الذرية البطانية المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSC-EPs) لديها القدرة على إحداث ثورة في علاجات أمراض القلب والأوعية الدموية وتمكين خلق نماذج أكثر إخلاصا لأمراض القلب والأوعية الدموية. هنا، يتم وصف تغليف iPSC-EPs في البيئات الدقيقة الكولاجين ثلاثية الأبعاد (3D) وتحليل كمي للإمكانات الأوعية الدموية لهذه الخلايا.
الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSCs) هي مصدر خلايا التكاثري خاص بالمريض يمكن أن يفرق في أي نوع من الخلايا الجسدية. وقد استمدت من كل من الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة الخلايا الجذعية المتعددة القوى، التي يمكن أن تفرق في أنواع الخلايا اللازمة لتجميع الأوعية الدموية الناضجة والوظيفية. ومع ذلك، لم يتم تقييم هذه الخلايا بدقة في بيئات ثلاثية الأبعاد، ولا يزال المقياس الكمي لإمكاناتها الأوعية الدموية بعيد المنال. هنا، يتم أولاً تحديد توليد وعزل iPSC-EPs عن طريق فرز الخلايا الفلورية المنشطة، تليها وصف للتغليف وثقافة iPSC-EPs في هيدروجيلات الكولاجين. هذه المصفوفة خارج الخلية (ECM) -محاكاة البيئة الدقيقة تشجع على استجابة الأوعية الدموية قوية; شبكات الأوعية الدموية تشكل بعد أسبوع من الثقافة. ويتم تحديد إنشاء خط أنابيب حسابي يستخدم برمجيات مفتوحة المصدر لتحديد كمية هذه الاستجابة الأوعية الدموية. تم تصميم خط الأنابيب هذا خصيصًا للحفاظ على البنية ثلاثية الجوانب للشبكة الشعرية لتحديد عدد الفروع ونقاط التفرع وطول الشبكة الإجمالي مع الحد الأدنى من مدخلات المستخدم.
وقد استخدمت الخلايا البطانية الوريد السري البشري (HUVECs) وأنواع الخلايا البطانية الأولية الأخرى لمدة عقدين لنمذجة الأوعية الدموية تنبت والتنمية في المختبر1. هذه المنصات الوعائية وعد لإلقاء الضوء على الآليات الجزيئية والأنسجة على مستوى أمراض القلب والأوعية الدموية، ويمكن أن تقدم نظرة فسيولوجية في تطوير شبكات الأوعية الدموية البدائية2،3. على الرغم من أن مجال النمذجة الوعائية قد شهد تقدما كبيرا، فإن اختبار “المعيار الذهبي” الذي يمكن أن نموذج كميا وتقييم تطور الأوعية الدموية الفسيولوجية لا يزال بعيد المنال. معظم البروتوكولات المنشورة لا تلخص بشكل كاف محراب الأوعية الدموية لتشجيع تشكيل الأوعية الدموية الناضجة والوظيفية أو ليس لديها طريقة لمقارنة كمية الإمكانات الأوعية الدموية لأنواع الخلايا المقدرة في ثلاثة أبعاد ( 3D).
