Endotelstamceller från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC-EPs) har potential att revolutionera hjärt-kärlsjukdom behandlingar och för att möjliggöra skapandet av mer trogna hjärt-kärlsjukdomar modeller. Häri, inkapsling av iPSC-EPs i tredimensionell (3D) kollagen mikromiljöer och en kvantitativ analys av dessa celler ‘ vasculogenic potential beskrivs.
Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) är en patient-specifik, proliferativ cell källa som kan differentiera till någon somatisk celltyp. Bipotenta endotelceller progenitorer (EPS), som kan differentiera till de celltyper som behövs för att montera mogen, funktionell kärl, har härletts från både embryonala och inducerade pluripotenta stamceller. Emellertid, dessa celler har inte rigoröst utvärderats i tredimensionella miljöer, och ett kvantitativt mått av deras vasculogenic potential förblir svårfångade. Här, generering och isolering av iPSC-EPs via fluorescerande-aktiverad cell sortering först beskrivs, följt av en beskrivning av inkapsling och kultur iPSC-EPs i kollagen hydrogels. Denna extracellulära matrix (ECM)-imitera mikromiljön uppmuntrar en robust vasculogenic svar; vaskulära nätverk bildas efter en veckas kultur. Skapandet av en datoriserad pipeline som använder öppen källkod för att kvantifiera detta vasculogenic svar är avgränsad. Denna pipeline är speciellt utformad för att bevara 3D-arkitekturen i kapillär plexus att robust identifiera antalet grenar, förgreningar punkter, och den totala nätverks längd med minimal indata från användaren.
Mänskliga navel ven endotelceller (huvecs) och andra primära endotelceller celltyper har utnyttjats i två decennier för att modellera blodkärl gro och utveckling in vitro-1. Sådana vaskulära plattformar lovar att belysa molekylär och vävnad-nivå mekanismer för hjärt-kärlsjukdom och kan presentera fysiologiska insikt i utvecklingen av primitiva vaskulära nätverk2,3. Även om området vaskulär modellering har bevittnat betydande framsteg, en “Gold Standard”-analys som kvantitativt kan modellera och bedöma fysiologiska vaskulär utveckling förblir svårfångade. De flesta publicerade protokoll inte tillräckligt rekapitulera den vaskulära nisch för att uppmuntra bildandet av mogna, funktionella blodkärl eller inte har en metod för att kvantitativt jämföra vasculogenic potentialen hos de bedömda celltyper i tre dimensioner ( 3D).
Många nuvarande vaskulära modeller är begränsade i sin förmåga att efterlikna den fysiologiska vaskulära nisch. En av de vanligaste används in vitro-plattformar är gelatinös proteinblandning-baserade rör formation assay. Kortfattat, huvecs är seedade som enstaka celler på ett tunt lager av gel som består av proteiner skördas från murina sarkom extracellulära matrix (ECM); inom en till två dagar, HUVECs själv montera i primitiva rör4. Emellertid, denna process sker i två dimensioner (2D) och endotelceller (ECs) utnyttjas i denna analys inte bildar slutna, ihåliga lumen, vilket begränsar den fysiologiska betydelsen av dessa studier. Mer nyligen, ECs och stödjande celler (t. ex., mesenkymala stamceller (MSCS) och pericyter) har samodlas i 3D-mikromiljöer som simulerar den fibrösa arkitekturen hos den infödda ECM, såsom kollagen eller fibrin hydrogeler5. För att modellera vaskulär utveckling i denna mikromiljö, polymera pärlor belagda med ECs vanligtvis används6. Tillsats av exogena tillväxtfaktorer och/eller tillväxtfaktorer som utsöndras av andra celler som är inbäddade i Hydrogelen kan inducera ECs, belägga polymerpärlor, spira och bilda enkellumen. antalet och diametern på groddar och kärl kan sedan beräknas. Emellertid, dessa groddar är singular och inte bildar en sluten, anslutna nätverk som ses i fysiologiska förhållanden och därmed är mer påminner om en tumör kärlsystemet modell. Microfluidic enheter har också utnyttjats för att efterlikna den vaskulära nisch och att främja bildandet av kärl i EG-lastad hydrogeler7,8. Typiskt, en angiogen tillväxtfaktor-gradient appliceras på cirkulerande cellodlingsmedium för att inducera EG migration och Sprouting. ECs som utgör lumen av utvecklade fartyg är känsliga för skjuvning stress induceras av tillämpningen av vätskeflödet genom mikroflödessystem enheten; dessa mikrofluidiska enheter fångar därför viktiga fysiologiska parametrar som inte är tillgängliga i de statiska modellerna. Dessa enheter kräver dock kostsamma mikrofabrikationsförmågor.
Viktigast av allt, alla tre vaskulära modeller (2D, 3D, microfluidic) överväldigande utnyttja primära ECs samt primära stödjande celltyper. Primära celler kan inte utvecklas till en effektiv kardiovaskulär terapi eftersom cellerna skulle kunna skapa ett immunsvar vid implantation; Dessutom, HUVECs och liknande primära celltyper är inte patientspecifika och inte fånga vaskulära avvikelser som förekommer hos patienter med en genetisk disposition eller redan existerande hälsotillstånd, t. ex., diabetes mellitus. Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) har vuxit fram under det senaste decenniet som en patient-specifik, proliferativ cell källa som kan differentieras till alla somatiska celler i människokroppen9. I synnerhet har protokoll publicerats som beskriver generering och isolering av IPSC-härledda endotelceller progenitorer (IPSC-EPS)10,11; iPSC-EPs är bipotenta och kan därför ytterligare differentieras till endotelceller och glatta muskelceller/pericyter, byggstenarna i mogna, funktionell vasculature. Endast en studie har övertygande detaljerade utvecklingen av en primär kapillär plexus från iPSC-EPs i en 3D-mikromiljö12; även om denna studie är kritisk till en förståelse av iPSC-EP församling och differentiering i naturliga och syntetiska hydrogels, det inte kvantitativt jämföra nätverkstopologier av den resulterande vasculature. En annan nyligen studie har använt polymera pärla modell för att jämföra groning av huvecs och IPSC-härledda ECs5. Därför finns det ett tydligt behov av att ytterligare belysa de fysiska och kemiska signalmekanismerna som reglerar iPSC-EP vasculogenesis i 3D-mikromiljöer och för att avgöra om dessa celler är lämpliga för ischemisk terapi och kardiovaskulär sjukdom Modellering.
Under det senaste decenniet har olika öppen källkod Computational pipelines och skeletonization algoritmer utvecklats för att kvantifiera och jämföra vaskulär nätverks längd och anslutning. Till exempel, charwat et al. utvecklat en Photoshop-baserad pipeline för att extrahera en filtrerad, binarized bild av vaskulära nätverk som härrör från en co-kultur av adipose-härledda stamceller och utväxt ECs i en fibrin matris13,14. Kanske den mest använda topologin jämförelseverktyg är AngioTool, ett program som publicerats på nätet av National Cancer Institute15; Trots programmets utbredda antagande och väldokumenterade Fidelity, är programmet begränsat till att analysera fartyg-liknande strukturer i två dimensioner och andra program, inklusive AngioSys och Wimasis, dela samma dimensionalitet begränsning16. Kraftfulla mjukvarupaket som Imaris, Lucis och METAMORPH har utvecklats för att analysera nätverkets topologi av konstruerad mikrovaskulatur; Dessa sviter är dock kostnads oöverkomliga för de flesta akademiska labb och begränsar åtkomsten till källkoden, vilket kan hindra slutanvändaren från att anpassa algoritmen till deras specifika program. 3D slicer, en öppen källkod magnetisk resonanstomografi/datortomografi paket, innehåller en vaskulär modellering Toolkit som effektivt kan analysera topologin av 3D vaskulära nätverk17; analysen är dock beroende av användaren manuellt placera slutpunkter i nätverket, vilket kan bli tråkigt när du analyserar en stor datauppsättning och kan påverkas av användarens undermedvetna fördomar. I detta manuskript beskrivs i detalj en beräkningspipeline som kan kvantifiera 3D-vaskulära nätverk. För att övervinna de ovan beskrivna begränsningarna, denna öppen källkod Computational pipeline använder ImageJ till pre-process förvärvade konfokala bilder för att ladda 3D-volym till en skelett analysator. Skeleton Analyzer använder en parallell medial axel gallring algoritm, och utvecklades ursprungligen av Kerschnitzki et al. att analysera längd och konnektivitet av osteocyte nätverk18; denna algoritm kan tillämpas effektivt för att karakterisera längd och konnektivitet av konstruerad mikrovaskulatur.
