Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Ionbytning kromatografi (IEX) koblet til multi-vinkel lysspredning (MALS) for Protein adskillelse og karakterisering

Published: April 5, 2019 doi: 10.3791/59408
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Alexander Silberman Institute of Life Science, The Hebrew University of Jerusalem, 2Wyatt Technology Corporation, 3Danyel Biotech Ltd

Summary

Denne protokol beskriver brug af høj-specificitet ionbytning kromatografi med multi-vinkel lysspredning til en nøjagtig molar masse bestemmelse af proteiner, proteinkomplekser og peptider i en heterogen prøve. Denne metode er værdifuld for kvalitetsvurdering, såvel som for karakterisering af indfødte oligomerer, charge varianter og blandet protein prøver.

Abstract

Ion-udveksling kromatografi med multi-vinkel lysspredning (IEX-MALS) er en kraftfuld metode til protein adskillelse og karakterisering. Kombinationen af høj-specificitet adskillelse teknik IEX med nøjagtige molar masse analysen opnået ved MALS tillader karakterisering af heterogene protein prøver, herunder blandinger af oligomere former eller protein populationer, selv med meget lignende kindtand masserne. Derfor IEX-MALS giver et ekstra niveau af protein karakterisering og er et supplement til den standard størrelse-udelukkelse kromatografi med multi-vinkel lysspredning (SEC-MALS) teknik.

Her beskriver vi en protokol for en grundlæggende IEX-MALS eksperimentere og demonstrere denne metode på bovint serumalbumin (BSA). IEX adskiller BSA til oligomere former giver en molar masse analyse af MALS af hver enkelt formular. Optimering af et IEX-MALS eksperiment er også præsenteret og demonstreret på BSA, opnå fremragende adskillelse mellem BSA monomerer og større oligomerer. IEX-MALS er en værdifuld teknik for protein kvalitetsvurdering, da det giver både fine adskillelse og molar masse bestemmelse af flere protein arter, der findes i en prøve.

Introduction

Kvantitative karakterisering af proteinprodukter er stadig mere afgørende som et middel til kvalitetskontrol (QC), begge til lovmæssige formål i den biofarmaceutiske industri og til at sikre pålidelighed og integritet af life science forskning1 , 2. som beskrevet på hjemmesiderne for protein net Protein produktion og rensning partnerskab i Europa (P4EU) og foreningen af ressourcer for biofysiske forskning i Europa og molekylær Biofysik i Europa (ARBRE-MOBIEU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs og https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, henholdsvis), protein QC skal karakterisere ikke kun renhed af det færdige produkt, men også sin oligomere tilstand, homogenitet, identitet, kropsbygning, struktur, posttranslationelle modifikationer og andre egenskaber3,4.

En af de mest almindelige QC karakterisering metoder er SEK-MALS. I denne metode, er en analytisk sek kolonne koblet til MALS og spektrofotometriske og Frugtkødets detektorer, gør det muligt for nøjagtige målinger af protein kindtand massen af hver top5. SEC-MALS bestemmer kindtand massen af de eluted tinder uafhængigt af eluering volumen og overvinder unøjagtigheden af analytiske SEC ved hjælp af kolonnen kalibrering. Tilføjelse af en dynamisk lys-spredning (DLS) modul tilføjer størrelse måling kapacitet tillader hydrodynamiske radius bestemmelse. I akademisk forskning, SEC-MALS bruges typisk til at bestemme den oligomere tilstand af et protein, sin kropsbygning, grad af renhed, sammenlægning og modificerede proteiner, såsom glykoproteiner eller lipid-solubilized Membranproteiner (bestemme den Molar masse protein og konjugat komponenterne individuelt)6,7,8.

I mange tilfælde, den endelige protein af en rensningsproces er ikke et godt-lagte molekylære arter men snarere omfatter nogle heterogenitet. Proteinerne i sådan en blanding kan varieres med hensyn til struktur (eksempelvis forskellige oligomere former), konformationer eller protein isoformer. Protein heterogenitet kan også være et resultat af mindre kemiske forskelle forårsaget af C-terminale lysin forarbejdning eller asparagin/glutamin deamination, fører til at opkræve variation9,10. Forskelle i posttranslationelle modifikationer såsom glykosylering kan også føre til heterogene prøver med afgift variationer9. Disse forskellige typer af heterogenitet er afspejlet i det protein biofysiske egenskaber og kan påvirke stabilitet og biologiske aktivitet af target protein11.

