Summary
A derivação de um flavonol é crucial para sua aplicação na saúde e na indústria alimentícia. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a biossíntese de um flavonol de um flavanone e discutimos as etapas cruciais e suas vantagens sobre outras aproximações.
Abstract
Os flavonóis são uma subclasse importante de flavonoides com uma variedade de atividades biológicas e farmacológicas. Aqui, nós fornecemos um método para a síntese enzimática in vitro de um flavonol. Neste método, Atf3h e Atfls1, dois genes chave na via biossintética dos flavonóis, são clonados e superexpressos em Escherichia coli. As enzimas recombinantes são purificadas através de uma coluna de afinidade e, em seguida, uma cascata bienzimática é estabelecida em um tampão sintético específico. Dois flavonóis são sintetizados neste sistema como exemplos e determinados pelas análises de TLC e HPLC/LC/MS. O método exibe vantagens óbvias na derivação de flavonóis sobre outras abordagens. É tempo e trabalho de poupança e altamente rentável. A reação é fácil de ser controlada com precisão e, assim, escalada para a produção em massa. O produto-alvo pode ser facilmente purificado devido aos componentes simples do sistema. No entanto, este sistema é geralmente restrito à produção de um flavonol de um flavanone.
Introduction
Os flavonóis são uma subclasse importante de flavonoides vegetais e estão envolvidos no desenvolvimento de plantas e na pigmentação1,2,3. Mais importante, estes compostos possuem uma ampla gama de atividades benéficas para a saúde, tais como anti-câncer4,5, anti-oxidativo6, anti-inflamatória7, antiobesidade8, anti-hipertensivo9 e as propriedades de recuperação de memória10, levando a um grande número de estudos sobre esses metabólitos secundários derivados da planta. Tradicionalmente, esses compostos são derivados principalmente da extração vegetal usando solventes orgânicos. No entanto, devido ao seu conteúdo muito baixo nas plantas11,12,13, o custo de produção para a maioria dos flavonóis permanece elevado, o que impõe grandes restrições à sua aplicação nos cuidados de saúde e os alimentos Indústria.
Durante as últimas décadas, os cientistas desenvolveram um grande número de métodos para derivar flavonoides14,15. Entretanto, a síntese química destas moléculas complicadas possui uma variedade de desvantagens intrínsecas16. Exige não somente reagentes tóxicos e condições extremas da reação, mas igualmente muitas etapas para produzir um composto do flavonóide do alvo14,17. Além disso, outro importante desafio nessa estratégia é a síntese quiral de moléculas ativas de flavonoides. Portanto, não é uma estratégia ideal para produzir flavonoides em escala comercial através da síntese química16,17.
Recentemente, os cientistas desenvolveram uma estratégia alternativa prometedora para produzir estes compostos naturais complicados por micróbios da engenharia com um caminho para a biossíntese flavonóide18,19,20, 21 anos de , 22, que foi decifrado com sucesso nas plantas23. Por exemplo, Duan et al. introduziram uma via biossintética na levedura brotamento Saccharomyces cerevisiae para produzir kaempferol (KMF)24. Malla et al. produziram astragalin, um flavonol glicosilado, introduzindoflavanona 3-hidroxilase (f3h), flavonol sintase (FLS1) e UDP-glicose: Flavonoide 3-O-glucosiltransferase UGT78K1 genes em Escherichia coliBL21 (de3)17. Mesmo que existam alguns paradigmas, nem todos os micróbios geneticamente modificados produzem os produtos de interesse devido à complexidade de uma plataforma celular, à incompatibilidade entre elementos genéticos e hospedeiros artificialmente sintetizados, o inibidor efeito de produtos-alvo contra células hospedeiras, e a instabilidade de um sistema celular projetado em si16.
Outra estratégia alternativa promissora para a produção de flavonoides é estabelecer uma cascata multienzimática in vitro. Cheng et al. relataram que as poliketides enterocina podem ser sintetizadas com sucesso através da montagem de uma via enzimática completa em um pote25. Esta estratégia sintética livre de células contorna as restrições de uma fábrica de produção microbiana e, portanto, é viável para a produção de alguns flavonoides em grande quantidade16.
Recentemente, nós desenvolvemos com sucesso um sistema sintético do bienzyme para converter naringenina (NRN) em KMF em um potenciômetro16. Aqui, descrevemos este sistema em grandes detalhes e os métodos envolvidos na análise dos produtos. Também apresentamos dois exemplos que utilizam este sistema para produzir KMF de NRN e quercetina (QRC) de eriodictyol (ERD). Além disso, discutimos etapas cruciais deste método e futuras direções de pesquisa na biossíntese de flavonoides.
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Protocol
1. isolar o RNA total dos tecidos da planta26,27
- Homogeneizar os tecidos da planta.
- Colete 100 mg de um tecido vegetal fresco (por exemplo, mudas de 4 semanas de idade de Arabidopsis Arabidopsis thaliana). Congelar o tecido e um pilão e argamassa com nitrogênio líquido, seguido pela moagem do tecido em pó.