Sammantaget beskriver detta protokoll skapandet av mikrovaskulära nätverk i 3D-mikromiljöer och ger en öppen källkod och User-bias gratis Computational pipeline för att lätt jämföra vasculogenic potential iPSC-EPs.
Detta protokoll innebär en långsiktig kultur av celler i tre typer av cell odlingsmedier: E8, LaSR basal och EGM-2. Därför bör stor försiktighet iakttas för att på lämpligt sätt sterilisera alla material. Dessutom bör labb rockar och etanol-rengjorda handskar alltid bäras när du arbetar i laboratoriets laminärt flöde huva. Det rekommenderas att ofta testa för Mycoplasma kontamination; om en stor mängd skräp observeras under iPSC kultur eller en plötslig minskning av differentiering effektivitet noteras…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av American Heart Association (Grant nummer 15SDG25740035, tilldelas J.Z.), det nationella institutet för biomedicinsk avbildning och bioteknik (NIBIB) av National Institutes of Health (Grant nummer EB007507, tilldelas CC), och Alliansen för regenerativ rehabilitering forskning & utbildning (AR3T, Grant nummer 1 P2C HD086843-01, tilldelas J.Z.). Vi vill tacka prof. Jeanne Stachowiak (University of Texas i Austin) för hennes tekniska råd om konfokalmikroskopi. Vi är också tacksamma för diskussioner med Samuel Mihelic (University of Texas i Austin), Dr. Alicia Allen (University of Texas i Austin), Dr. Julie Rytlewski (Adaptive Biotech), och Dr Leon Bellan (Vanderbilt University) för sin insikt om beräknings analys av 3D-nätverk. Slutligen tackar vi Dr Xiaoping Bao (University of California, Berkeley) för hans råd om att differentiera iPSCs till iPSC-EPs.
µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | N/A | A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging |
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile | Corning | 7007 | Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish |
Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS |
Advanced DMEM/F12 | Thermo Scientific | 12634010 | The base media for iPSC-EP differentiation. |
Barnstead GenPure xCAD Plus | Thermo Fisher Scientific | 50136165 | Water purification system; others can be readily substituted |
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture | Fisher Scientific | A8412 | To preserve cell viability when FACs sorting |
CD34-PE, human (clone: AC136) | Miltenyi Biotec | 130-098-140 | Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs |
CHIR99021 | LC Laboratories | C-6556 | Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells |
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg | VWR | 354249 | Main component of the 3D microenvironment |
Conical centrifuge tubes (15/50 mL) | Fisher Scientific | 14-959-49D/A | Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | To counterstain and visualize cell nuclei |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-250 | To wash monolayer cultures |
EDTA | Sigma-Aldrich | E8008 | For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting |
Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Promotes endothelial cell viability and proliferation |
Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For maintenance of pluripotent stem cells |
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) | Sigma-Aldrich | 50046 | Neutralizes remaining detergent |
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% | Sigma-Aldrich | A8960 | Component of iPSC-EP differentiation medium |
MATLAB | MathWorks | 1.8.0_152 | Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions) |
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) | Fisher Scientific | 356231 | Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation |
Medium-199 10X | Thermo Fisher Scientific | 1825015 | Used to balance final hydrogel osmolarity and pH |
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | VWR | 87003-294 | Stores small volumes of reagents |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | The main ingredient of the immunostaining solutions |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument |
Recombinant Human VEGF 165 Protein | R&D Systems | 293-VE | Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis |
Rhodamine phalloidin | Themo Fisher Scientific | R415 | To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks |
Triton X-100 (nonionic surfactant) | Sigma-Aldrich | X-100 | Detergent used to gently permeabilize cells |
Tween-20 (emulsifying reagent) | Fisher Scientific | BP337 | Increases the binding specificity of the added antibodies |
VE-Cadherin (F-8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9989 | To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels |
Vitronectin | ThermoFisher | A14700 | For maintenance of pluripotent stem cells |
Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded |