Summary
Die Ableitung eines Flavonols ist entscheidend für seine Anwendung im Gesundheitswesen und in der Lebensmittelindustrie. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Biosynthese eines Flavonols aus einem Flavanon zur Verfügung und diskutieren die entscheidenden Schritte und seine Vorteile gegenüber anderen Ansätzen.
Abstract
Flavonole sind eine der wichtigsten Unterklassen von Flavonoiden mit einer Vielzahl von biologischen und pharmakologischen Aktivitäten. Hier bieten wir eine Methode zur in vitro enzymatischen Synthese eines Flavonols. Bei dieser Methode werden Atf3h und Atfls1, zwei Schlüsselgene im biosynthetischen Weg der Flavonole, geklont und in Escherichia coliüberexprimiert. Die rekombinanten Enzyme werden über eine Affinitätssäule gereinigt und dann wird in einem spezifischen synthetischen Puffer eine bienzymatische Kaskade aufgebaut. Zwei Flavonole werden in diesem System als Beispiele synthetisiert und durch TLC- und HPLC/LC/MS-Analysen bestimmt. Die Methode zeigt offensichtliche Vorteile bei der Ableitung von Flavonolen gegenüber anderen Ansätzen. Es ist zeit- und arbeitssparend und sehr kostengünstig. Die Reaktion lässt sich einfach genau steuern und somit für die Massenproduktion hochskalieren. Das Zielprodukt lässt sich durch die einfachen Komponenten im System einfach reinigen. Jedoch, Dieses System ist in der Regel auf die Herstellung eines Flavonolaus aus einem Flavanon beschränkt.
Introduction
Flavonole sind eine wichtige Unterklasse von Pflanzenflavonoiden und sind an der Pflanzenentwicklung und Pigmentierung1,2,3beteiligt. Noch wichtiger ist, diese Verbindungen besitzen eine breite Palette von gesundheitsfördernden Aktivitäten, wie Anti-Krebs4,5, antioxidative6, entzündungshemmende7, Anti-Adipositas8, anti-hypertensive9 , und Speicher-Rückruf Eigenschaften10, was zu einer großen Anzahl von Studien über diese pflanzlichen abgeleiteten sekundären Metaboliten. Traditionell werden diese Verbindungen hauptsächlich aus der Pflanzenextraktion mit organischen Lösungsmitteln gewonnen. Aufgrund ihres sehr geringen Gehalts in den Werken11,12,13bleiben die Produktionskosten für die meisten Flavonole jedoch hoch, was ihre Anwendung im Gesundheitswesen und in der Lebensmittelversorgung stark eingeschränkt. industrie.
In den letzten Jahrzehnten haben Wissenschaftler eine ganze Reihe von Methoden entwickelt, um Flavonoide14,15abzuleiten. Die chemische Synthese dieser komplizierten Moleküle besitzt jedoch eine Vielzahl von intrinsischen Nachteilen16. Es erfordert nicht nur toxische Reagenzien und extreme Reaktionsbedingungen, sondern auch viele Schritte, um eine Ziel-Flavonoid-Verbindung14,17zu produzieren. Darüber hinaus ist eine weitere wichtige Herausforderung in dieser Strategie die chirale Synthese von aktiven Flavonoidmolekülen. Daher ist es keine ideale Strategie, Flavonoide im kommerziellen Maßstab über chemische Synthese16,17zu produzieren.
Kürzlich haben Wissenschaftler eine vielversprechende alternative Strategie entwickelt, um diese komplizierten natürlichen Verbindungen durch technische Mikroben mit einem Weg für Flavonoid-Biosynthese18,19,20, 21 , 22, die in Denbetrieben erfolgreich entziffert wurde23. Zum Beispiel, Duan et al. führte einen biosynthetischen Weg in die angehende Hefe Saccharomyces cerevisiae Kaempferol (KMF)24. Malla et al. produzierten Astragalin, ein glykosyliertes Flavonol, durch Einbringen vonFlavanon 3-Hydroxylase (f3h), Flavonol-Synthase (fls1) und UDP-Glucose:flavonoid 3-O-Glucosyltransferase UGT78K1-Genen in Escherichia coliBL21(DE3)17. Obwohl es eine ganze Reihe von Paradigmen gibt, produzieren nicht alle gentechnisch veränderten Mikroben die Produkte von Interesse aufgrund der Komplexität einer zellulären Plattform, der Inkompatibilität zwischen künstlich synthetisierten genetischen Elementen und Wirten, der hemmenden Wirkung von Zielprodukten gegen Wirtszellen und die Instabilität eines technischen Zellsystems selbst16.
Eine weitere vielversprechende Alternative zur Flavonoidproduktion ist die Etablierung einer multienzymatischen Kaskade in vitro. Cheng et al. haben berichtet, dass Enterocin-Polyketide erfolgreich synthetisiert werden können, indem sie einen kompletten enzymatischen Weg in einem Topf25zusammenstellen. Diese zellfreie synthetische Strategie umgeht die Beschränkungen einer mikrobiellen Produktionsfabrik und ist somit für die Herstellung einiger Flavonoide in großer Menge16machbar.
Kürzlich haben wir erfolgreich ein bienzym-synthetisches System entwickelt, um Naringenin (NRN) in KMF in einem Topf16umzuwandeln. Hier beschreiben wir dieses System ausführlich und die Methoden, die bei der Analyse der Produkte zum Einsatz kommen. Wir stellen auch zwei Beispiele vor, die dieses System verwenden, um KMF aus NRN und Quercetin (QRC) aus Eriodictyol (ERD) zu produzieren. Darüber hinaus diskutieren wir entscheidende Schritte dieser Methode und zukünftige Forschungsrichtungen in der Biosynthese von Flavonoiden.
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Protocol
1. Isolieren der gesamten RNA aus Pflanzengeweben26,27
- Homogenisieren Sie das Pflanzengewebe.