العديد من نماذج الأوعية الدموية الحالية محدودة في قدرتها على تقليد محراب الأوعية الدموية الفسيولوجية. واحدة من الأكثر شيوعا المستخدمة في منصات المختبر هو البروتين الجيلاتيني القائم على خليط أنبوب تشكيل الاختبار. باختصار، يتم بذر HUVECs كخلايا واحدة على طبقة رقيقة من هلام الذي يتكون من البروتينات التي يتم حصادها من مصفوفة ساركوما المورين خارج الخلية (ECM)؛ في غضون يوم واحد إلى يومين، وHUVECs تجميع الذاتي في أنابيب بدائية4. ومع ذلك، تحدث هذه العملية في بعدين (2D) والخلايا البطانية (ECs) المستخدمة في هذا الفحص لا تشكل المغلقة، لومن جوفاء، وبالتالي الحد من الأهمية الفسيولوجية لهذه الدراسات. في الآونة الأخيرة، تم زراعة الخلايا الجذعية الإلكترونية والخلايا الداعمة (على سبيل المثال، الخلايا الجذعية المتوسطة (MSCs) وpericytes) في بيئات دقيقة ثلاثية المدة تحاكي الهندسة المعمارية الليفية لـ ECM الأصلي، مثل الكولاجين أو هيدروجيلات الفيبرين5. لنموذج تطوير الأوعية الدموية في هذه البيئة الدقيقة،وتستخدم عادة الخرز البوليمرالمغلفة مع ECs 6. إضافة عوامل النمو الخارجية و / أو عوامل النمو التي تفرزها الخلايا الأخرى جزءا لا يتجزأ من hydrogel يمكن أن تحفز ECs، طلاء الخرز البوليمري، لتنبت وتشكيل تجويف واحد؛ ويمكن بعد ذلك حساب عدد وقطر البراعم والأوعية. ومع ذلك، هذه البراعم هي فريدة من نوعها ولا تشكل شبكة مغلقة ومتصلة كما هو الحال في الظروف الفسيولوجية، وبالتالي هو أكثر تذكرنا نموذج الأوعية الدموية الورم. كما تم استخدام الأجهزة الميكروفلويدية لتقليد محراب الأوعية الدموية وتعزيز تشكيل الأوعية الدموية في هيدروجيلات محملة بالجماعة الأوروبية7،8. عادة، يتم تطبيق عامل نمو الأوعية والتدرج إلى وسط ثقافة الخلية المتداولة للحث على هجرة الجماعة الأوروبية وتنبت. الـ ECs التي تشكل تجويف الأوعية المتقدمة حساسة لإجهاد القص الناجم عن تطبيق تدفق السوائل من خلال الجهاز الميكروفلويديك؛ وبالتالي، فإن هذه الأجهزة microfluidic التقاط المعلمات الفسيولوجية الرئيسية التي لا يمكن الوصول إليها في النماذج الثابتة. ومع ذلك، تتطلب هذه الأجهزة قدرات تصنيع دقيق مكلفة.
والأهم من ذلك، جميع نماذج الأوعية الدموية الثلاثة (2D، 3D، microfluidic) تستخدم بشكل ساحق ECs الأولية، فضلا عن أنواع الخلايا الداعمة الأولية. لا يمكن تطوير الخلايا الأولية إلى علاج فعال للقلب والأوعية الدموية لأن الخلايا من شأنها أن تولد استجابة مناعية عند الزرع. وعلاوة على ذلك، HUVECs وأنواع الخلايا الأولية المماثلة ليست خاصة بالمريض ولا تلتقط تشوهات الأوعية الدموية التي تحدث في المرضى الذين يعانون من التصرف الوراثي أو الظروف الصحية الموجودة من قبل، على سبيل المثال، مرض السكري. ظهرت الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSCs) في العقد الماضي كمصدر للخلايا التكاثرية الخاصة بالمريض التي يمكن تمييزها في جميع الخلايا الجسدية في جسم الإنسان9. وعلى وجه الخصوص، نُشرت بروتوكولات تحدد توليد وعزل الذرية البطانية المستمدة من iPSC (iPSC-EPs)10و11؛ iPSC-EPs ثنائية القدرة، وبالتالي، يمكن تمييزها أكثر في الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء / pericytes، لبنات بناء الأوعية الدموية الناضجة والوظيفية. وقد فصلت دراسة واحدة فقط بشكل مقنع تطوير الضفيرة الشعرية الأولية من iPSC-EPs في بيئة دقيقة 3D12; على الرغم من أن هذه الدراسة أمر بالغ الأهمية لفهم الجمعية iPSC-EP والتمايز في هيدروجيلات الطبيعية والاصطناعية، فإنه لم يقارن كميا طبولوجيا الشبكة من الأوعية الدموية الناتجة. وقد استخدمت دراسة حديثة أخرى نموذج حبة البوليمر ية لمقارنة تنبت HUVECs وECs المستمدة من iPSC5. لذلك، هناك حاجة واضحة لمزيد من توضيح آليات الإشارات الفيزيائية والكيميائية التي تنظم الأوعية الدموية iPSC-EP في البيئات الدقيقة 3D وتحديد ما إذا كانت هذه الخلايا مناسبة للعلاج الإقفاري وأمراض القلب والأوعية الدموية النمذجه.