- Adicionar 1 mL de reagente de isolamento de RNA (ver tabela de materiais) na argamassa. O reagente será congelado imediatamente. Homogeneizar a amostra de tecido com o pilão quando o reagente congelado derrete.
- Transfira o homogeneate a um tubo 1,5-mL, centrifugue a amostra em 12.000 x g por 5 minutos em 4 ° c, e transfira então a solução desmarcado do homogeneate a um outro tubo 1,5-ml fresco.
- Incubar a amostra homogeneizada à temperatura ambiente durante 5 min.
- Isolar o RNA total.
- Adicionar 0,2 mL de clorofórmio ao homogeneato, tampe o tubo firmemente, agitar o tubo vigorosamente à mão por 15 s, e incubar a amostra à temperatura ambiente durante 5 min.
- Centrifugue a amostra a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° c e transfira a fase aquosa superior incolor para um tubo fresco de 1,5 ml. A amostra se separa em três fases após a centrifugação.
- Adicionar 0,5 mL de álcool isopropílico à fase aquosa, agitar o tubo manualmente de forma vigorosa e incubar a mistura à temperatura ambiente durante 10 min.
- Centrifugue a mistura a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° c e retire o sobrenadante.
- Lave o pellet RNA uma vez com 1 mL de 75% de etanol por vortexing, seguido por centrifugação em 7.500 x g por 5 min a 4 ° c.
- Repita o passo 1.2.5.
- Seque o pellet durante 5-10 minutos e redissolva o RNA em água tratada com de (DEPC) introduzindo pipetagem para cima e para baixo, seguido pela medição da concentração total de RNA com um microespectrofotômetro (ver tabela de materiais).
2. sintetizar DNA complementar (cDNA)28
- Sintetizar a primeira vertente do cDNA utilizando um kit (ver tabela de materiais). Configurar um sistema de reação de 20 μL como mostrado na tabela 1 e incubar o tubo de reação em um instrumento de PCR por 50 min a 42 ° c, seguido por encerrar a reação a 85 ° c por 5 min. armazene o produto da reação em-20 ° c para a amplificação futura dos genes.
| Reagentes | Volume |
| dNTP Mix, 2.5 mM cada | 4,0 μL |
| Primer Mix | 2,0 μL |
| Modelo de RNA | 1,0 μg |
| Reverse Transcriptase buffer, 5 × | 4,0 μL |
| Transcriptase reversa, 200 U/μL | 1,0 μL |
| RNase-Free H2O | até 20,0 μL |
Tabela 1: transcrição reversa do RNA total em cDNA
3. construir plasmídeos recombinantes29
- Projete primers de PCR.
- Projete os primers do PCR usando um software (veja a tabela dos materiais) baseado nas seqüências dos genes chaves da enzima obtidos da base de dados de GenBank e sintetize os primers por uma companhia (veja a tabela de materiais). Na extremidade 5 ' da primeira demão, adicione um local da enzima da limitação (por exemplo, BamOi ou ecori neste protocolo).
Nota: os primers utilizados neste estudo estão apresentados na tabela 2.
- Projete os primers do PCR usando um software (veja a tabela dos materiais) baseado nas seqüências dos genes chaves da enzima obtidos da base de dados de GenBank e sintetize os primers por uma companhia (veja a tabela de materiais). Na extremidade 5 ' da primeira demão, adicione um local da enzima da limitação (por exemplo, BamOi ou ecori neste protocolo).
| Seqüência, 5 ' → 3 ' | Propósito |
| AAGgatccatggctccaggaactttgact | Iniciador dianteiro para a amplificação do PCR do gene Atf3h do thaliana de Arabidopsis. Bam Hi site é em itálico e anexado para clonagem em pET32a (+). |
| ctaagcgaagatttggtcga de AAGaattc | Primer reverso para amplificação de PCR do gene Atf3h de a. thaliana. Eco O site do RI é italicizado e anexado para clonagem em pET32a (+). |
| AAGgatccatggaggtcgaaagagtcca | Iniciador dianteiro para a amplificação do PCR do gene Atfls1 de a. thaliana. Bam Hi site é em itálico e anexado para clonagem em pET32a (+). |
| tcaatccagaggaagtttat AAGaattc | Primer reverso para amplificação de PCR do gene Atfls1 de a. thaliana. Eco O site do RI é italicizado e anexado para clonagem em pET32a (+). |
Tabela 2: primers de oligonucleotídeo utilizados no estudo atual
- Clone os genes em um vetor procariótico da expressão.
- Amplificar os genes da primeira vertente do cDNA sintetizado usando uma polimerase de DNA de alta fidelidade (ver tabela de materiais). Configurar um sistema de reação de PCR de 100 μL como mostrado na tabela 3 e executar o seguinte ciclo de pcr: 94 ° c por 2 min para desnaturação inicial; Então 35 ciclos de 94 ° c para 30 s para a desnaturação, 55 ° c para 2 minutos para o recozimento, e 72 ° c para 1 minuto para a extensão; seguido de um alongamento final a 72 ° c durante 10 min. resfrie a mistura de reação a 12 ° c.