Pålidelig kvalitet kontrol-assays af prøverne heterogene kræver et stærkt resolutive analytisk adskillelse teknik. Der er tilfælde hvor god adskillelse kan blive udfordret til at opnå med analytiske sek kolonner, på grund af deres begrænsede opløsning og adskillelse evner12, resulterer i mangelfuld sek-MALS analyse. Ved at kombinere en høj specificitet adskillelse teknik som IEX med MALS kan overvinde begrænsning af SEK-MALS i heterogene prøver og give en supplerende metode til protein karakterisering (tabel 1 i Amartely et al.12). I modsætning til SEC, som adskiller makromolekyler af deres hydrodynamiske størrelse13, adskiller IEX makromolekyler af deres overflade afgift14. Anion exchange (AIEX) og kationbytter (CIEX) matrixer binde opkrævet negativt og positivt varianter, henholdsvis. Med en fin adskillelse mellem protein populationer, der deler en forholdsvis tæt masse eller figur, bestemmer IEX-MALS held kindtand massen af hver enkelt protein stat i en blanding prøve12.

Her præsenterer vi en standardprotokol til at køre en IEX-MALS eksperiment for adskillelse og analyse af BSA oligomere former, der findes i den samme prøve. Valget af en IEX kolonne til et specifikt protein er vigtigt og diskuteres, samt af pH og konduktivitet betingelser af buffere. Analyse af IEX-MALS eksperimentelle data er også beskrevet trin for trin. Selv om adskillelse af BSA oligomerer er gode og tilstrækkelige i SEK-MALS, er BSA et godt eksempel at vise IEX-MALS kapaciteter og vise optimering af et eksperiment. Eksempler på dårlig adskillelse opnåede af SEK-MALS og korrekt adskillelse og aktiveret af IEX-MALS analyse er diskuteret i en tidligere undersøgelse12.

Protocol

1. forberedelse af systemet

  1. Installere hurtig protein væskekromatografi (FPLC) system og MALS/refraktivt indeks (RI) detektorer (Se Tabel af materialer) sammen med deres respektive softwarepakker til kontrol, dataopsamling og analyse pr. fabrikanter' instruktioner.
  2. Tilslut MALS og RI detektorerne nedstrøms for den FPLC UV og ledningsevne detektorer. Omgå pH detektor, medmindre det er absolut nødvendigt for pH forløb, at minimere interdetector volumen mellem UV og MALS detektorer. Bruge kapillær slanger på 0,25-0,5 mm indre diameter (i.d.) mellem kolonnen og detektorer og 0,75 mm i.d. kapillær slanger på output af RI-detektor til affald eller brøkdel opkøber.
  3. Sikre, at de nødvendige signal forbindelser mellem FPLC og detektorer har etableret, herunder en UV analog output fra FPLC detektor til MALS Aux indgang og digital output fra FPLC til den MALS Autoinject i, via boksen i/o.

2. forberedelse af prøven og buffer

  1. Filtrere alle reagenser, herunder vask og eluering buffere, med 0,1 µm filter. Filtrere de første 50 – 100 mL buffer til en affald flaske for at fjerne partikler fra tørre filtre, og holde resten af bufferen i en ren og steril flaske, der er blevet vasket grundigt med filtreret vand og loft for at forhindre støv ind.
  2. Justere en BSA prøven en pH og ioniske styrke (fx pH = 8, 50 mM NaCl) at tillade binding til kolonnen IEX under fortynding, ultrafiltrering eller buffer exchange procedurer.
    Bemærk: Det anbefales at forfiltrere protein prøven til mindste porestørrelse, der ikke fjerner materialet af interesse (0,02 – 0,1 µm). Alternativt, kan prøven centrifugere på høj hastighed (13.000-16.000 x g) i 10 min at aktivere udfældning af store partikler.
  3. Forbered mindst 0,3 – 0,5 mg af BSA (Se Tabel af materialer) at injicere i en 1 mL kolonne (5/50 mm) for at opnå en god kvalitet MALS analyse. Bemærk, at mængden af injektion er ubegrænset.

