sur un gel agarose de 1%. Inoculer la culture restante avec un résultat positif en 3 ml de milieu LB liquide contenant 100 'g/mL d'ampicilline et incuber dans un shaker de 37 oC à 250 tr/min pendant 14 à 16 h.
- Isoler l'ADN plasmide des cultures E. coli recombinantes à l'aide d'un kit de miniprep plasmide (voir Tableau des matériaux).
- Identifiez les plasmides recombinants purifiés par une analyse enzymatique à double restriction (p. ex., BamHI et EcoRI dans ce protocole). Mettre en place un système de réaction de 10 l similaire à celui de l'étape 3.2.3, suivi d'une incubation à 37 oC pendant 3 h. Visualisez la bande spécifique libérée du plasmide recombinant sur un gel agarose de 1%.
- Inoculer une seule colonie de la plaque LB en 200 oL de milieu LB liquide contenant 100 'g/mL d'ampicilline et incuber à 37 oC, 250 tr/min pour 2 - 3 h.
- Vérifier les séquences de plasmides recombinants positifs.
- Envoyez les plasmides à une entreprise pour le séquençage. Analyser les résultats à l'aide d'un logiciel d'analyse de séquence scénatation d'ADN (voir Tableau des matériaux)en comparant la séquence obtenue de la société de séquençage avec la séquence de référence obtenue à partir de la base de données GenBank.
4. Exprimer les protéines d'enzymes recombinantes30
- Transformez le plasmide recombinant correct en E. coli BL21(DE3) compétent.
- Ajouter 0,1 l du plasmide à 10 l de E. coli BL21(DE3) compétent dans un tube de 1,5 ml sur la glace et garder le tube sur glace pendant 5 min.
- La chaleur choque les cellules dans un bain d'eau de 42 oC pendant 90 s et les placer sur la glace à nouveau pendant 2 min.
- Ajouter 200 l de liquide LB sans antibiotiques et incuber dans un shaker de 37 oC à 220 tr/min pendant 5 min.
- Étendre 50 ll de transformation sur une plaque d'agar LB contenant 100 ampicilline de 100 g/mL et incuber la plaque pendant la nuit dans un incubateur de 37 oC.
- Induire l'expression des gènes.
- Inoculer 3 à 5 colonies de la plaque dans un tube contenant 3 ml de liquide moyen LB avec une ampicilline de 100 g/mL et incuber à 250 tr/min dans un shaker de 37 oC pendant la nuit.
- Transférer toute la culture de la nuit dans 300 ml de milieu liquide LB contenant 100 'g/mL d'ampicilline et incuber à 250 tr/min dans un shaker de 37 oC jusqu'à ce que la densité optique de la culture à 600 nm soit comprise entre 0,4 et 0,6.
- Ajouter l'isopropyl -D-thiogalactoside (IPTG) dans la culture avec une concentration finale de 0,2 mM et induire l'expression des gènes à 250 tr/min, 20 - 22 oC pour 3 h.
5. Purifier les protéines enzymatiques recombinantes31
- Récoltez les bactéries par centrifugation de la culture à 4 oC, 12 000 x g pendant 10 min.
- Resuspendre la pastille dans 15 ml de tampon de lyse bactérienne contenant 0,1 % de Triton X-100, 1 mM EDTA, 10 % de glycérol, 150 mM de NaCl, 0,5 mM De TNT, 0,1 mM de PMSF, 1 aprotinin g/mL, 1 leupeptin et 1 g/mL de pepstatin dans 50 mM Tris-Cl (pH 8,0).
- Sonicate la suspension bactérienne pour libérer les protéines enzymatiques recombinantes, suivie de centrifugation à 13.000 x g, 4 oC pendant 10 min.
- Récoltez et aliquot le supernatant dans des tubes de 1,5 ml à 1 ml/tube et entreposez-les à -70 oC pour une utilisation future.
- Appliquer 500 ll de résine de purification de son étiquette (voir Tableau des matériaux) sur une colonne d'affinité vide réutilisable. Laver la résine avec 5 volumes d'eau déionisée pour jeter l'éthanol dans la solution de bouillon. Équilibrer la résine avec 10 volumes de lit du tampon de liaison comprenant Tris-Cl (20 mM, pH 7,9), imidazole (10 mM) et NaCl (0,5 M).
- Appliquer 4 ml du supernatant de l'étape 5.4 à une boue de la résine ci-dessus et bloquer deux extrémités de la colonne avec des bouchons.
- Incuber le mélange à 4 oC sur un rotateur à basse vitesse pendant 2 h.
- Laver la résine liée à la protéine de fusion avec 15 volumes de lit du tampon de liaison à 4 oC à un débit de 1 ml/min avant l'élution.
- Ajouter 500 l de tampon d'élution (contenant 20 mM Tris-Cl (pH 7,9), 500 mM d'imidazole, 0,5 M NaCl) à la colonne et incuber la boue à 4 oC sur un rotateur à basse vitesse pendant 10 min. Recueillir l'élu en tant qu'échantillons de protéines purifiées.
- Répétez l'étape 5.5 quatre fois de plus.
- Laver la résine de façon séquentielle avec 10 volumes d'eau déionisée et 3 volumes de lit d'éthanol à 20 %. Tremper la résine dans 20% d'éthanol. Bloquez la colonne à l'égard des bouchons et rangez-la à 4 oC.
- Mesurer la concentration des protéines purifiées par l'assay de protéine de Bradford. Déterminez la pureté des protéines sur un gel SDS-PAGE de 10 % et visualisez les bandes par l'analyse de coloration bleue De Coomassie.
- Ajouter le glycérol à la solution de protéines purifiées à une concentration finale de 10% pour stabiliser l'activité enzymatique. Aliquot et le stocker à -80 oC.
6. Produire un flavonol à partir d'un flavanone dans un système synthétique bienzymein vitro16
- Préparer les tampons.
- Faire 2x tampon synthétique sans sulfate ferreux composé de 200 mM Tris-HCl (pH 7,2), 16,4 mM d'acide ketoglutarique, 0,8% d'ascorbate de sodium et 20% de glycérol. Dissoudre 1,938 g de base De Tris, 0,640 g d'ascorbate de sodium, 0,250 g d'acide kétoglutarique et 16 ml de glycérol à 64 ml d'eau déionisée. Ajuster le pH à 7,2 par acide chlorhydrique (HCl) et ajouter de l'eau déionisée jusqu'à 80 ml. Conserver le tampon à 4 oC pour une utilisation future.
- Faire une solution de bouillon 100x de 2 mM de sulfate ferreux. Dissoudre 55,6 mg d'heptahydrate de sulfate ferreux dans 50 ml d'eau déionisée, remuer et ajouter de l'eau jusqu'à 100 ml.
- Faire une solution de stock de 25 mM flavonoïde. Dissoudre un flavonoïde dans le méthanol à fond et stocké à -20 oC.
- Mettre en place un système synthétique pour produire un flavonol à partir d'un flavanone.
- Préparer le système synthétique comme le montre le tableau 6.
- Incuber la réaction à 40 oC dans un tube ouvert de 2,0 ml à 600 tr/min (dans un bloc de chaleur qui secoue) pendant 40 min.
- Terminez la réaction en ajoutant 10 l d'acide acétique et 100 l d'acétate éthylique.
- Deux heures plus tard, transférer les phases organiques dans des tubes de 1,5 ml pour le séchage à l'air dans une hotte à température ambiante.
| Réactifs | volume |
| Tampon synthétique de 2 degrés sans sulfate ferreux | 50,0 l |
| 25 mm de flavonol | 2.0 L |
| 2 mm de sulfate ferreux | 0,5 l |
| 1 mg/mL AtF3H | 2,5 l |
| 1 mg/mL AtFLS1 | 2,5 l |
| 25 mm de flavanone | 2.0 L |
| H2O | jusqu'à 100,0 L |
Tableau 6 : Système synthétique utilisé dans ce protocole.
7. Analyser les produits de réaction
- Analyse de la chromatographie de la couche mince (TLC).
- Piscine 5 tubes des échantillons de flavonoïdes de l'étape 6.2.4 et de prendre 300 L pour le séchage à l'air. Redissoudrez la poudre de flavonoïde dans 160 l de méthanol. Préparer des échantillons de flavonoïdes authentiques avec des concentrations en série de 12,5, 25, 50, 100 et 200 ng/L en méthanol. Chargez 1 L des échantillons de réaction et des échantillons de flavonoïdes authentiques sur des plaques de polyamide 6.
- Exécuter les plaques chargées d'échantillons dans un système de solvant comprenant de l'acide chloroforme/méthanol/éthyle acétate/acide formique à un rapport de 5,0:1.5:1.0:0.5.
- Sécher les plaques à l'air à température ambiante. Vaporiser les assiettes avec une solution éthanolétique de1 % de chlorure d'aluminium (AlCl 3), suivie d'un nouveau séchage à l'air à température ambiante.
- Trente minutes plus tard, visualisez les taches sur les plaques sous une lumière UV à 254 nm et prenez des images.
- Analyser la valeur grise de chaque tache sur les images à l'aide d'un logiciel de traitement d'image (par exemple, ImageJ v1.51j8 dans ce protocole).
- Ouvrez le logiciel ImageJ. Cliquez sur Le Fichier 'gt; Ouvrez pour ouvrir l'image à analyser.
- Cliquez sur l'outil de sélection le plus Rectangular de gauche dans l'interface utilisateur ImageJ. Décrivez la région d'intérêt (ROI)
dans l'image avec la souris et appuyez sur pour étiqueter le premier retour sur investissement. - Déplacez la sélection rectangulaire avec la souris
jusqu'au prochain retour sur investissement et appuyez sur pour étiqueter le deuxième retour sur investissement. - Répétez l'étape précédente pour étiqueter tous les autres IA.
- Appuyez
sur pour générer des parcelles de profil pour tous les ROI dans une fenêtre contexty.
REMARQUE : À ce moment-là, l'outil de sélection straight Line de l'interface utilisateur ImageJ sera automatiquement activé. - Utilisez l'outil de sélection de ligne droite pour tracer des lignes de base afin de définir une zone fermée pour chaque pic d'intérêt.
- Activez l'outil Wand en cliquant sur l'icône correspondante dans l'interface utilisateur ImageJ. Cliquez à l'intérieur du pic pour afficher les résultats de tous les pics dans une fenêtre contextrale.
- Faire une courbe standard basée sur TLC du flavonoïde authentique en traçant les valeurs grises à partir de l'étape 7.1.5.7 contre les concentrations de flavonoïdes correspondantes à partir de l'étape 7.1.1. Ensuite, calculez le rendement du flavonoïde d'intérêt produit dans ce protocole selon la formule résultante.
- Analyses de chromatographie liquide de haute performance (HPLC) et de chromatographie/spectrométrie de masse liquide (LC/MS)
- Traiter les échantillons de l'étape 7.1.1 séquentiellement à travers des filtres de 0,45 m et 0,22 m.
- Chargez les échantillons dans un système HPLC/LC/MS (voir Tableau des matériaux)et séparez les échantillons à 30 oC à l'aide d'une colonne C18 (4,6 x 150 mm; i.d., 5 m). Elute la colonne à 1,0 ml/min par un gradient de 10 - 85% (v/v) acetonitrile (ACN) dans l'eau (0 - 10 min, 10 - 25% ACN; 10 - 35 min, 25 - 50% ACN; 35 - 45 min, 50 - 85% ACN; 45 - 50 min, 85 - 10% ACN; 50 - 60 min , 10 % ACN) et surveiller l'absorption de l'éluate de 200 à 800 nm. Effectuer l'analyse LC/MS en mode ion négatif avec un débit d'azote de séchage de 10 L/min à 300 oC et un débit de gaz de gaine de 7 L/min à 250 oC et recueillir des données à l'aide d'un logiciel intégré (voir Tableau des matériaux).
- Extraire des chromatographes à longueur d'onde unique pour calculer les zones de pointe des échantillons de réaction et des composés flavonoïdes authentiques à l'aide d'un logiciel (voir Tableau des matériaux).
- Ouvrez le programme d'analyse qualitative et cliquez sur Fichier 'gt; Fichier de données ouvertes. Sélectionnez le fichier (s) à analyser dans la fenêtre Fichier de données ouvertes et cliquez sur Ouvrez pour ouvrir le fichier.
- Cliquez à droite sur la souris dans la fenêtre Chromatogram Results, puis leshromatogrammes Extract Cdans un menu pop-up.
- Ouvrez la boîte de dialogue Extract Chromatogram. Dans la liste type, cliquez sur Autres Chromatogrammes. Dans la boîte combo Détecteur, sélectionnez DAD1. Cliquez ensuite sur OK pour afficher les résultats HPLC dans la fenêtre Résultats del'hromatogramme C.
- Cliquez sur l'icôneannuelle M Integration amarré en haut de la fenêtre Résultats hromatogrammes C. Tracez une ligne de base pour le pic requis pour l'analyse d'intégration manuelle avec la souris.
- Cliquez sur La liste des pics d'intégration pour afficher les résultats.