Nota: o tempo de extensão é variável e determinado pelo comprimento do gene com a polimerização de aproximadamente 1000 bases por o minuto para a maioria de Polymerases do ADN. - Visualize os produtos do PCR (o mais geralmente 5 μL) em um gel do agarose de 1% e purificar o fragmento específico do ADN dos produtos restantes usando um jogo da limpeza do ADN (veja a tabela de materiais).
- Digerir o fragmento de DNA purificado e o vetor (por exemplo, pET-32A (+)) com enzimas de restrição (por exemplo, BamHi ou ecori neste protocolo). Configurar um sistema de reação de 50 μL em um tubo de PCR de 0,2 mL como mostrado na tabela 4 e incubar a mistura a 37 ° c por 3 h. Separe o DNA digerido em um gel de agarose a 1%.
- Recupere a banda de DNA usando um kit de extração de gel (ver tabela de materiais). Purificar ainda mais o DNA usando um kit de limpeza de DNA (ver tabela de materiais), seguido pela medição da concentração de DNA com um microespectrofotômetro (ver tabela de materiais).
- Ligate o fragmento do gene no ADN linearizada do vetor usando uma ligase do ADN T4 (veja a tabela dos materiais). Configurar uma reação de ligadura em um tubo de 1,5 mL como mostrado na tabela 5 e incubar o tubo à temperatura ambiente por 2-3 h.
Nota: a razão molar de uma pastilha para um vetor é variável e variou de 3:1 a 10:1. - Adicionar 2,5 μL da mistura de ligadura em 50 μL de células de Escherichia coli quimicamente competentes (por exemplo, 10 a 10 ou DH5α), misturar suavemente e manter o tubo no gelo durante 30 min. choque térmico das células a 42 ° c para 90 s e coloque imediatamente o tubo no gelo durante 2 min.
- Adicionar 200 μL de meio líquido LB sem antibióticos no tubo e incubar o tubo num agitador de 37 ° c a 220 rpm durante 1 h. Spread 50-100 μL das células numa placa LB contendo 100 μg/mL de ampicilina e incubar a 37 ° c durante a noite.
- Amplificar os genes da primeira vertente do cDNA sintetizado usando uma polimerase de DNA de alta fidelidade (ver tabela de materiais). Configurar um sistema de reação de PCR de 100 μL como mostrado na tabela 3 e executar o seguinte ciclo de pcr: 94 ° c por 2 min para desnaturação inicial; Então 35 ciclos de 94 ° c para 30 s para a desnaturação, 55 ° c para 2 minutos para o recozimento, e 72 ° c para 1 minuto para a extensão; seguido de um alongamento final a 72 ° c durante 10 min. resfrie a mistura de reação a 12 ° c.
| Reagentes | Volume |
| Pfu Master Mix, 2 × | 50,0 μL |
| Primer dianteiro, 10 μM | 4,0 μL |
| Primer reverso, 10 μM | 4,0 μL |
| Cdna | 2,0 μL |
| H2O | 40,0 μL |
Tabela 3: criação de um sistema de reacção de PCR
| Reagentes | Volume |
| Fragmento/vetor do ADN | 3,0 μg |
| Bam Oi | 1,0 μL |
| Eco Ri | 1,0 μL |
| Cutsmart buffer, 10 × | 5,0 μL |
| H2O | até 50,0 μL |
Tabela 4: digestão dupla de um fragmento de DNA/vetor
| Reagentes | Volume |
| Inserir | X μL (0, 9 pmol) |
| Vetor | ΜL de Y (0, 3 pmol) |
| Tampão da ligadura, 10 × | 1,0 μL |
| T4 DNA ligase, 400 U/μL | 1,0 μL |
| H2O | até 10,0 μL |
Tabela 5: ligadura de um fragmento de gene em um vetor linearizado
- Colónias positivas na tela.
- Inocular uma única colônia da placa LB em 200 μL de meio líquido LB contendo 100 μg/mL de ampicilina e incubar a 37 ° c, 250 rpm para 2-3 h.
Nota: em geral, escolha 4-8 colônias para triagem de colônias positivas. - Configurar uma reação de PCR de colônia de 10 μL similar àquela na etapa 3.2.1.
Nota: utilize 1 μL de cultura LB em vez de 1 μL de modelo de cDNA. - Visualize os produtos do PCR em um gel do agarose de 1%. Inocular a cultura remanescente com um resultado positivo em 3 mL de meio líquido LB contendo 100 μg/mL de ampicilina e incubar em um agitador de 37 ° c a 250 rpm para 14-16 h.
- Isole o DNA plasmídeo de culturas recombinantes de E. coli usando um kit de protocolo plasmídeo (ver tabela de materiais).
- Identifique os plasmíos recombinantes purificados por uma análise enzimática de dupla restrição (por exemplo, BamHi e ecori neste protocolo). Configurar um sistema de reação de 10 μL semelhante ao da etapa 3.2.3, seguido de incubação a 37 ° c por 3 h. visualize a banda específica liberada do plasmídeo recombinante em um gel de agarose a 1%.
- Inocular uma única colônia da placa LB em 200 μL de meio líquido LB contendo 100 μg/mL de ampicilina e incubar a 37 ° c, 250 rpm para 2-3 h.
- Verifique as sequências de plasmíos recombinantes positivos.
- Mande os plasmís para uma empresa para seqüenciamento. Analise os resultados utilizando um software de análise de sequências de DNA (vide tabela de materiais) comparando a sequência obtida da empresa de sequenciamento com a sequência de referência obtida do banco de dados GenBank.
4. proteínas recombinantes expressas da enzima30
- Transforme o plasmídeo recombinante correto em E. coli competente BL21 (de3).
- Adicionar 0,1 μL do plasmídeo a 10 μL de e. coli competente BL21 (de3) num tubo de 1,5 ml no gelo e manter o tubo no gelo durante 5 min.
- Choque térmico as pilhas em um banho de água de 42 ° c para 90 s e coloc o no gelo outra vez por 2 minutos.
- Adicionar 200 μL de meio líquido LB sem antibióticos e incubar num agitador de 37 ° c a 220 rpm durante 5 min.
- Espalhe 50 μL de transformação em uma placa de agar LB contendo 100 μg/mL de ampicilina e incubar a placa durante a noite em uma incubadora de 37 ° c.
- Induzir a expressão de genes.
- Inocular 3-5 colônias da placa em um tubo contendo 3 mL de meio líquido LB com 100 μg/mL de ampicilina e incubar a 250 rpm em um agitador de 37 ° c durante a noite.
- Transfira toda a cultura durante a noite em 300 mL de meio líquido LB contendo 100 μg/mL de ampicilina e incubar a 250 rpm em um agitador de 37 ° c até que a densidade óptica da cultura em 600 nm esteja entre 0,4-0,6.
- Adicionar isopropílico β-D-tiogalactosídeo (IPTG) na cultura com uma concentração final de 0,2 mM e induzir a expressão dos genes em 250 rpm, 20-22 ° c por 3 h.
5. purificar as proteínas enzimáticas recombinantes31
- Colher as bactérias por centrifugação da cultura a 4 ° c, 12.000 x g por 10 min.
- Ressuscitem o pellet em 15 mL de tampão de Lise bacteriana contendo 0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 10% glicerol, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 1 μg/mL aprotinina, 1 μg/mL de leupeptina e 1 μg/mL de pepstatina em 50 mM Tris-Cl (pH 8,0).
- SONICATE a suspensão bacteriana para liberar as proteínas da enzima recombinante, seguido por centrifugação em 13.000 x g, 4 ° c por 10 min.
- Colheita e alíquota do sobrenadante em tubos de 1,5 mL a 1 mL/tubo e armazená-los a-70 ° c para uso futuro.
- Aplique 500 μL de resina de purificação de sua marca (consulte a tabela de materiais) a uma coluna de afinidade vazia reutilizável. Lave a resina com 5 volumes de cama de água desionizada para descartar o etanol na solução de estoque. Equilibrar a resina com 10 volumes de leito do tampão de ligação compreendendo Tris-Cl (20 mM, pH 7,9), imidazol (10 mM) e NaCl (0,5 M).
- Aplique 4 mL do sobrenadante da etapa 5,4 a uma pasta da resina acima e bloqueie duas extremidades da coluna com rolhas.
- Incubar a mistura a 4 ° c num rotor a baixa velocidade durante 2 h.
- Lave a resina ligada à proteína de fusão com 15 volumes de cama do tampão de ligação a 4 ° c a um caudal de 1 mL/min antes da eluição.
- Adicionar 500 μL de tampão de eluição (contendo 20 mM de Tris-Cl (pH 7,9), 500 mM de imidazol, 0,5 M de NaCl) à coluna e incubar a lama a 4 ° c em um rotador a uma velocidade baixa por 10 min. colete o eluente como amostras de proteínas purificadas.
- Repita o passo 5,5 mais quatro vezes.
- Lave a resina sequencialmente com 10 volumes de leito de água desionizada e 3 volumes de cama de etanol a 20%. Mergulhe a resina em etanol a 20%. Bloqueie a coluna com rolhas e guarde-a a 4 ° c.
- Meça a concentração das proteínas purificadas pelo ensaio da proteína de Bradford. Determine a pureza das proteínas em um gel de SDS-PAGE de 10% e visualize as bandas pelo ensaio de coloração azul de Coomassie.