3. valg og udvikling af en IEX metode til et protein

  1. Beregne det isoelektriske punkt (pI) protein baseret på den primære sekvens, for hvilke servere som Protparam værktøj på ExPASy hjemmeside kan være brugt15. Bemærk, at pI af BSA 5.8.
  2. Vælg i kolonnen type og buffer parametre.
    1. Bruge forskellige buffere til AIEX og CIEX, afhængigt af pKen af bufferen og ioniske arten af bufferen. Bruge kationiske buffere, når du kører AIEX kolonne og anioniske buffere, når du kører kolonnen CIEX med små counterions. I dette eksempel brug 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8, til analyse af BSA på en AIEX kolonne.
    2. For et protein med en pI lavere end 7, såsom BSA, bruge en AIEX kolonne og buffer med pH højere end pI af mindst to enheder. For et protein med en pI højere end 7, skal du bruge en CIEX kolonne og buffer med pH lavere end protein pI af mindst to enheder.
    3. Optimere buffer pH efter styrken af bindingen mellem protein og kolonne matrix. Hvis et protein ikke binder godt til kolonnen, skal du bruge en pH længere fra pI. Sørg for, at proteinet er stabil ved de anvendte pH.
    4. Brug en lav saltkoncentration i bindingen og vaske buffere for at tillade bindende protein til matrixen, da protein binding, afhænger af den ioniske styrke i eksemplet indlæses. Proteiner kræver normalt nogle salt for deres stabilitet; derfor bruge 50 mM NaCl (eller alternative salt) under de protein-loading og kolonne-vask skridt.
    5. For eluering buffer, 0,5 M NaCl maksimalt bruge Adskil protein fra kolonnen.
      Bemærk: Højere salt koncentration anbefales ikke, når du arbejder med standard-model RI refraktometer på grund af range begrænsning af instrumentet. Imidlertid en høj koncentration model kan bruges og vil rumme 2 M NaCl.
  3. Udføre en indledende metode som følger.
    1. Indlæse 1 mg af BSA (170 µL af 6 mg/mL) i ~0.5 mL af en loading bufferen på 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8, indeholdende 50 mM NaCl. Kolonnen udvaskes med den samme buffer for en 10-15 kolonne volumen (CV) at tillade den komplette eluering af ubundne molekyler og partikler fra systemet indtil lysspredning (LS), UV, og RI signaler er fuldt stabiliseret.
    2. Udføre en kort, lineær salt graduering af 20 – 30 CV, ved hjælp af eluering buffer på 20 mM Tris-HCl, pH 8, der indeholder 0,5 M NaCl for at frigøre protein fra kolonnen. Udføre en graduering af 0%-100% (eller alternative udbredt gradient) eluering buffer eller opdele det til to forløb: 0%-50% af eluering buffer efterfulgt af en yderligere forløb af 50%-100% af eluering buffer, hvert farveforløb for 10 – 20 CV. For BSA, bruge en udbredt gradient på 15%-70% for 30 CV for den oprindelige metode.
      Bemærk: I nogle tilfælde er den oprindelige metode kan give adskillelse for en pålidelig MALS analyse, og yderligere løber er ikke nødvendige. I mange tilfælde giver den oprindelige metode kun vejledning for yderligere metode optimering.
  4. Optimere metoden IEX for at øge opløsningen og forbedre peak adskillelse ved at ændre forskellige parametre.
    1. Ændre gradient hældning og længde. Korte forløb med høje skrænter giver intens toppe med mindre separation, mens lange forløb med mild skråninger giver lavere toppe med bedre adskillelse. Finde balancen mellem peak opløsning og signal intensitet for optimal MALS analyse.
      Bemærk: Indlæsning af en højere mængde af protein kan øge LS, UV, og RI signaler gør men det på bekostning af opløsning.
    2. Brug en trinvis saltkoncentration profil for eluering. Husk, at en kombination af trin og lineær gradient er almindeligt anvendt.
    3. Formindske strømningshastigheden for at forbedre peak adskillelse.
      Bemærk: For matrixer med meget små partikler, dette er ikke meget betydelig.
    4. Ændre buffer pH for at øge afgift variation mellem protein populationer i stikprøven og forbedre adskillelse mellem disse varianter. Bemærk at proteiner, der ikke er ordentligt adskilt ved en pH kan adskilles på forskellige pH.
    5. Bruge en pH gradient, lineære eller trinvis, for at løsrive proteiner fra kolonnen IEX. Brug eluering forløb, der kombinerer både pH og saltkoncentration variationer hvis nødvendigt.
    6. Bruge stærkere salte, MgCl2, eller svagere salte, såsom natriumacetat, for at øge følsomheden og opløsning16.
    7. Brug længere IEX kolonner eller en anden kolonne matrix med mindre partikler at forbedre adskillelse evner.
    8. Ændre typen af kolonne (AIEX/CIEX) til at give et andet mønster af adskillelse. Bemærk at matrixer med stærke, svage eller kombinerede (blandet tilstand) ligander er også tilgængelige og kan forbedre løsningen af nogle prøver.
    9. Bruge en kolonne fra en anden leverandør med det samme ligand, der er knyttet til forskellige matrix harpiks. Harpiks selv, uafhængigt af ligand, kan interagere forskelligt med proteiner og påvirke adskillelse profil.
    10. Omfatte tilsætningsstoffer (molekyler, der stabilisere proteinet i løsningen) i buffere at forbedre protein stabilitet og undgå protein sammenlægning, for at forbedre IEX eksperiment.
      Bemærk: Eksempler på sådanne tilsætningsstoffer er sukker, alkoholer, urinstof, nonionisk eller zwitterionic rengøringsmidler, og chaotropic og kosmotropic salte17,18.