وفي العقد الماضي، تم تطوير خطوط أنابيب حسابية مفتوحة المصدر وخوارزميات هيكل عظمي مختلفة لتحديد طول شبكة الأوعية الدموية وترابطها ومقارنتهما. على سبيل المثال، وضعت Charwat وآخرون خط أنابيب يستند إلى فوتوشوب لاستخراج مرشحة، صورة binarized من شبكات الأوعية الدموية المستمدة من ثقافة مشتركة من الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية وECs في مصفوفة الفيبرين13،14. ربما أداة مقارنة الطبولوجيا الأكثر استخداما هو AngioTool, برنامج نشر على الانترنت من قبل المعهد الوطني للسرطان15; على الرغم من اعتماد البرنامج على نطاق واسع والإخلاص موثقة جيدا، ويقتصر البرنامج على تحليل هياكل تشبه السفن في بعدين وبرامج أخرى، بما في ذلك أنجيوسيس وويماسيس، تشترك في نفس الحد من الأبعاد16. وقد تم تطوير أجنحة برامج قوية مثل Imaris, Lucis, وMetamorph لتحليل طبولوجيا الشبكة من microvasculature المهندسة; ومع ذلك، هذه الأجنحة باهظة التكلفة لمعظم المختبرات الأكاديمية وتحد من الوصول إلى التعليمات البرمجية المصدر، والتي قد تعوق قدرة المستخدم النهائي على تخصيص الخوارزمية لتطبيقها المحدد. 3D تقطيع اللحم، وهو مفتوح المصدر التصوير بالرنين المغناطيسي / الحوسبة التصوير المقطعي حزمة، يحتوي على مجموعة أدوات النمذجة الأوعية الدموية التي يمكن تحليل فعال طبولوجيا شبكات الأوعية الدموية 3D17؛ ومع ذلك، يعتمد التحليل على وضع المستخدم يدوياً النقاط النهائية للشبكة، والتي قد تصبح مملة عند تحليل مجموعة بيانات كبيرة ويمكن أن تتأثر بتحيزات المستخدم اللاشعورية. في هذه المخطوطة، يتم وصف خط أنابيب حسابي يمكن أن يحدد مقدار شبكات الأوعية الدموية ثلاثية المدة بالتفصيل. للتغلب على القيود المذكورة أعلاه، يستخدم خط الأنابيب الحسابي المفتوح المصدر هذا ImageJ إلى الصور البؤرية المكتسبة قبل العملية لتحميل وحدة التخزين ثلاثية الأبعاد في محلل هيكل عظمي. محلل الهيكل العظمي يستخدم خوارزمية رقيق محور وسيط ة موازية، وقد تم تطويره في الأصل من قبل Kerschnitzki وآخرون لتحليل طول واتصال شبكات osteocyte18; يمكن تطبيق هذه الخوارزمية بشكل فعال لتوصيف طول واتصال microvasculature المهندسة.
وإجمالاً، يحدد هذا البروتوكول إنشاء شبكات الأوعية الدموية الدقيقة في البيئات الدقيقة ثلاثية الجوانب، ويوفر خط أنابيب حسابي مفتوح المصدر وخال ٍ من تحيز المستخدم لمقارنة الإمكانات الأوعية الدموية للـ iPSC-EPs بسهولة.