- Adicione o glicerol à solução de proteína purificada para uma concentração final de 10% para estabilizar a atividade enzimática. Aliquot e guarde-o em-80 ° c.
6. produzir um flavonol a partir de um flavanona num sistema sintético bienzimáticoin vitro16
- Prepare buffers.
- Fazer 2x tampão sintético sem sulfato ferroso consistindo de 200 mM Tris-HCl (pH 7,2), 16,4 mM α-cetoglutárico ácido, 0,8% ascorbato de sódio, e 20% glicerol. Dissolver 1,938 g de base de Tris, 0,640 g de ascorbato de sódio, 0,250 g de ácido α-cetoglutárico e 16 mL de glicerol a 64 mL de água desionizada. Ajuste o pH para 7,2 por ácido clorídrico (HCl) e adicione água deionizada até 80 mL. Armazene a memória intermédia a 4 ° c para utilização futura.
- Faça uma solução de estoque de 100x de sulfato ferroso de 2 mM. Dissolva 55,6 mg de sulfato ferroso heptahidrato em 50 mL de água desionizada, mexa e adicione água até 100 mL.
- Faça uma solução de stock de 25 mM de Flavonoide. Dissolva um Flavonoide em metanol completamente e armazenado a-20 ° C.
- Configurar um sistema sintético para produzir um flavonol a partir de um flavanone.
- Prepare o sistema sintético como mostrado na tabela 6.
- Incubar a reação a 40 ° c em um tubo aberto de 2,0 mL a 600 rpm (em um bloco de calor tremendo) por 40 min.
- Termine a reacção adicionando 10 μL de ácido acético e 100 μL de acetato de etilo.
- Duas horas mais tarde, transfira as fases orgânicas aos tubos 1,5-mL para a secagem do ar em uma capa na temperatura ambiente.
| Reagentes | Volume |
| 2 × tampão sintético sem sulfato ferroso | 50,0 μL |
| flavonol de 25 mM | 2,0 μL |
| sulfato ferroso de 2 mM | 0,5 μL |
| 1 mg/mL AtF3H | 2,5 μL |
| 1 mg/mL AtFLS1 | 2,5 μL |
| 25 milímetros flavanone | 2,0 μL |
| H2O | até 100,0 μL |
Tabela 6: o sistema sintético utilizado neste protocolo.
7. Analise os produtos de reação
- Análise de cromatografia em camada delgada (TLC).
- A associação 5 tubos das amostras do flavonóide da etapa 6.2.4 e toma para fora 300 μl para a secagem do ar. Redissolva o Flavonoide em pó em 160 μL de metanol. Prepare amostras autênticas de flavonoides com concentrações seriais de 12,5, 25, 50, 100 e 200 ng/μL em metanol. Carregar 1 μL das amostras de reacção e as autênticas amostras de flavonoides para as placas de poliamida 6.
- Execute as placas de amostra-carregadas em um sistema solvente que compreende o clorofórmio/metanol/acetato de etilo/ácido fórmico em uma relação de 5.0:1.5:1.0:0.5.
- Ar secar as placas à temperatura ambiente. Pulverize as placas com 1% de solução etanólico de cloreto de alumínio (AlCl3), seguida de secagem de ar novamente à temperatura ambiente.
- Trinta minutos depois, visualize as manchas nas placas uma luz UV em 254 nm e tirar imagens.
- Analise o valor de cinza de cada ponto nas imagens usando um software de processamento de imagem (por exemplo, ImageJ v 1.51, no presente protocolo).
- Abra o software ImageJ. Clique em arquivo > abrir para abrir a imagem a ser analisada.
- Clique na ferramenta de seleção de REctangmais à esquerda na interface de usuário do ImageJ. Delinear a região de interesse (ROI) na imagem com o mouse e pressione
para rotular o primeiro ROI. - Mova a seleção retangular com o direito do mouse para o próximo ROI e
Pressione para rotular o segundo ROI. - Repita a etapa anterior para rotular todos os outros ROIs.
- Pressione
para gerar plotagens de perfil para todos os Rois em uma janela pop-up.
Nota: neste momento, a ferramenta de seleção de linha reta na interface de usuário do ImageJ será ativada automaticamente. - Use a ferramenta de seleção de linha reta para desenhar linhas de base de modo a definir uma área fechada para cada pico de interesse.
- Ative a ferramenta varinha clicando no ícone correspondente na interface do usuário do ImageJ. Clique dentro do pico para exibir os resultados de todos os picos em uma janela pop-up.
- Faça uma curva padrão baseada em TLC do Flavonoide autêntico, traçando os valores de cinza da etapa 7.1.5.7 contra as concentrações correspondentes de flavonoides da etapa 7.1.1. Em seguida, calcule o rendimento do Flavonoide de interesse produzido neste protocolo de acordo com a fórmula resultante.
- Análise de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e cromatografia líquida/espectrometria de massas (LC/MS)
- Processe as amostras do passo 7.1.1 sequencialmente através dos filtros 0,45 μm e 0,22 μm.