- Faire une courbe standard basée sur HPLC du flavonoïde authentique en traçant les zones de pointe à partir de l'étape 7.2.3.5 contre les concentrations de flavonoïdes correspondantes à partir de l'étape 7.2.1. Ensuite, calculez le rendement du flavonoïde d'intérêt produit dans ce protocole selon la formule résultante.
- Analyser les données de la SP pour la masse exacte des composés flavonoïdes à l'aide d'un logiciel (voir tableau des matériaux).
- Répéter les étapes 7.2.3.1 - 7.2.3.3.
- Cliquez sur l'icône Range Select sur la barre d'outils Chromatogram Results.
- Sélectionnez le pic d'intérêt. Cliquez à droite sur la souris dans la plage sélectionnée et cliquez sur le spectre Extrait MS dans le menu pop-up pour afficher les résultats dans la fenêtre Résultats du spectre MS.
dans l'image avec la souris et appuyez sur pour étiqueter le premier retour sur investissement.
jusqu'au prochain retour sur investissement et appuyez sur pour étiqueter le deuxième retour sur investissement.
sur pour générer des parcelles de profil pour tous les ROI dans une fenêtre contexty.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
F3H et FLS1 sont deux enzymes clés importantes dans la conversion d'un flavanone en flavonol chez les plantes comme le montre la figure 1. Développer un système biosynthétique in vitro pour la production d'un flavonol à partir d'un flavanone, Atf3h (GenBank accession no. NM-114983.3) et Atfls1 (GenBank accession no. Les gènes NM-120951.3) ont été clonés à partir des semis de A. thaliana, âgé de 4 semaines, en un vecteur d'expression procaryotique pET-32a. Les plasmides recombinants ont été transformés en E. coli BL21(DE3) et les protéines de fusion ont été exprimées après l'induction de l'IPTG, suivies d'une purification à l'aide de résines d'agarose Ni-IDA. Comme le montre la figure 2, les protéines de fusion purifiées ont montré une pureté élevée de plus de 95% sur un gel SDS-PAGE de 10%, qui étaient assez purs pour l'établissement d'une cascade bienzymatique in vitro.
Figure 1 : Représentation schématique pour la biosynthèse d'un flavonol à partir d'une flavanoneinvitro. F3H, flavanone 3-hydroxylase; FLS1, synthase de flavonol 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Purification des protéines recombinantes AtF3H et AtFLS1. Les gènes Atf3h et Atfls1 ont été clonés à partir de semis de 4 semaines d'Arabidopsis thaliana dans un vecteur d'expression procaryotique pET-32a(MD) et exprimés dans Escherichia coli BL21(DE3). Les protéines recombinantes ont été purifiées par une colonne de chromatographie d'affinité remplie de résines d'agarose de Ni-IDA. La pureté a été déterminée sur un gel SDS-PAGE de 10 %. M, marqueurs protéiques; 1, protéine recombinante d'AtF3H ; 2, protéine recombinante D'AtFLS1. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Pour établir une cascade bienzymatique à l'aide des protéines recombinantes purifiées, un système synthétique a été préparé comme le montre le tableau 6. Pour déterminer si ce système peut être utilisé pour la conversion d'un flavanone en flavonol, NRN a été ajouté dans le système, et la biosynthèse de KMF a été détectée par les analyses TLC et HPLC/LC/MS. Comme le montre la figure 3A, il y avait deux nouvelles taches émergées sur une plaque de polyamide TLC. Un endroit a montré une distance de migration semblable à celle du dihydrokaempferol (DHK), et l'autre semblable à celui de KMF. Une analyse plus approfondie par HPLC et LC/MS a démontré que les nouveaux produits chimiques ont montré un temps de rétention de 11,91 min et 20,16 min, respectivement (figure 3B) et un pic d'ion quasi moléculaire [M-H]- à m/z 287.0500 et 285.0500, respectivement (Figure 3C ), qui étaient identiques à celles de DHK et kmF, respectivement. Les données indiquent que le KMF a été produit à partir de NRN dans ce système et que le rendement était aussi élevé que 34,94 mg/L.