4. IEX-MALS eksperiment

  1. Åbne New\Experiment fra metode i MALS-softwaren og vælge online -metoden fra mappen Lys spredning system metoder. Hvis modulet DLS er tilgængelige og DLS data skal erhverves, skal du vælge metoden online fra undermappen Lys Scattering\With QELS .
  2. Angiv parametrene for flugt under afsnittet konfiguration .
    1. Angive gennemstrømningshastighed på flugt i afsnittet Generiske pumpe med strømningshastigheden, bruges i FPLC (1,5 mL/min), og angive eller kontrollere parametrene buffer under afsnittet opløsningsmiddel .
    2. Angiv protein navn (BSA), brydningsindeks tilvækst (dn/dc; standarden værdi for proteiner er 0.185 mL/g), UV extinction koefficient på bølgelængde på 280 nm (0,66 g/L-1·cm-1), og koncentrationen af protein prøve (6 mg/mL) i fanen prøve under afsnittet injektor . Indsæt sample volumen til injektion (170 µL) samt under samme afdeling.
    3. I fanen Grundlæggende samling under afsnittet Procedure Vælg afkrydsningsfeltet aftrækkeren på Autoinject og angive varigheden af flugt, så dataindsamling vil blive videreført i mindst 5 min. efter forløbet har nået sin endelige værdi.
  3. Indstille eksperimentets parametre i FPLC software.
    1. Oprette et nyt eksperiment i fanen Method Editor . De indledende forsøg vil være en lineær gradient af salt eller pH (Se trin 3.3). For den optimerede metode, skabe en mere specifik gradueringsfyld eller en trinvis program i henhold til eluering resultaterne i løbet af den første metode (Se trin 3.4 og figur 1). Omfatte en puls signal i den metode, der udløser dataindsamling i MALS software.
    2. Vaske kolonnen og ventiler med de relevante buffere: 20 mM Tris-HCl, pH 8, med 50 mM NaCl til vask buffer (en ventil) og den samme buffer med 500 mM NaCl til eluering buffer (B ventil). Sørg for, at den sidste kolonne vask bruger binding buffer, som indeholder en lav saltkoncentration, aktivere bindende protein til matrixen kolonne. For en massiv vask af stærkt bundet urenheder, skal du bruge 0,5 M NaOH før vask med de relevante buffere, efterfulgt af en neutralisering buffer vask.
    3. Protein prøven anbringes i loop ved hjælp af en sprøjte. Hvis mere end 10 mL af prøven er indlæst, bruge en superloop eller pumpe-ventil af FPLC instrument mens omgåelse filterpumpe og mixer af FPLC.
  4. Begynde eksperimentet først i MALS software ved at klikke på knappen Kør og derefter i FPLC software. Data vil blive indsamlet efter modtagelsen af puls signalet fra FPLC instrument via MALS detektor.
  5. Anvende de samme parametre for run og instruktionerne beskrevet i trin 4.1-4.4, hvis IEX-MALS udføres manuelt med en kontinuerlig flow tilstand i stedet for en enkeltstående metode.
  6. Når den endelige metode er verificeret og køre, udføre nøjagtigt den samme metode ved hjælp af en tom injektion (loading bufferen i stedet for prøven). Det er vigtigt, at timingen mellem autoinject puls og graduering af den tomme run er identisk med prøven køres.

5. analyse af IEX-MALS eksperimentelle data

  1. Udføre analyse skridt under afsnittet Procedure i MALS software. Visningen Grundlæggende samling viser rå dataindsamling af eksperimentet.
    1. Brug fanen Despiking til at udjævne kromatogrammer, hvis de udviser en masse støj. Normalt, bruge det normale niveau.
    2. Definere baseline for alle signaler (alle LS, UV og RI detektorer) i den oprindelige visning.
    3. Definere toppe for analyse i visningen toppe . Kontroller de korrekte værdier af dn/dc og UV extinction koefficient for protein under hver top.
      Bemærk: For proteiner, er det almindeligt at bruge en standard RI intervalværdi af 0.185 mL/g, men for andre makromolekyler, forskellige dn/dc værdier bør anvendes efter arten af molekylet. Den gennemsnitlige dn/dc af polynucleotides (DNA/RNA) er 0,17 mL/g19, mens saccharider, som saccharose, har en gennemsnitlig dn/dc værdi af 0.145 mL/g20 og dn/dc værdierne af lipider og rengøringsmidler interval mellem 0,1 – 0,16 mL/g21.
    4. Analysere den molar masse og radius ved hjælp af passende parametre og korrelationsfunktionen under visningerne Molar masse & Radius fra LS og RasmussenHansen fra QELS .
  2. RI signal ændringer betydeligt under IEX-MALS køre på grund af stigningen i saltkoncentration. Derfor, subtrahere baseline signalet fra den tomme injektion for masse beregninger, der kræver RI data.
    1. Åbne både protein og Tom IEX-MALS eksperimenter. Højreklik på navnet protein eksperiment, Vælg Anvende metode, og Vælg mappen Baseline subtraktion fra fil dialogen. Vælg den korrekte metode (f.eks. online) for standard molar masse analyse. Bemærk, at parametre og indstillinger, der defineres for protein eksperiment vil blive gemt på den nye åbnede metode.
    2. Klik på Importere Tom for at importere signaler af den tomme Kør under visningen Baseline subtraktion . Kontrollere alle detektorer skal trækkes under instrumenter (ved siden af knappen Importer tomt ).
    3. I visningen toppe justere dn/dc værdier (om nødvendigt) på grund af ledningsevne af løsningen på topareal protein da RI af løsningen er ændret under den køre12.
  3. Kalibrere IEX-MALS system med BSA monomer.
    Bemærk: Normalt, IEX-MALS system er regelmæssigt kalibreret for peak justering, band udvidelse og normalisering af de kantede detektorer til 90° detektoren ved hjælp af en monodisperse protein med en radius på gyration (Rg) af < 10 nm, såsom BSA monomer. I dette eksempel, BSA serverer både som kalibrering molekyle og selv er genstand for den kindtand masse analyse.
    1. Juster toppe, under procedurer > konfiguration visning.
    2. Udføre normalisering under den normalisering visning, indtastning 3,0 nm som Rg værdi.
    3. Under Band udvidelse i den samme konfiguration tab, vælge peak og passer med UV og LS signalerne til RI-signal, ved hjælp af knappen Udfør passer .
  4. Grafen for resultaterne er vist i visningen Resultater montering . Ændre akse skalaer og andre parametre, grafen ved at højreklikke på grafen, vælge Redigerog derefter klikke på knappen Avanceret . En graf figur med flere visningsindstillinger er også tilgængelige under fanen EASI graf : Vælg Molar masse vise drop-down menuen øverst i vinduet.
  5. Bemærk at alle resultater, herunder molar masse, radius, grad af renhed og andre, er tilgængelige i rapportvisning (summarisk eller detaljerede) under afsnittet resultater . Brug knappen Report Designer til at tilføje flere resultater eller parametre, samt tal, til rapporten.