- Coloque as amostras em um sistema HPLC/LC/MS (ver tabela de materiais) e separe as amostras a 30 ° c usando uma coluna C18 (4,6 × 150 mm; i.d., 5 μm). Elute a coluna em 1,0 mL/min por um gradiente de 10-85% (v/v) acetonitrila (ACN) em água (0-10 min, 10-25% ACN; 10-35 min, 25-50% ACN; 35-45 min, 50-85% ACN; 45-50 min, 85-10% ACN; 50-60 min , 10% ACN) e monitorizar a absorvância do eluato de 200 para 800 nm. Realize a análise LC/MS em um modo de íon negativo com um fluxo de nitrogênio de secagem de 10 L/min a 300 ° c e um fluxo de gás de bainha de 7 L/min a 250 ° c e colete dados usando um software incorporado (consulte a tabela de materiais).
- Extraia cromatógrafos de comprimento de onda único para calcular as áreas de pico de amostras de reação e compostos flavonoides autênticos usando um software (ver tabela de materiais).
- Abra o programa de análise qualitativa e clique em arquivo ≫ abrir arquivo de dados. Selecione o arquivo (s) a ser analisado na janela Abrir arquivo de dados e clique em abrir para abrir o arquivo (s).
- Clique com o botão direito do mouse na janela cromatograma RESULTADOS e, em seguida, oshromatograms de extract Cem um menu pop-up.
- Abra a caixa de diálogo Extract Chromatograms . Na lista tipo , clique em outros cromatogramas. Na caixa de combinação do detector , selecione DAD1. Em seguida, clique em OK para exibir os resultados de HPLC na janela de resultados dehromatogram C.
- Clique no ícone Manual Integration encaixado na parte superior da janela de resultados dehromatogram C. Desenhe uma linha base para o pico necessário para a análise de integração manual com o mouse.
- Clique em exibir ≫ lista de pico de integração para exibir os resultados.
- Faça uma curva padrão HPLC-baseada do flavonóide autêntico traçando as áreas máximas da etapa 7.2.3.5 de encontro às concentrações correspondentes do flavonóide da etapa 7.2.1. Em seguida, calcule o rendimento do Flavonoide de interesse produzido neste protocolo de acordo com a fórmula resultante.
- Analise os dados de MS para a massa exata de compostos flavonoides usando um software (ver tabela de materiais).
- Repita os passos 7.2.3.1-7.2.3.3.
- Clique no ícone selecionar intervalo na barra de ferramentas resultados dehromatogram C.
- Selecione o pico de interesse. Clique com o botão direito do mouse no intervalo selecionado e clique no extrato MS Spectrum no menu pop-up para exibir os resultados na janela resultados do MS Spectrum .
para rotular o primeiro ROI.
Pressione para rotular o segundo ROI.
para gerar plotagens de perfil para todos os Rois em uma janela pop-up.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
F3H e FLS1 são duas importantes enzimas chave na conversão de um flavanone em um flavonol em plantas como mostrado na Figura 1. Desenvolver um sistema biossintético in vitro para a produção de um flavonol a partir de um flavanone, Atf3h (GenBank adesão não. NM_ 114983.3) e Atfls1 (GenBank adesão não. NM_ 120951.3) os genes foram clonados a partir das mudas de 4 semanas de idade a. Arabidopsis thaliana em um vetor de expressão procariótica pET-32A (+). Os plasmídos recombinantes foram transformados em e. coli BL21 (de3) e as proteínas de fusão foram expressas após indução de IPTG, seguidas de purificação por meio de resinas de agarose de Ni-ida. Como mostrado na Figura 2, as proteínas de fusão purificada mostraram uma alta pureza de mais de 95% em um gel de SDS-PAGE de 10%, que foram puros o suficiente para o estabelecimento de uma cascata bienzimática in vitro.
Figura 1: representação esquemática para a biossíntese de um flavonol a partir de um flavanonain vitro. F3H, flavanona 3-hidroxilase; FLS1, flavonol sintase 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: purificação de proteínas recombinantes AtF3H e AtFLS1. Os genes Atf3h e Atfls1 foram clonados de mudas de 4 semanas de idade de Arabidopsis Arabidopsis thaliana em um vetor de expressão procariótica pET-32A (+) e expressos em Escherichia coli BL21 (de3). As proteínas recombinantes foram purificadas através de uma coluna de cromatografia de afinidade preenchida com resinas de agarose Ni-IDA. A pureza foi determinada em um gel de SDS-PAGE de 10%. M, marcadores proteicos; 1, proteína AtF3H recombinante; 2, proteína AtFLS1 recombinante. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para estabelecer uma cascata bienzimática utilizando as proteínas recombinantes purificadas, foi elaborado um sistema sintético como mostrado na tabela 6. Para determinar se este sistema pode ser usado para a conversão de um flavanone em um flavonol, NRN foi adicionado ao sistema, e a biossíntese de KMF foi detectada pelas análises de TLC e HPLC/LC/MS. Como mostrado na Figura 3a, surgiram dois novos pontos em uma placa de poliamida TLC. Um ponto mostrou uma distância da migração similar àquela do dihydrokaempferol (DHK), e o outro similar àquele de KMF. A análise adicional por HPLC e por LC/MS demonstrou que os produtos químicos novos mostraram um tempo de retenção de 11,91 minutos e de 20,16 minutos, respectivamente (Figura 3B) e um pico quase-molecular do íon [m − H]− em m/z 287, 500 e em 285, 500, respectivamente (Figura 3C ), que eram idênticos aos de DHK e KMF, respectivamente. Os dados indicam que o KMF foi produzido a partir do NRN neste sistema e o rendimento foi tão alto quanto 34,94 mg/L.
Figura 3: síntese de KMF de NRN em cascata bienzimática. (A) análise dos produtos de reação de um pote por poliamida TLC. 1, padrão de NRN; 2, padrão de DHK; 3, padrão de KMF; 4, mistura da reação. B) perfis de análise de HPLC dos produtos de reacção. NRN, DHK e KMF mostraram um tempo de retenção de 18,74 min, 11,91 min e 20,16 min, respectivamente. (C) perfis de análise de MS dos compostos flavonoides nas misturas de reacção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para determinar mais se este sistema in vitro pode ser usado para a conversão de outros flavanonas em seus flavonóis correspondentes, o eriodictyol (ERD) foi adicionado ao sistema para determinar se o ERD pode ser convertido em quercetina (QRC). Como mostrado na figura 4a, dois novos pontos em uma placa de poliamida TLC exibiu uma distância de migração semelhante à da diidroquercetina (DHQ) e QRC, respectivamente. As análises da HPLC e do LC/MS demonstraram que estes produtos químicos novos revelaram um tempo de retenção de 10, 3 minutos e de 16,23 minutos, respectivamente (Figura 4B) e um pico quasi-molecular do íon [m − H]− em m/z 303,1000 e em 301,1000, respectivamente (Figura 4C) , que correspondiam exatamente aos de DHQ e QRC, respectivamente. Os dados indicam que este sistema pode converter ERD em QRC e o rendimento foi 25,55 mg/L.
Figura 4: produção de QRC de ERD em um sistema sintético bienzimático. (A) análise dos produtos de reacção por poliamida TLC. 1, padrão de ERD; 2, padrão de DHQ; 3, padrão de QRC; 4, mistura da reação. B) perfis de análise de HPLC dos produtos de reacção. O ERD, o DHQ e o QRC exibiam um tempo de retenção de 15,45 min, 10, 3 min e 16,23 min, respectivamente. (C) perfis de análise de MS dos compostos nas misturas de reacção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um grande número de estudos são focados na derivação de flavonóis devido à sua potencial aplicação na saúde e na indústria alimentar. No entanto, a extração tradicional de plantas utilizando solventes orgânicos e síntese química possui desvantagens intrínsecas, que restringem seu uso na produção de flavonóis. Aqui, nós relatamos um método detalhado para produzir um flavonol de um flavanone em um potenciômetro estabelecendo uma cascata bienzimática in vitro. As etapas críticas neste protocolo são: 1) obtenção de enzimas recombinantes puras com altas atividades e 2) estabelecendo uma cascata de reação bienzimática de um pote. De um modo geral, a expressão de genes derivados de plantas em bactérias prefere formar corpo de inclusão, o que levará à perda da atividade enzimática. Como sabemos, alguns peptídeos, como TrxA e SUMO, ajudam a melhorar a expressão e a solubilidade das proteínas recombinantes expressas em bactérias16. Portanto, será útil clonar os genes alvo nos plasmídos contendo essas tags de expressão, como pET-32A (+) e SUMO de estimação (etapa 3.2.3). É sabido que a concentração de IPTG e a temperatura de indução são outros dois parâmetros cruciais que afetam a solubilidade de proteínas procariticamente expressas16. Para diminuir ainda mais a formação do corpo de inclusão, a concentração de IPTG e a temperatura de indução devem ser otimizadas. A concentração óptima de IPTG e a temperatura da indução dependem principalmente do tipo de plasmídeos e das tensões das bactérias. Neste protocolo, a concentração de IPTG e a temperatura da indução são aperfeiçoadas em 0,2 milímetros e em 20-22 ° c, respectivamente (etapa 4.2.3). Além disso, a temperatura e o glicerol são dois parâmetros importantes para manter a estabilidade e a atividade ao purificar e armazenar as enzimas recombinantes. Neste protocolo, é crucial para purificar as proteínas recombinantes a 4 ° c (passos 5,5-5,12), adicionar 10% de glicerol na solução de enzimas purificadas (passo 5,13), e imediatamente alíquota e armazenar a solução em-80 ° c (passo 5,13). No estabelecimento de uma cascata da reação do um-potenciômetro, o pH e a temperatura são dois parâmetros vitais. É óbvio que pH muito alto é prejudicial para a conversão porque os íons ferrosos (FE2 +), um componente necessário para a atividade enzimática de recombinante F3H eFLS1,16,32,33, são precipitados por formando uma lama de Hidróxido ferroso tal condição. Mesmo que uma temperatura relativamente mais elevada facilite o progresso de uma reação enzima-catalisada, a temperatura demasiado alta inativará a enzima. Conseqüentemente, é crítico para que a conversão estabilize o pH e a temperatura da reação. Nossa publicação anterior ajusta o pH e a temperatura os melhores em 7,2 e em 40 ° c, respectivamente (etapa 6)16.
Este protocolo poderia convenientemente ser modificado para biossintetize um número de flavonóis dos vários flavanonas usando carcaças diferentes. Neste protocolo, dois exemplos são fornecidos. Como mostrado na Figura 3, ao adicionar NRN como substrato para este sistema, novos produtos químicos foram produzidos. As análises de TLC e HPLC/LC/MS indicam que os novos produtos químicos foram DHK e KMF, e o NRN foi convertido no KMF neste sistema. Para fortalecer ainda mais a confiança nos resultados, a caracterização espectral de 1H RMN (hidrogênio-1 ressonância nuclear magnética), 13C RMN (carbono-13 ressonância nuclear magnética), NOESY (nuclear Overhauser Effect espectroscopia), XRD (raios-X difração do pó), o analisador de CHN e o gosto podem ser exigidos para atestar a presença de produtos químicos em uma entidade nova. Da mesma forma, o ERD pode ser convertido com sucesso no QRC nesta cascata bienzimática (Figura 4).
Há uma limitação importante para este método. De acordo com a via biossintética conhecida de flavonoides, um flavonol pode ser produzido por este sistema a partir de um aminoácido aromático ou seus derivados a jusante. Por exemplo, o kmf pode ser produzido a partir de ácido p-coumaric por uma série de enzimas-chave, incluindo 4-coumaroyl: COA-ligase (4cl), Chalcona sintase (CHS), Chalcona isomerase (Chi), F3H e FLS23. Da mesma forma, o QRC pode ser produzido a partir de ácido cafeico usando o mesmo painel de enzimas-chave (dados não publicados). No entanto, a coenzima A (CoA), ATP e manonyl-CoA precisam ser incluídas no sistema para converter o ácido p-coumaric em kmf, o que aumentará consideravelmente o custo de produção. Conseqüentemente, este sistema é restrito geralmente para converter um flavanone em um diidroflavonol ou em um flavonol. Além disso, a conversão completa de materiais de partida é outro desafio. Para melhorar ainda mais a eficiência deste sistema, futuras pesquisas devem ser focadas no rastreamento de enzimas-chave com altas atividades de outras plantas, mutação de genes codificantes de enzimas-chave, imobilização das enzimas altamente ativas para portadores inertes, e desenvolvimento de um melhor sistema tampão.
Este sistema sintético da bienzima de um potenciômetro possui vantagens intrínsecas óbvias sobre outras aproximações para produzir um flavonol, tal como a síntese química, a fábrica microbiana da pilha, e a extração da planta usando solventes orgânicos16. Firstly, o tempo de reação é muito curto e precisa somente 40 min, assim que este sistema de produção é labor-e tempo-saving. Em segundo lugar, não há nenhuma regulação fisiológica complexa neste sistema como ocorreu na fábrica de células microbianas e, além disso, todos os componentes são claros. Conseqüentemente, é fácil controlar a reação exatamente e assim conveniente fazer uma optimização mais adicional no futuro. Em terceiro lugar, uma vez que este sistema de reacção contém apenas produtos químicos simples e enzimas recombinantes purificadas e apenas gera um intermediário principal como demonstrado na Figura 3 e Figura 4, espera-se que seja mais fácil purificar as moléculas-alvo gerados neste sistema do que aqueles das fábricas e das plantas da pilha. Em quarto lugar, os principais componentes do sistema são produtos químicos comuns e baratos e procariticamente expressos enzimas recombinantes, por isso é altamente rentável para este método para derivar flavonoides desejados. Em quinto lugar, devido à simplicidade dos componentes deste sistema, é fácil escalar acima para a produção maciça de flavonoids do alvo, indicando um potencial enorme do industrialização. Além disso, este sistema fornece um guia para a produção econômica de outros metabólitos secundários.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Universidade Yangzhou especialmente nomeado professor start-up fundos, Jiangsu especialmente nomeado professor start-up fundos, seis Talent Peaks projeto na província de Jiangsu (Grant no. 2014-SWYY-016), e um projeto financiado por o desenvolvimento do programa acadêmico prioritário das instituições de ensino superior de Jiangsu (medicina veterinária). Agradecemos ao centro de testes da Universidade Yangzhou para análises de HPLC e MS de flavonoides.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
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