- Sammeln Sie 100 mg eines frischen Pflanzengewebes (z. B. 4 Wochen alte Sämlinge aus Arabidopsis thaliana). Einfrieren Sie das Gewebe und einen Stößel und Mörtel mit flüssigem Stickstoff, gefolgt von dem Schleifen des Gewebes in Pulver.
- Fügen Sie 1 ml RNA-Isolationsreagenz (siehe Materialtabelle)in den Mörtel ein. Das Reagenz wird sofort eingefroren. Homogenisieren Sie die Gewebeprobe mit dem Stößel, wenn das gefrorene Reagenz schmilzt.
- Das Homogenat in ein 1,5-ml-Rohr geben, die Probe bei 12.000 x g bei 5 min bei 4 °C zentrifugieren und dann die gereinigte Homogenatlösung in ein anderes frisches 1,5-ml-Rohr geben.
- Inkubieren Sie die homogenisierte Probe bei Raumtemperatur für 5 min.
- Isolieren Sie die gesamte RNA.
- 0,2 ml Chloroform in das Homogenat geben, das Rohr sicher verkappen, das Rohr 15 s kräftig von Hand schütteln und die Probe bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C und übertragen Sie die farblose obere wässrige Phase in ein frisches 1,5-ml-Rohr. Die Probe trennt sich nach der Zentrifugation in drei Phasen.
- 0,5 ml Isopropylalkohol in die wässrige Phase geben, das Rohr kräftig von Hand schütteln und die Mischung bei Raumtemperatur 10 min inkubieren.
- Zentrifugieren Sie die Mischung bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand.
- Waschen Sie das RNA-Pellet einmal mit 1 ml 75% Ethanol durch Wirbeln, gefolgt von Zentrifugation bei 7.500 x g für 5 min bei 4 °C.
- Wiederholen Sie Schritt 1.2.5.
- Das Pellet 5-10 Minuten trocknen und die RNA in diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem Wasser wieder auflösen, indem es nach oben und unten pipetiert, gefolgt von der Messung der gesamten RNA-Konzentration mit einem Mikrospektrophotometer (siehe Tabelle der Materialien).
2. Synthetisieren komplementärer DNA (cDNA)28
- Synthetisieren Sie den ersten Strang von cDNA mit einem Kit (siehe Tabelle der Materialien). Richten Sie ein 20-L-Reaktionssystem gemäß Tabelle 1 ein und inkubieren Sie das Reaktionsrohr in einem PCR-Instrument für 50 min bei 42 °C, gefolgt von der Beendigung der Reaktion bei 85 °C für 5 min. Lagern Sie das Reaktionsprodukt bei -20 °C für die zukünftige Verstärkung der Gene.
| Reagenzien | Volumen |
| dNTP Mix, je 2,5 mM | 4,0 l |
| Primer Mix | 2,0 l |
| RNA-Vorlage | 1,0 g |
| Reverse Transcriptase Buffer, 5 | 4,0 l |
| Reverse Transcriptase, 200 U/L | 1,0 l |
| Rnase-frei H2O | bis zu 20,0 l |
Tabelle 1: Umgekehrte Transkription der gesamten RNA in cDNA
3. Konstruieren Sie rekombinante Plasmide29
- Design PCR-Primer.
- Entwerfen Sie die PCR-Primer mit einer Software (siehe Tabelle der Materialien) basierend auf den Sequenzen der wichtigsten Enzymgene, die aus der GenBank-Datenbank gewonnen werden, und synthetisieren Sie die Primer von einem Unternehmen (siehe Tabelle der Materialien). Fügen Sie am 5' Ende des Primers eine Restriktionsenzym-Site hinzu (z. B. BamHI oder EcoRI in diesem Protokoll).
HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Primer sind in Tabelle 2dargestellt.
- Entwerfen Sie die PCR-Primer mit einer Software (siehe Tabelle der Materialien) basierend auf den Sequenzen der wichtigsten Enzymgene, die aus der GenBank-Datenbank gewonnen werden, und synthetisieren Sie die Primer von einem Unternehmen (siehe Tabelle der Materialien). Fügen Sie am 5' Ende des Primers eine Restriktionsenzym-Site hinzu (z. B. BamHI oder EcoRI in diesem Protokoll).
| Sequenz, 5' n 3' | zweck |
| AAGGATCCATGGCTCTAGGAACTTTGACT | Vorwärtsgrundierung zur PCR-Verstärkung des Atf3h-Gens aus Arabidopsis thaliana. Bam HI-Standort ist kursiv und zum Klonen in pET32a(+) angebracht. |
| AAGAATTCCTAAGCGAAGATTTGGTCGA | Reverse Primer zur PCR-Verstärkung des Atf3h-Gens aus A. thaliana. Eco RI-Site ist kursiv und zum Klonen in pET32a(+) angebracht. |
| AAGGATCCATGGAGGTCGAAAGAGTCCA | Vorwärtsgrundierung zur PCR-Verstärkung des Atfls1-Gens von A. thaliana. Bam HI-Standort ist kursiv und zum Klonen in pET32a(+) angebracht. |
| AAGAATTCTCAATCCAGAGGAAGTTTAT | Reverse Primer zur PCR-Verstärkung des Atfls1-Gens aus A. thaliana. Eco RI-Site ist kursiv und zum Klonen in pET32a(+) angebracht. |
Tabelle 2: Oligonukleotidgrundierungen, die in der aktuellen Studie verwendet werden
- Klonen Sie die Gene in einen prokaryotischen Expressionsvektor.