يتضمن هذا البروتوكول ثقافة الخلايا على المدى الطويل في ثلاثة أنواع من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا: E8، LaSR Basal، وEGM-2. ولذلك، ينبغي توخي الحذر الشديد لتعقيم جميع المواد بشكل مناسب. بالإضافة إلى ذلك، يجب ارتداء معاطف المختبر والقفازات التي يتم تنظيفها بالإيثانول دائمًا عند العمل في غطاء تدفق ?…
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية (منحة رقم 15SDG25740035، منحت لJ.Z.)، والمعهد الوطني للتصوير الطبي الحيوي والهندسة الحيوية (NIBIB) من المعاهد الوطنية للصحة (منحة رقم EB007507، منحت إلى C.C.)، و التحالف من أجل البحث والتدريب في مجال إعادة التأهيل التجديدي (AR3T، منحة رقم 1 P2C HD086843-01، منحت لJ.Z.). نود أن نعرب عن تقديرنا للبروفيسورة جين ستاشوياك (جامعة تكساس في أوستن) على مشورتها التقنية بشأن الفحص المجهري البؤري. كما أننا ممتنون للمناقشات مع صموئيل ميهيليتش (جامعة تكساس في أوستن)، والدكتورة أليسيا ألين (جامعة تكساس في أوستن)، والدكتورة جولي ريتلوفسكي (التكنولوجيا الحيوية التكيفية)، والدكتور ليون بيلان (جامعة فاندربيلت) لبصيرتهم في التحليل الحسابي للشبكات ثلاثية الجوانب. وأخيراً، نشكر الدكتور شياوبينغ باو (جامعة كاليفورنيا، بيركلي) على مشورته بشأن التمييز بين المراكز في مجال المجالات المتوسطة الأجل في مجال المجالات المتوسطة الأجل.
µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | N/A | A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging |
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile | Corning | 7007 | Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish |
Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS |
Advanced DMEM/F12 | Thermo Scientific | 12634010 | The base media for iPSC-EP differentiation. |
Barnstead GenPure xCAD Plus | Thermo Fisher Scientific | 50136165 | Water purification system; others can be readily substituted |
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture | Fisher Scientific | A8412 | To preserve cell viability when FACs sorting |
CD34-PE, human (clone: AC136) | Miltenyi Biotec | 130-098-140 | Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs |
CHIR99021 | LC Laboratories | C-6556 | Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells |
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg | VWR | 354249 | Main component of the 3D microenvironment |
Conical centrifuge tubes (15/50 mL) | Fisher Scientific | 14-959-49D/A | Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | To counterstain and visualize cell nuclei |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-250 | To wash monolayer cultures |
EDTA | Sigma-Aldrich | E8008 | For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting |
Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Promotes endothelial cell viability and proliferation |
Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For maintenance of pluripotent stem cells |
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) | Sigma-Aldrich | 50046 | Neutralizes remaining detergent |
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% | Sigma-Aldrich | A8960 | Component of iPSC-EP differentiation medium |
MATLAB | MathWorks | 1.8.0_152 | Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions) |
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) | Fisher Scientific | 356231 | Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation |
Medium-199 10X | Thermo Fisher Scientific | 1825015 | Used to balance final hydrogel osmolarity and pH |
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | VWR | 87003-294 | Stores small volumes of reagents |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | The main ingredient of the immunostaining solutions |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument |
Recombinant Human VEGF 165 Protein | R&D Systems | 293-VE | Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis |
Rhodamine phalloidin | Themo Fisher Scientific | R415 | To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks |
Triton X-100 (nonionic surfactant) | Sigma-Aldrich | X-100 | Detergent used to gently permeabilize cells |
Tween-20 (emulsifying reagent) | Fisher Scientific | BP337 | Increases the binding specificity of the added antibodies |
VE-Cadherin (F-8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9989 | To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels |
Vitronectin | ThermoFisher | A14700 | For maintenance of pluripotent stem cells |
Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded |