Summary

Биосинтез флавона на флаваноне путем создания одногоршкового биензиматического каскада

Published: August 14, 2019
doi:

Summary

Производные флавонола имеет решающее значение для его применения в здравоохранении и пищевой промышленности. Здесь мы предоставляем подробный протокол для биосинтеза флавона из флаванона и обсуждаем важнейшие шаги и его преимущества по сравнению с другими подходами.

Abstract

Флавонолы являются основным подклассом флавоноидов с различными биологическими и фармакологическими видами деятельности. Здесь мы предоставляем метод для ферментативного синтеза флавона. В этом методе, Atf3h и Atfls1, два ключевых гена в биосинтетических пути флавонол, клонируются и overexpressed в Escherichia coli. Рекомбинантные ферменты очищаются через столбец сродства, а затем в специфическом синтетическом буфере устанавливается двухэнзимный каскад. Два флавонала синтезируются в этой системе в качестве примеров и определяются tLC и HPLC/LC/MS анализами. Метод отображает очевидные преимущества в произветворении флавонолов по сравнению с другими подходами. Это экономия времени и труда и высокорентабельно. Реакция легко контролироваться и, таким образом, масштабируется для массового производства. Целевой продукт может быть легко очищен из-за простых компонентов в системе. Однако эта система обычно ограничивается производством флавонала из флаванона.

Introduction

Флавонол являются основным подклассом растительных флавоноидов иучаствуют в разработке растений и пигментации 1,2,3. Что еще более важно, эти соединения обладают широким спектромполезных для здоровья видов деятельности, таких как противорак 4,5,антиоксидантные6,противовоспалительные7,антиожирение8, антигипертензивные9 , и память вспомнить свойства10, что приводит к большому количеству исследований на этих растений полученных вторичных метаболитов. Традиционно, эти соединения главным образом выведены от экстракции завода используя органические растворители. Однако, из-за их очень низкого содержания на заводах11,12,13, себестоимость производства для большинства флавонол остается высокой, что накладывает большие ограничения на их применение в здравоохранении и продовольствии Промышленности.

За последние десятилетия ученые разработали целый ряд методов получения флавоноидов14,15. Однако химический синтез этих сложных молекул обладает различными недостатками16. Для этого требуются не только токсичные реагенты и экстремальные условия реакции, но и множество шагов для получения целевого флавоноидного соединения14,17. Кроме того, еще одной важной проблемой в этой стратегии является хиральный синтез активных молекул флавоноидов. Таким образом, это не идеальная стратегия для производства флавоноидов в коммерческом масштабе с помощью химического синтеза16,17.

Недавно ученые разработали перспективную альтернативную стратегию для производства этих сложных природных соединений инженерных микробов с пути для флавоноидного биосинтеза18,19,20, 21 год , 22, который был успешно расшифрочен в растениях23. Например, Duan et al. ввели биосинтетический путь в начинающие дрожжи Saccharomyces cerevisiae для производства kaempferol (KMF)24. Malla et al. производится астрагалин, гликозилированный флавонол, путем введенияфлаванона 3-гидроксилаза (f3h),флавонол синтаза(fls1), и UDP-глюкоза:флавоноид 3-O-glucosyltransferasa UGT78K1 генов в гены Escherichia coliBL21 (DE3)17. Несмотря на то, что существует довольно много парадигм, не все генетически модифицированные микробы производят продукты, представляющие интерес из-за сложности клеточной платформы, несовместимость между искусственно синтезированными генетическими элементами и хостами, ингибирующими влияние целевых продуктов против клеток-хозяев, и нестабильность инженерии клеточной системы себя16.

Еще одной перспективной альтернативной стратегией производства флавоноидов является создание мультиэнзимного каскада in vitro. Cheng et al. сообщили, что энтероциновые поликетиды могут быть успешно синтезированы путем сборки полного ферментативного пути в одном горшке25. Эта бесклеточная синтетическая стратегия обходит ограничения завода по производству микробов и, таким образом, осуществима для производства некоторых флавоноидов в большом количестве16.

Недавно мы успешно разработали биэнзим синтетическую систему для преобразования нарингенина (NRN) в KMF в одном горшке16. Здесь мы подробно описываем эту систему и методы, связанные с анализом продуктов. Мы также представляем два примера, которые используют эту систему для производства KMF из NRN и кверцетина (КРК) от эриодицита (ERD). Кроме того, мы обсуждаем важнейшие шаги этого метода и направления будущих исследований в биосинтезе флавоноидов.