Figure 3 : Synthèse de KMF de NRN dans une cascade bienzymatique. (A) Analyse des produits de réaction d'un pot par tLC de polyamide. 1, norme NRN; 2, norme DHK; 3, norme KMF ; 4, mélange de réaction. (B) Profils d'analyse HPLC des produits de réaction. NRN, DHK, et KMF ont montré un temps de rétention de 18.74 min, 11.91 min, et 20.16 min, respectivement. (C) Profils d'analyse de la SP des composés flavonoïdes dans les mélanges de réaction. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Pour déterminer davantage si ce système in vitro peut être utilisé pour la conversion d'autres flavanones en flavonols correspondants, l'ériodictyol (ERD) a été ajouté dans le système pour déterminer si erD peut être converti en quercétine (QRC). Comme le montre la figure 4A, deux nouvelles taches sur une plaque tLC en polyamide affichaient une distance de migration semblable à celle de la dihydroquercétine (DHQ) et du QRC, respectivement. Les analyses HPLC et LC/MS ont démontré que ces nouveaux produits chimiques ont révélé un temps de rétention de 10,03 min et 16,23 min, respectivement (figure 4B) et un pic d'ion quasi moléculaire [M-H]- à m/z 303.1000 et 301.1000, respectivement (Figure 4C) , qui correspondait exactement à ceux du DHQ et de la QRC, respectivement. Les données indiquent que ce système peut convertir l'ERD en QRC et que le rendement était de 25,55 mg/L.
Figure 4 : Production de QRC à partir d'UNE DRE dans un système synthétique bienzyme. (A) Analyse des produits de réaction par polyamide TLC. 1, norme ERD; 2, norme DHQ; 3, norme QRC; 4, mélange de réaction. (B) Profils d'analyse HPLC des produits de réaction. ERD, DHQ et QRC ont affiché un temps de rétention de 15,45 min, 10,03 min et 16,23 min, respectivement. (C) Profils d'analyse de la SP des composés dans les mélanges de réaction. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Un certain nombre d'études portent sur la dérivation des flavonols en raison de leur application potentielle dans l'industrie des soins de santé et de l'alimentation. Cependant, l'extraction végétale traditionnelle à l'aide de solvants organiques et de synthèse chimique possède des inconvénients intrinsèques, qui limitent leur utilisation dans la production de flavonols. Ici, nous rapportons une méthode détaillée pour produire un flavonol à partir d'un flavanone dans un pot en établissant une cascade bienzymatique in vitro. Les étapes critiques de ce protocole sont : 1) l'obtention d'enzymes recombinantes pures avec des activités élevées et 2) l'établissement d'une cascade de réaction bienzymatique d'un pot. D'une manière générale, l'expression de gènes d'origine végétale dans les bactéries préfère former le corps d'inclusion, qui mènera à la perte de l'activité enzymatique. Comme nous le savons, certains peptides, tels que TrxA et SUMO, aident à améliorer l'expression et la solubilité des protéines recombinantes exprimées dans les bactéries16. Par conséquent, il sera utile de cloner les gènes cibles dans les plasmides contenant ces étiquettes d'expression, telles que pET-32a(MD) et pET SUMO (étape 3.2.3). Il est bien connu que la concentration iPTG et la température d'induction sont deux autres paramètres cruciaux affectant la solubilité des protéines exprimées procaryotically16. Pour diminuer davantage la formation du corps d'inclusion, la concentration iPTG et la température d'induction devraient être optimisées. La concentration optimale de l'IPTG et la température d'induction dépendent principalement du type de plasmides et des souches bactériennes. Dans ce protocole, la concentration et la température d'induction de l'IPTG sont optimisées à 0,2 mm et 20 à 22 oC, respectivement (étape 4.2.3). En outre, la température et le glycérol sont deux paramètres importants pour maintenir la stabilité et l'activité lors de la purification et le stockage des enzymes recombinantes. Dans ce protocole, il est crucial de purifier les protéines recombinantes à 4 oC (étapes 5,5 - 5,12), d'ajouter 10 % de glycérol dans la solution des enzymes purifiées (étape 5,13), et immédiatement d'aliquot et de stocker la solution à -80 oC (étape 5,13). Dans l'établissement d'une cascade de réaction d'un pot, le pH et la température sont deux paramètres vitaux. Il est évident que le pH trop élevé est nocif pour la conversion parce que les ions ferreux (Fe2),un composant nécessaire pour l'activité enzymatique de la F3H recombinante et FLS116,32,33, sont précipités par formant une boue d'hydroxyde ferreux dans une telle condition. Même si une température relativement plus élevée facilite la progression d'une réaction catalysée par les enzymes, une température trop élevée inactivera l'enzyme. Par conséquent, il est essentiel pour la conversion de stabiliser le pH et la température de réaction. Notre publication précédente fixe le pH et la température optimales à 7,2 et 40 oC, respectivement (étape 6)16.