- Verstärken Sie die Gene aus dem ersten Strang der synthetisierten cDNA mit einer hochgradigen DNA-Polymerase (siehe Tabelle der Materialien). Richten Sie ein 100-L-PCR-Reaktionssystem ein, wie in Tabelle 3 dargestellt, und führen Sie den folgenden PCR-Zyklus aus: 94 °C für 2 min für die anfängliche Denaturierung; dann 35 Zyklen von 94 °C für 30 s für Denaturierung, 55 °C für 2 min für glühend und 72 °C für 1 min für Dieverlängerung; gefolgt von einer Enddehnung bei 72 °C für 10 min. Kühlen Sie das Reaktionsgemisch auf 12 °C.
HINWEIS: Die Verlängerungszeit ist variabel und wird durch die Genlänge mit Polymerisation von etwa 1000 Basen pro min für die meisten DNA-Polymerasen bestimmt. - Visualisieren Sie die PCR-Produkte (am häufigsten 5 l) auf einem 1% Agarose-Gel und reinigen Sie das spezifische DNA-Fragment der übrigen Produkte mit einem DNA-Reinigungskit (siehe Tabelle der Materialien).
- Verdauen Sie das gereinigte DNA-Fragment und den Vektor (z. B. pET-32a(+)) mit Restriktionsenzymen (z. B. BamHI oder EcoRI in diesem Protokoll). Richten Sie ein 50-L-Reaktionssystem in einem 0,2 ml PCR-Rohr ein, wie in Tabelle 4 dargestellt, und inkubieren Sie das Gemisch bei 37 °C für 3 h. Trennen Sie die verdaute DNA auf einem 1% Agarose-Gel.
- Wiederherstellen des DNA-Bandes mit einem Gel-Extraktionskit (siehe Tabelle der Materialien). Weitere Reinigung der DNA mit einem DNA-Reinigungskit (siehe Tabelle der Materialien), gefolgt von der Messung der Konzentration der DNA mit einem Mikrospektrophotometer (siehe Tabelle der Materialien).
- Ligate das Genfragment mit einer T4-DNA-Ligase in die linearisierte Vektor-DNA (siehe Tabelle der Materialien). Richten Sie eine Ligationsreaktion in einem 1,5-ml-Rohr ein, wie in Tabelle 5 dargestellt, und inkubieren Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 2 - 3 h.
HINWEIS: Das Molverhältnis eines Inserts zu einem Vektor ist variabel und reicht von 3:1 bis 10:1. - Fügen Sie 2,5 l des Ligationsgemisches in 50 l chemisch kompetente Escherichia coli-Zellen (z.B. TOP10 oder DH5) ein, mischen Sie sie sanft und halten Sie die Röhre 30 min auf Eis. Hitze schockieren die Zellen bei 42 °C für 90 s und legen Sie die Röhre sofort 2 min auf Eis.
- Fügen Sie 200 l flüssiges LB-Medium ohne Antibiotika in die Röhre und inkubieren Sie das Rohr in einem 37 °C-Shaker bei 220 U/min für 1 h. 50 - 100 l der Zellen auf einer LB-Platte mit 100 g/mL Ampicillin verteilen und bei 37 °C über Nacht inkubieren.
- Verstärken Sie die Gene aus dem ersten Strang der synthetisierten cDNA mit einer hochgradigen DNA-Polymerase (siehe Tabelle der Materialien). Richten Sie ein 100-L-PCR-Reaktionssystem ein, wie in Tabelle 3 dargestellt, und führen Sie den folgenden PCR-Zyklus aus: 94 °C für 2 min für die anfängliche Denaturierung; dann 35 Zyklen von 94 °C für 30 s für Denaturierung, 55 °C für 2 min für glühend und 72 °C für 1 min für Dieverlängerung; gefolgt von einer Enddehnung bei 72 °C für 10 min. Kühlen Sie das Reaktionsgemisch auf 12 °C.
| Reagenzien | Volumen |
| Pfu Master Mix, 2" | 50,0 l |
| Vorwärts-Primer, 10 m | 4,0 l |
| Reverse Primer, 10 m | 4,0 l |
| Cdna | 2,0 l |
| H2O | 40,0 l |
Tabelle 3: Einrichten eines PCR-Reaktionssystems
| Reagenzien | Volumen |
| DNA-Fragment/Vektor | 3,0 g |
| Bam Hallo | 1,0 l |
| Eco Ri | 1,0 l |
| Cutsmart-Puffer, 10" | 5,0 l |
| H2O | bis zu 50,0 l |
Tabelle 4: Doppelte Verdauung eines DNA-Fragments/Vektors
| Reagenzien | Volumen |
| einfügen | X l (0,09 pmol) |
| Vektor | Y -L (0,03 pmol) |
| Ligationspuffer, 10" | 1,0 l |
| T4 DNA Ligase, 400 U/L | 1,0 l |
| H2O | bis zu 10,0 l |
Tabelle 5: Ligation eines Genfragments in einen linearisierten Vektor
- Bildschirm positive Kolonien.
- Eine einzelne Kolonie von der LB-Platte in 200 l flüssiges LB-Medium mit 100 g/ml Ampicillin impfen und bei 37 °C, 250 U/min für 2 - 3 h inkubieren.
HINWEIS: Im Allgemeinen wählen Sie 4 - 8 Kolonien für das Screening positiver Kolonien. - Richten Sie eine 10-L-Kolonie-PCR-Reaktion ähnlich der in Schritt 3.2.1 ein.
ANMERKUNG: Verwenden Sie 1 L LB-Kultur anstelle von 1 L cDNA-Vorlage. - Visualisieren Sie die PCR-Produkte auf einem 1% Agarose-Gel. Die restliche Kultur mit einem positiven Ergebnis in 3 ml flüssiges LB-Medium mit 100 g/ml Ampicillin impfen und in einem 37 °C-Shaker bei 250 U/min für 14 - 16 h inkubieren.
- Isolieren Sie Plasmid-DNA aus rekombinanten E. coli-Kulturen mit einem Plasmid-Miniprep-Kit (siehe Materialtabelle).