Protocol

1. Изолировать общую РНК из тканей растений26,27 Гомогенизировать ткани растений. Соберите 100 мг свежей растительной ткани (например, 4-недельные саженцы из Arabidopsis thaliana). Заморозить ткани и пестик и раствор с жидким азотом, а затем шлифовальные ?…

Representative Results

F3H и FLS1 являются двумя важными ключевыми ферментами в преобразовании флаванона в флавонол в растениях, как показано на рисунке 1. Для разработки биосинтетической системы in vitro для производства флавонана из флаванона, Atf3h (Присоединение GenBank нет. NM-1149…

Discussion

Целый ряд исследований сосредоточены на произвлечения флавонолов в связи с их потенциальным применением в здравоохранении и пищевой промышленности. Однако традиционная добыча растений с использованием органических растворителей и химического синтеза обладает недоношениями, котор?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была финансово поддержана Университетом Яночжоу специально назначенным профессором стартовых фондов, Jiangsu специально назначенный профессор стартап фонды, шесть талантов Пики проекта в провинции Цзянсу (Грант No 2014-SWYY-016), и проект, финансируемый Приоритетная академическая программа развития высших учебных заведений Цзянсу (ветеринарная медицина). Мы благодарим Центр тестирования Университета Яночжоу для HPLC и MS анализы флавоноидов.

Materials

2× Pfu MasterMix Beijing CoWin Biotech Co., Ltd CW0717A PCR amplification of genes with high fidelity
Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system Agilent Technologies, Inc N/A an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS
Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) Agilent Technologies, Inc N/A a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system
dihydrokaempferol Sigma-Aldrich Co. LLC 91216 intermediate product for producing kaempferol from naringenin
dihydroquercetin Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine PCS0371 intermediate product for producing quercetin from eriodictyol
DNA Clean-up Kit Beijing CoWin Biotech Co., Ltd CW2301 purification of PCR-amplified or gel-purified DNA
eriodictyol Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. B21160 substrate for producing quercetin
Escherichia coli BL21(DE3) Beijing CoWin Biotech Co., Ltd CW0809 bacteria strain for expressing target genes
Escherichia coli DH5α Beijing CoWin Biotech Co., Ltd CW0808 bacteria strain for plasmid proliferation
FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System Labconco Corporation 7740020 an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent
Gel Extraction Kit Beijing CoWin Biotech Co., Ltd CW2302 purification of a DNA band from an agarose gel
Gel Imaging System Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. Tanon-
2500
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate
GenElute Plasmid Miniprep Kit Sigma-Aldrich Co. LLC PLN350-1KT minipreparation of plasmids
kaempferol Sigma-Aldrich Co. LLC 60010 final reaction product and standard substance
MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) Agilent Technologies, Inc N/A a software for analysis of HPLC/LC/MS data
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-8000-GL an equipment for determination of DNA/RNA concentration
naringenin Sigma-Aldrich Co. LLC N5893 substrate for producing kaempferol
Ni-IDA Agarose Resin Beijing CoWin Biotech Co., Ltd CW0010 purification of His-tagged fusion proteins
pET-32a(+) Novagen 69015-3 plasmid for cloning and expressing target genes
plasmid sequencing GENEWIZ Suzhou N/A sequencing of recombinant plasmids
primer synthesis GENEWIZ Suzhou N/A synthesis of PCR primers
quercetin Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. Q111273 final reaction product and standard substance
SuperRT cDNA Synthesis Kit Beijing CoWin Biotech Co., Ltd CW0741 synthesis of the first strand of cDNA from total RNA
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific EL0016 ligation of an insert into a linearized vector DNA
Trizol Thermo Fisher Scientific 15596018 isolation of total RNA
Vector NTI Advance Thermo Fisher Scientific 12605099 a software for PCR primer design and DNA sequence analysis
Xcalibur v2.0.7 Thermo Fisher Scientific N/A a software for analysis of HPLC data

References

  1. Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).
  2. Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development. European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).
  3. Cui, B., et al. Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods. Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).
  4. Li, X., et al. A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).
  5. Kim, H., et al. Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells. International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).
  6. Kimura, H., et al. Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME). Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).
  7. Cassidy, A., et al. Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).
  8. Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats. Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).
  9. Serban, M. C., et al. Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).
  10. Nakagawa, T., et al. Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer’s disease patients. Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).
  11. Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis. Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).
  12. Agar, O. T., et al. Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey. Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).
  13. Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).
  14. Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. New Synthetic Methods of Flavones. Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).
  15. Lu, Y. H., et al. Synthesis of luteolin and kaempferol (author’s transl). Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).
  16. Zhang, Z., et al. Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).
  17. Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).
  18. Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).
  19. Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).
  20. Miyahisa, I., et al. Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).
  21. Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).
  22. Koopman, F., et al. De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).
  23. Winkel-Shirley, B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).
  24. Duan, L., et al. Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).
  25. Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides. Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).
  26. Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. Preparation of RNA from plant tissue using trizol. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  27. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  28. Sambrook, J., Russell, D. W. Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  29. Sambrook, J., Russell, D. W. Directional cloning into plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  30. Sambrook, J., Russell, D. W. Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  31. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  32. Halbwirth, H., et al. Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).
  33. Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Z., Fan, S., Chen, Z., He, Y., Huang, M., Ding, L., Zhang, Y., Chen, L., Zhang, X. Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade. J. Vis. Exp. (150), e59336, doi:10.3791/59336 (2019).

View Video