Ce protocole pourrait être commodément modifié pour biosynthétiser un certain nombre de flavonols de divers flavanones à l'aide de différents substrats. Dans ce protocole, deux exemples sont fournis. Comme le montre la figure 3, lors de l'ajout de NRN comme substrat dans ce système, de nouveaux produits chimiques ont été produits. Les analyses TLC et HPLC/LC/MS indiquent que les nouveaux produits chimiques étaient DHK et KMF, et le NRN a été converti en KMF dans ce système. Pour renforcer encore la confiance dans les résultats, la caractérisation spectrale de 1H NMR (résonance magnétique nucléaire hydrogène-1), 13C NMR (résonance magnétique nucléaire carbon-13), NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY), XRD (rayon X diffraction de poudre), analyseur de CHN et semblables peuvent être exigés pour attester la présence des produits chimiques dans une nouvelle entité. De même, l'ERD pourrait être convertie avec succès en QRC dans cette cascade bienzymatique (Figure 4).
Il y a une limitation importante pour cette méthode. Selon la voie biosynthétique connue des flavonoïdes, un flavonol peut être produit par ce système à partir d'un acide aminé aromatique ou de ses dérivés en aval. Par exemple, KMF peut être produit à partir d'acide p-coumaric par une série d'enzymes clés, y compris 4-coumaroyl:CoA-ligase (4CL), la synthase de chalcone (CHS), l'isomérase de chalcone (CHI), F3H et FLS23. De même, QRC peut être produit à partir d'acide caffeique en utilisant le même panneau d'enzymes clés (données non publiées). Cependant, la coenzyme A (CoA), l'ATP et le manonyl-CoA doivent être inclus dans le système pour convertir l'acide p-coumaric en KMF, ce qui augmentera considérablement le coût de production. Par conséquent, ce système est généralement limité à convertir un flavanone en dihydroflavonol ou un flavonol. En outre, la conversion complète des matériaux de départ est un autre défi. Pour améliorer encore l'efficacité de ce système, la recherche future devrait être axée sur le dépistage des enzymes clés avec des activités élevées d'autres plantes, la mutation des gènes codant les enzymes clés, l'immobilisation des enzymes très actives aux porteurs inertes, et développement d'un meilleur système tampon.
Ce système synthétique de bienzyme d'un pot possède des avantages intrinsèques évidents au-dessus d'autres approches pour produire un flavonol, tel que la synthèse chimique, l'usine de cellules microbiennes, et l'extraction végétale utilisant les solvants organiques16. Tout d'abord, le temps de réaction est très court et n'a besoin que de 40 minutes, de sorte que ce système de production est de main-d'œuvre et de gain de temps. Deuxièmement, il n'y a pas de régulation physiologique complexe dans ce système comme cela s'est produit dans l'usine de cellules microbiennes et, en outre, tous les composants sont clairs. Par conséquent, il est facile de contrôler la réaction avec précision et donc pratique pour faire une optimisation plus poussée à l'avenir. Troisièmement, puisque ce système de réaction ne contient que des produits chimiques simples et des enzymes recombinantes purifiées et ne génère qu'un intermédiaire majeur comme le montrent la figure 3 et la figure4, on s'attend à ce qu'il soit plus facile de purifier les molécules cibles. générés dans ce système que ceux des usines cellulaires et des usines. Quatrièmement, les principaux composants du système sont des produits chimiques communs et bon marché et des enzymes recombinantes exprimées procaryotically, il est donc très rentable pour cette méthode de dériver les flavonoïdes désirés. Cinquièmement, en raison de la simplicité des composants de ce système, il est facile d'étendre pour la production de masse de flavonoïdes cibles, ce qui indique un énorme potentiel d'industrialisation. En outre, ce système fournit un guide pour la production économique d'autres métabolites secondaires.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu financièrement par l'Université de Yangzhou Spécialement nommé Professeur Fonds de démarrage, Jiangsu Specially-Appointed Professor Start-up Funds, Six Talent Peaks Project dans la province du Jiangsu (Grant No. 2014-SWYY-016), et un projet financé par le programme académique prioritaire de développement des établissements d'enseignement supérieur du Jiangsu (médecine vétérinaire). Nous remercions le Centre de test de l'Université de Yangzhou pour les analyses HPLC et MS des flavonoïdes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
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