- Identifizieren Sie die gereinigten rekombinanten Plasmide durch eine Doppelrestriktionsenzymanalyse (z. B. BamHI und EcoRI in diesem Protokoll). Richten Sie ein 10-L-Reaktionssystem ähnlich dem in Schritt 3.2.3 ein, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C für 3 h. Visualisieren Sie das spezifische Band, das aus dem rekombinanten Plasmid auf einem 1% Agarose-Gel freigesetzt wird.
- Eine einzelne Kolonie von der LB-Platte in 200 l flüssiges LB-Medium mit 100 g/ml Ampicillin impfen und bei 37 °C, 250 U/min für 2 - 3 h inkubieren.
- Überprüfen Sie die Sequenzen positiver rekombinanter Plasmide.
- Senden Sie die Plasmide zur Sequenzierung an ein Unternehmen. Analysieren Sie die Ergebnisse mit einer DNA-Sequenzanalysesoftware (siehe Materialtabelle), indem Sie die Sequenz des Sequenzierungsunternehmens mit der Referenzsequenz aus der GenBank-Datenbank vergleichen.
4. Express rekombinante Enzymproteine30
- Verwandeln Sie das richtige rekombinante Plasmid in kompetentes E. coli BL21(DE3).
- Fügen Sie 0,1 l des Plasmids auf 10 l des kompetenten E. coli BL21(DE3) in einem 1,5-ml-Röhrchen auf Eis und halten Sie die Röhre 5 min auf Eis.
- Hitze schockieren die Zellen in einem 42 °C-Wasserbad für 90 s und legen Sie es für 2 min wieder auf Eis.
- Fügen Sie 200 l LB flüssiges Medium ohne Antibiotika hinzu und in einem 37 °C-Shaker bei 220 Rprossen für 5 min brüten.
- Auf einer LB-Agarplatte, die 100 g/ml Ampicillin enthält, 50 l l Transformation verteilen und die Platte über Nacht in einem 37 °C-Inkubator inkubieren.
- Induzieren Sie die Expression von Genen.
- 3 - 5 Kolonien von der Platte in ein Rohr mit 3 ml flüssigem Medium mit 100 g/ml Ampicillin impfen und über Nacht in einem 37 °C-Shaker bei 250 U/min inkubieren.
- Übertragen Sie die gesamte Nachtkultur in 300 ml flüssiges Medium, das 100 g/ml Ampicillin enthält, und inkubieren Sie bei 250 Umdrehungen pro Minute in einem 37 °C-Shaker, bis die optische Dichte der Kultur bei 600 nm zwischen 0,4 - 0,6 liegt.
- Fügen Sie isopropyl-D-Thiogalactoside (IPTG) in die Kultur mit einer Endkonzentration von 0,2 mM ein und induzieren Sie die Expression der Gene bei 250 rpm, 20 - 22 °C für 3 h.
5. Reinigen Sie die rekombinanten Enzymproteine31
- Ernten Sie die Bakterien durch Zentrifugation der Kultur bei 4 °C, 12.000 x g für 10 min.
- Das Pellet in 15 ml bakteriellem Lysepuffer mit 0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 10% Glycerin, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 1 g/mL Aprotinin, 1 g/mL Leupeptin und 1 g/ml Pepstatin in 50 mM Tris-Cl (pH 8,0).
- Beschallen Sie die bakterielle Suspension, um die rekombinanten Enzymproteine freizusetzen, gefolgt von zentrifugierender Zentrifugation bei 13.000 x g, 4 °C für 10 min.
- Den Überstand in 1,5-ml-Rohren bei 1 ml/Rohr ernten und aliquotieren und bei -70 °C für die zukünftige Verwendung lagern.
- Wenden Sie 500 L His-Tag-Reinigungsharz (siehe Materialtabelle) auf eine wiederverwendbare leere Affinitätsspalte an. Waschen Sie das Harz mit 5 Bettvolumen von entionisiertem Wasser, um das Ethanol in der Stammlösung zu entsorgen. Das Harz mit 10 Bettvolumen des Bindungspuffers aus Tris-Cl (20 mM, pH 7,9), Imidazol (10 mM) und NaCl (0,5 M) ausgleichen.
- Tragen Sie 4 ml des Überstandes aus Schritt 5.4 auf eine Gülle des obigen Harzes auf und blockieren Sie zwei Enden der Säule mit Stopfen.
- Inkubieren Sie das Gemisch bei 4 °C auf einem Rotator bei niedriger Geschwindigkeit für 2 h.
- Waschen Sie das Fusionsprotein gebundenes Harz mit 15 Bettvolumen des Bindungspuffers bei 4 °C bei einer Durchflussrate von 1 ml/min vor der Elution.
- 500 l Elutionspuffer (mit 20 mM Tris-Cl (pH 7,9), 500 mM Imidazol, 0,5 M NaCl) in die Säule geben und die Gülle bei 4 °C bei einer niedrigen Geschwindigkeit für 10 min auf einem Rotator inkubieren.
- Wiederholen Sie Schritt 5.5 noch viermal.
- Waschen Sie das Harz sequenziell mit 10 Bettvolumen von entionisiertem Wasser und 3 Bettvolumen von 20% Ethanol. Das Harz in 20% Ethanol einweichen. Blockieren Sie die Säule mit Stoppern und lagern Sie sie bei 4 °C.
- Messen Sie die Konzentration der gereinigten Proteine durch den Bradford-Protein-Assay. Bestimmen Sie die Reinheit der Proteine auf einem 10% SDS-PAGE Gel und visualisieren Sie die Bänder durch den Coomassie blue staining assay.
- Fügen Sie Der gereinigten Proteinlösung Glycerin zu einer Endkonzentration von 10 % hinzu, um die Enzymaktivität zu stabilisieren. Aliquot und lagern Sie es bei -80 °C.
6. Produzieren Sie ein Flavonol aus einem Flavanon in einem in vitro bienzymsynthetischen System16
- Bereiten Sie Puffer vor.
- Machen Sie 2x synthetischepuffer ohne Eisensulfat bestehend aus 200 mM Tris-HCl (pH 7.2), 16,4 mM -Ketoglutersäure, 0,8% Natriumascorbat und 20% Glycerin. 1,938 g Tris-Basis, 0,640 g Natriumascorbat, 0,250 g Ketoglutersäure und 16 ml Glycerin bis 64 ml entionisiertes Wasser auflösen. PH mit Salzsäure (HCl) auf 7,2 einstellen und deionisiertes Wasser bis zu 80 ml hinzufügen. Bewahren Sie den Puffer bei 4 °C für die zukünftige Verwendung auf.
- Machen Sie eine 100-fache Stammlösung aus 2 mM Eisensulfat. 55,6 mg Eisensulfat-Heptahydrat in 50 ml entionisiertem Wasser auflösen, umrühren und Wasser bis zu 100 ml hinzufügen.
- Machen Sie eine Lagerlösung von 25 mM Flavonoid. Ein Flavonoid in Methanol gründlich auflösen und bei -20 °C lagern.
- Richten Sie ein synthetisches System ein, um ein Flavonol aus einem Flavanon herzustellen.
- Bereiten Sie das synthetische System vor, wie in Tabelle 6dargestellt.
- Inkubieren Sie die Reaktion bei 40 °C in einem offenen 2,0-ml-Rohr bei 600 U/min (in einem schüttenden Wärmeblock) für 40 min.
- Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 10 l Essigsäure und 100 l Ethylacetat hinzufügen.
- Zwei Stunden später die organischen Phasen auf 1,5-ml-Rohre zur Lufttrocknung in einer Haube bei Raumtemperatur übertragen.
| Reagenzien | Volumen |
| Synthetikpuffer ohne Eisensulfat | 50,0 l |
| 25 mM Flavonol | 2,0 l |
| 2 mM Eisensulfat | 0,5 l |
| 1 mg/ml AtF3H | 2,5 l |
| 1 mg/ml BeiFLS1 | 2,5 l |
| 25 mM Flavanon | 2,0 l |
| H2O | bis zu 100,0 l |
Tabelle 6: Das in diesem Protokoll verwendete synthetische System.
7. Analysieren Sie die Reaktionsprodukte
- Dünnschichtchromatographie (TLC) Analyse.
- 5 Rohre der Flavonoidproben ab Schritt 6.2.4 bündeln und zur Lufttrocknung 300 l herausnehmen. Lösen Sie das Flavonoidpulver in 160 l Methanol auf. Bereiten Sie authentische Flavonoidproben mit seriellen Konzentrationen von 12,5, 25, 50, 100 und 200 ng/l in Methanol vor. Die Reaktionsproben und die authentischen Flavonoidproben auf Polyamid 6 Platten aufgeben.
- Führen Sie die probenbelasteten Platten in einem Lösungsmittelsystem aus Chloroform/Methanol/Ethylacetat/Ameisensäure im Verhältnis 5,0:1,5:1,0:0,5 aus.
- Die Platten werden bei Raumtemperatur an die Luft trocknen. Sprühen Sie die Platten mit 1% Ethanollösung aus Aluminiumchlorid (AlCl3), gefolgt von der Lufttrocknung wieder bei Raumtemperatur.
- 30 Minuten später visualisieren Sie die Flecken auf den Platten unter einem UV-Licht bei 254 nm und nehmen Sie Bilder auf.
- Analysieren Sie den Grauwert jedes Spots auf den Bildern mit einer Bildverarbeitungssoftware (z. B. ImageJ v1.51j8 in diesem Protokoll).
- Öffnen Sie die Software ImageJ. Klicken Sie auf Datei > Öffnen, um das zu analysierende Bild zu öffnen.
- Klicken Sie in der ImageJ-Benutzeroberfläche auf die linke R-Ectang-Auswahl-Tool. Beschreiben Sie den Bereich von Interesse (ROI)
im Bild mit der Maus und drücken Sie, um den ersten ROI zu kennzeichnen. - Bewegen Sie die rechteckige Auswahl mit der
Maus nach rechts zum nächsten ROI, und drücken Sie, um den zweiten ROI zu beschriften. - Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, um alle anderen ROIs zu beschriften.
- Drücken
Sie die Taste , um Profildiagramme für alle ROIs in einem Popupfenster zu generieren.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt wird das Straight Line Selection Tool in der ImageJ-Benutzeroberfläche automatisch aktiviert. - Verwenden Sie das Auswahlwerkzeug gerade, um Basislinien zu zeichnen, um einen geschlossenen Bereich für jeden Spitzenwert zu definieren.
- Aktivieren Sie das Wand-Tool, indem Sie auf das entsprechende Symbol in der ImageJ-Benutzeroberfläche klicken. Klicken Sie in die Spitze, um die Ergebnisse für alle Spitzen in einem Popupfenster anzuzeigen.
- Erstellen Sie eine TLC-basierte Standardkurve des authentischen Flavonoids, indem Sie die Grauwerte aus Schritt 7.1.5.7 mit den entsprechenden Flavonoidkonzentrationen aus Schritt 7.1.1. Berechnen Sie dann die Ausbeute des in diesem Protokoll erzeugten Flavonoids nach der resultierenden Formel.
- Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie (LC/MS) Analysen
- Verarbeiten Sie die Proben von Schritt 7.1.1 sequenziell bis zu 0,45 m und 0,22 m Filtern.
- Laden Sie die Proben in ein HPLC/LC/MS-System (siehe Materialtabelle) und trennen Sie die Proben bei 30 °C mit einer C18-Säule (4,6 x 150 mm; i.d.d., 5 m). Die Säule bei 1,0 ml/min mit einem Gradienten von 10 - 85% (v/v) Acetonitril (ACN) in Wasser (0 - 10 min, 10 - 25% ACN; 10 - 35 min, 25 - 50% ACN; 35 - 45 min, 50 - 85% ACN; 45 - 50 min, 85 - 10% ACN; 50 - 60 min , 10% ACN) und überwachen die Absorption des Eluats von 200 bis 800 nm. Führen Sie die LC/MS-Analyse im negativen Ionenmodus mit einem Trocknungsstickstoffstrom von 10 l/min bei 300 °C und einem Mantelgasstrom von 7 l/min bei 250 °C durch und sammeln Sie Daten mit einer eingebauten Software (siehe Materialtabelle).
- Extrahieren Sie Chromatographen mit einer Wellenlänge, um die Spitzenbereiche von Reaktionsproben und authentischen Flavonoidverbindungen mit einer Software zu berechnen (siehe Tabelle der Materialien).
- Öffnen Sie das Qualitative Analyseprogramm, und klicken Sie auf Datei > Datendatei öffnen. Wählen Sie die zu analysierenden Dateien im Fenster Datendatei öffnen aus, und klicken Sie auf Öffnen, um die Datei(n) zu öffnen.
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste im Fenster Chromatogramm Results und dann auf die Extract C-Hromatogramme in einem Pop-up-Menü.
- Öffnen Sie dasDialogfeld Extract Chromatogram. Klicken Sie in der Liste Typ auf Andere Chromatogramme. Wählen Sie im Feld Detektor-Kombination SEN DAD1 aus. Klicken Sie dann auf OK, um die HPLC-Ergebnisse im Fenster C-Hromatogramm-Ergebnisse anzuzeigen.
- Klicken Sie auf das M-Jahres-I-Ntegration-Symbol, das oben im Fenster C-Hromatogramm-Ergebnisse angedockt ist. Zeichnen Sie eine Grundlinie für die Spitze, die für die manuelle Integrationsanalyse mit der Maus erforderlich ist.
- Klicken Sie auf Ansicht > Integrations-Peak-Liste, um die Ergebnisse anzuzeigen.
- Erstellen Sie eine HPLC-basierte Standardkurve des authentischen Flavonoids, indem Sie die Spitzenbereiche ab Schritt 7.2.3.5 gegen die entsprechenden Flavonoidkonzentrationen ab Schritt 7.2.1 aufstellen. Berechnen Sie dann die Ausbeute des in diesem Protokoll erzeugten Flavonoids nach der resultierenden Formel.
- Analysieren Sie die MS-Daten auf die genaue Masse der Flavonoidverbindungen mit einer Software (siehe Tabelle der Materialien).
- Wiederholen Sie die Schritte 7.2.3.1 - 7.2.3.3.
- Klicken Sie auf der SymbolleisteC-Hromatogramm-Ergebnisse auf das Symbol Bereichsauswahl.
- Wählen Sie den Höhepunkt des Interesses aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in den ausgewählten Bereich, und klicken Sie im Popupmenü auf das MS-Spektrum extrahieren, um die Ergebnisse im Fenster MS Spectrum Results anzuzeigen.
im Bild mit der Maus und drücken Sie, um den ersten ROI zu kennzeichnen.
Maus nach rechts zum nächsten ROI, und drücken Sie, um den zweiten ROI zu beschriften.
Sie die Taste , um Profildiagramme für alle ROIs in einem Popupfenster zu generieren.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
F3H und FLS1 sind zwei wichtige Schlüsselenzyme bei der Umwandlung eines Flavanons in ein Flavonol in Pflanzen, wie in Abbildung 1dargestellt. Entwicklung eines in vitro biosynthetischen Systems zur Herstellung eines Flavonols aus einem Flavanon, Atf3h (GenBank-Beitritt Nr. NM_114983.3) und Atfls1 (GenBank-Beitritt Nr. NM_120951.3) Gene wurden aus den Sämlingen des 4 Wochen alten A. thaliana zu einem prokaryotischen Expressionsvektor pET-32a(+) geklont. Die rekombinanten Plasmide wurden in E. coli BL21(DE3) umgewandelt und die Fusionsproteine wurden nach IPTG-Induktion exprimiert, gefolgt von der Reinigung mit Ni-IDA-Agaroseharzen. Wie in Abbildung 2dargestellt, zeigten die gereinigten Fusionsproteine eine hohe Reinheit von über 95% auf einem 10% SDS-PAGE Gel, die rein genug für den Aufbau einer in vitro bienzymatischen Kaskade waren.
Abbildung 1: Schematische Darstellung für die Biosynthese eines Flavonols aus einem Flavanonin vitro. F3H, Flavanon 3-Hydroxylase; FLS1, Flavonol-Synthase 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Reinigung rekombinanter AtF3H- und AtFLS1-Proteine. Die Atf3h- und Atfls1-Gene wurden von 4 Wochen alten Sämlingen von Arabidopsis thaliana zu einem prokaryotischen Expressionsvektor pET-32a(+) geklont und in Escherichia coli BL21(DE3) exprimiert. Die rekombinanten Proteine wurden durch eine mit Ni-IDA-Agaroseharzen gefüllte Affinitätschromatographiesäule gereinigt. Die Reinheit wurde auf einem 10% SDS-PAGE Gel bestimmt. M, Proteinmarker; 1, rekombinantes AtF3H-Protein; 2, rekombinantes AtFLS1-Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Um eine bienzymatische Kaskade mit den gereinigten rekombinanten Proteinen zu etablieren, wurde ein synthetisches System hergestellt, wie in Tabelle 6dargestellt. Um festzustellen, ob dieses System für die Umwandlung eines Flavanons in ein Flavonol verwendet werden kann, wurde NRN in das System aufgenommen, und die Biosynthese von KMF wurde durch TLC- und HPLC/LC/MS-Analysen nachgewiesen. Wie in Abbildung 3Adargestellt, entstanden zwei neue Flecken auf einer Polyamid-TLC-Platte. Ein Punkt zeigte eine Migrationsentfernung ähnlich der von Dihydrokaempferol (DHK), und der andere ähnlich wie der von KMF. Weitere Analysen von HPLC und LC/MS zeigten, dass die neuen Chemikalien eine Retentionszeit von 11,91 min bzw. 20,16 min bzw. (Abbildung 3B) und einen quasi-molekularen Ionenspitzenwert [M-H] bei m/z 287.0500 bzw. 285.0500 zeigten ( Abbildung3C ), die mit denen von DHK bzw. KMF identisch waren. Die Daten deuten darauf hin, dass KMF aus NRN in diesem System hergestellt wurde und der Ertrag bis zu 34,94 mg/L betrug.
Abbildung 3: Synthese von KMF aus NRN in einer bienzymatischen Kaskade. (A) Analyse der Ein-Topf-Reaktionsprodukte durch Polyamid TLC. 1, NRN-Standard; 2, DHK-Standard; 3, KMF-Standard; 4, Reaktionsgemisch. (B) HPLC-Analyseprofile der Reaktionsprodukte. NRN, DHK und KMF wiesen eine Retentionszeit von 18,74 min, 11,91 min bzw. 20,16 min auf. (C) MS-Analyseprofile der Flavonoidverbindungen in den Reaktionsgemischen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Um weiter festzustellen, ob dieses In-vitro-System für die Umwandlung anderer Flavanone in ihre entsprechenden Flavonole verwendet werden kann, wurde dem System Eriodictyol (ERD) hinzugefügt, um festzustellen, ob ERD in Quercetin (QRC) umgewandelt werden kann. Wie in Abbildung 4Adargestellt, zeigten zwei neue Flecken auf einer Polyamid-TLC-Platte einen Migrationsabstand ähnlich dem von Dihydroquercetin (DHQ) bzw. QRC. HPLC- und LC/MS-Analysen zeigten, dass diese neuen Chemikalien eine Retentionszeit von 10,03 min bzw. 16,23 min bzw. (Abbildung 4B) und einen quasi-molekularen Ionenspitzenwert [M-H] bei m/z 303.1000 bzw. 301.1000 ( Abbildung4C) ergaben. , was genau denen von DHQ bzw. QRC entsprach. Die Daten deuten darauf hin, dass dieses System ERD in QRC umwandeln kann und der Ertrag 25,55 mg/L betrug.
Abbildung 4: Herstellung von QRC aus ERD in einem bienzymsynthetischen System. (A) Analyse der Reaktionsprodukte durch Polyamid TLC. 1, ERD-Standard; 2, DHQ-Standard; 3, QRC-Standard; 4, Reaktionsgemisch. (B) HPLC-Analyseprofile der Reaktionsprodukte. ERD, DHQ und QRC zeigten eine Retentionszeit von 15,45 min, 10,03 min bzw. 16,23 min an. (C) MS-Analyseprofile der Verbindungen in den Reaktionsgemischen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Eine ganze Reihe von Studien konzentrieren sich auf die Ableitung von Flavonolen aufgrund ihrer möglichen Anwendung in der Gesundheits- und Lebensmittelindustrie. Die traditionelle Pflanzenextraktion mit organischen Lösungsmitteln und der chemischen Synthese hat jedoch intrinsische Nachteile, die ihre Verwendung bei der Herstellung von Flavonolen einschränken. Hier berichten wir über eine detaillierte Methode zur Herstellung eines Flavonols aus einem Flavanon in einem Topf, indem wir eine in vitro bienzymatische Kaskade herstellen. Die entscheidenden Schritte in diesem Protokoll sind: 1) Die Gewinnung reiner rekombinanter Enzyme mit hoher Aktivität und 2) die Etablierung einer einpotbienzymatischen Reaktionskaskaskade. Im Allgemeinen bevorzugt die Expression pflanzlicher Gene in Bakterien den Inklusionskörper, was zum Verlust der Enzymaktivität führt. Wie wir wissen, helfen einige Peptide, wie TrxA und SUMO, die Expression und Löslichkeit von rekombinanten Proteinen, die in Bakterien exprimiert werden16. Daher ist es hilfreich, die Zielgene in die Plasmide zu klonen, die diese Expressions-Tags enthalten, wie pET-32a(+) und pET SUMO (Schritt 3.2.3). Es ist allgemein bekannt, dass IPTG-Konzentration und Induktionstemperatur zwei weitere entscheidende Parameter sind, die die Löslichkeit prokaryotisch exprimierter Proteine beeinflussen16. Um die Bildung des Inklusionskörpers weiter zu verringern, sollten die IPTG-Konzentration und die Induktionstemperatur optimiert werden. Die optimale IPTG-Konzentration und Induktionstemperatur hängt hauptsächlich von der Art der Plasmide und den Bakterienstämmen ab. In diesem Protokoll werden die IPTG-Konzentration und die Induktionstemperatur bei 0,2 mM bzw. 20 - 22 °C optimiert (Schritt 4.2.3). Darüber hinaus sind Temperatur und Glycerin zwei wichtige Parameter für die Aufrechterhaltung der Stabilität und Aktivität bei der Reinigung und Lagerung der rekombinanten Enzyme. In diesem Protokoll ist es entscheidend, die rekombinanten Proteine bei 4 °C zu reinigen (Schritte 5.5 - 5.12), 10% Glycerin in die Lösung gereinigter Enzyme (Schritt 5.13) zu geben und die Lösung sofort zu aliquotieren und bei -80 °C zu speichern (Schritt 5.13). Bei der Etablierung einer Ein-Topf-Reaktionskaskade sind pH und Temperatur zwei wichtige Parameter. Es liegt auf der Hand, dass ein zu hoher pH-Wert für die Umwandlung schädlich ist, da die Eisenionen (Fe2+),eine notwendige Komponente für die Enzymaktivität von rekombinanten F3H und FLS116,32,33, durch unter einem solchen Zustand eine Gülle aus Eisenhydroxid bilden. Obwohl eine relativ höhere Temperatur den Fortschritt einer enzymkatalysierten Reaktion erleichtert, wird eine zu hohe Temperatur das Enzym inaktivieren. Daher ist es für die Umwandlung entscheidend, den pH-Wert und die Reaktionstemperatur zu stabilisieren. Unsere vorherige Veröffentlichung legt den optimalen pH-Wert und die optimale Temperatur auf 7,2 bzw. 40 °C fest (Schritt 6)16.
Dieses Protokoll könnte bequem modifiziert werden, um eine Reihe von Flavonolen aus verschiedenen Flavanonen mit verschiedenen Substraten zu biosynthetisieren. In diesem Protokoll werden zwei Beispiele bereitgestellt. Wie in Abbildung 3dargestellt, wurden bei der Zugabe von NRN als Substrat in dieses System neue Chemikalien hergestellt. TLC- und HPLC/LC/MS-Analysen deuten darauf hin, dass die neuen Chemikalien DHK und KMF waren und die NRN in diesem System in das KMF umgewandelt wurde. Um das Vertrauen in die Ergebnisse weiter zu stärken, werden die spektrale Charakterisierung von 1H NMR (Wasserstoff-1 Kernspinresonanz), 13C NMR (Kohlenstoff-13 Kernspinresonanz), NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY), XRD (X-ray Pulverbeugung), CHN-Analysator und dergleichen kann erforderlich sein, um das Vorhandensein von Chemikalien in einer neuen Einheit zu bescheinigen. Ebenso könnte ERD in dieser bienzymatischen Kaskade erfolgreich in QRC umgewandelt werden (Abbildung 4).
Es gibt eine wichtige Einschränkung für diese Methode. Nach dem bekannten biosynthetischen Weg von Flavonoiden kann ein Flavonol durch dieses System aus einer aromatischen Aminosäure oder ihren nachgelagerten Derivaten hergestellt werden. Beispielsweise kann KMF aus p-Koumersäure durch eine Reihe von Schlüsselenzymen hergestellt werden, einschließlich 4-Coumaroyl:CoA-Ligase (4CL), Chalcone-Synthase (CHS), Chalcone-Isomerase (CHI), F3H und FLS23. In ähnlicher Weise kann QRC aus Koffeinsäure mit dem gleichen Panel von Schlüsselenzymen (unveröffentlichte Daten) hergestellt werden. Allerdings müssen Coenzym A (CoA), ATP und Manonyl-CoA in das System einbezogen werden, um p-Koumersäure in KMF umzuwandeln, was die Produktionskosten erheblich erhöhen wird. Daher ist dieses System in der Regel beschränkt, um ein Flavanon in ein Dihydroflavonol oder ein Flavonol umzuwandeln. Darüber hinaus ist die vollständige Umwandlung von Ausgangsmaterialien eine weitere Herausforderung. Um die Effizienz dieses Systems weiter zu verbessern, sollte sich die zukünftige Forschung auf das Screening wichtiger Enzyme mit hohen Aktivitäten anderer Pflanzen, die Mutation von Genen, die Schlüsselenzyme kodieren, die Immobilisierung der hochaktiven Enzyme zu inerten Trägern und Entwicklung eines besseren Puffersystems.
Dieses synthetische Ein-Topf-Bienzymsystem besitzt offensichtliche intrinsische Vorteile gegenüber anderen Ansätzen zur Herstellung eines Flavonols, wie chemische Synthese, mikrobielle Zellfabrik und Pflanzenextraktion mit organischen Lösungsmitteln16. Erstens ist die Reaktionszeit sehr kurz und benötigt nur 40 min, so dass dieses Produktionssystem arbeits- und zeitsparend ist. Zweitens gibt es in diesem System keine komplexe physiologische Regulation, wie sie in der Mikrobenzellfabrik aufgetreten ist, und außerdem sind alle Komponenten klar. Daher ist es einfach, die Reaktion genau zu steuern und somit bequem, um in Zukunft weitere Optimierungen vorzunehmen. Drittens, da dieses Reaktionssystem nur einfache Chemikalien und gereinigte rekombinante Enzyme enthält und nur ein wichtiges Zwischenprodukt erzeugt, wie in Abbildung 3 und Abbildung 4dargestellt, wird erwartet, dass es einfacher ist, die Zielmoleküle zu reinigen. in diesem System als die aus Zellfabriken und -anlagen erzeugt werden. Viertens sind die Hauptkomponenten des Systems häufige und billige Chemikalien und prokaryotisch exprimierte rekombinante Enzyme, so dass es sehr kostengünstig für diese Methode ist, gewünschte Flavonoide abzuleiten. Fünftens ist es aufgrund der Einfachheit der Komponenten dieses Systems einfach, für die Massenproduktion von Zielflavonoiden zu skalieren, was auf ein enormes Industrialisierungspotenzial hindeutet. Darüber hinaus bietet dieses System eine Anleitung für die wirtschaftliche Produktion anderer sekundärer Metaboliten.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von yangzhou University Specially Appointed Professor Start-up Funds, Jiangsu Specially Appointed Professor Start-up Funds, Six Talent Peaks Project in Jiangsu Province (Grant No. 2014-SWYY-016) und einem Projekt, das von die vorrangige Entwicklung des Akademischen Programms der Jiangsu-Hochschuleinrichtungen (Veterinärmedizin). Wir danken dem Testing Center der Yangzhou University für HPLC- und MS-Analysen von Flavonoiden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
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