Representative Results

BSA er en fælles protein, som er brugt i kromatografi for kalibrering af eksperimentel system22 og er særdeles velegnet til praktiserende IEX-MALS samt sek-MALS. Det er primært monomere med en teoretisk monomer masse 66,7 kDa og normalt indeholder et lille antal dimere og højere oligomerer23.

BSA blev analyseret på IEX-MALS ved hjælp af en anion exchange analytiske kolonne (Se Tabel af materialer). En bred lineær gradient, bestående af 30 CV fra 75 mM til 350 mM NaCl adskilt BSA monomerer fra de højere oligomerer. Downstream MALS analyse resulterede i en beregnede monomer molar masse 66,8 ± 0,7 kDa og en beregnede dimer molar masse 130 ± 5 kDa (fig. 1A).

Baseret på buffer ledningsevne på de eluted toppe, gradient blev ændret til et andet program: et langt skridt på 175 mM NaCl efterfulgt af en lineær gradient fra 175 mM til 500 mM NaCl. Det nye forløb i høj grad forbedret opløsning og fremragende adskillelse mellem BSA monomer (med en beregnede molar masse på 66,1 ± 0,7 kDa) og dens højere oligomere arter (med en beregnede gennemsnitlige masse af 132 ± 2 kDa) (figur 1B). Fokuserer også på den høje oligomere arter, og beregne kindtand masserne af hver individuel oligomere form for BSA blev en trinvis program af 200 mM og 250 mM NaCl anvendt. Dette eksperiment resulterede i en fremragende adskillelse mellem BSA monomer (med en beregnede masse 62.4 ± 0,4 kDa), dimer (med en beregnede masse 130 ± 10 kDa) og trimer (med en beregnede masse 170 ± 10 kDa) (figur 1C). Alle IEX-MALS eksperimenter viser, at BSA eluerer for det meste som en monomer med en renhed på 80%, efter aftale med SEC-MALS resultater hvor BSA monomerer elueres med en renhedsgrad på 85%12.

Figure 1
Figur 1 : Optimering af IEX-MALS eksperiment for BSA. (A) IEX-MALS eksperimentere med BSA med en gradient program på 75 – 350 mM NaCl. (B) IEX-MALS eksperimentere med BSA med et program for en 175 mM NaCl skridt efterfulgt af en lineær gradient program på 175-500 mM NaCl. (C) IEX-MALS eksperimentere med BSA med et trin program af 200 mM og 250 mM NaCl. Kromatogrammer vise UV på 280 nm (blå), lys spredning på en 90° vinkel (rød), og brydningsindeks (pink) og ledningsevne (grå) kurver sammen med den molære massen af hver top beregnet ved MALS (sort). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

IEX-MALS er en kraftfuld metode til protein adskillelse og karakterisering, der giver mulighed for nøjagtig molar masse bestemmelse af rene proteiner samt fra heterogene prøver, kendetegner indfødte oligomerer, nonnative aggregater, kovalent og noncovalent komplekser, og conjugated proteiner. Et program bestående af en lineær gradient eller en serie af saltkoncentration trin kan opnå en god adskillelse mellem protein befolkninger og tillade korrekt analyse af hver enkelt top af MALS. Yderligere optimering ved at variere forskellige parametre, såsom gradient hældning (Se trin 3.4 i protokollen), kan udføres, hvis en bedre løsning er påkrævet. IEX-MALS kan være et værdifuldt protein kvalitetskontrol assay, da det giver en ekstra, kritisk niveau af protein karakterisering, supplement til andre metoder såsom sek-MALS.

Mens SEC-MALS er en standard og fælles teknik til protein molar masse beslutsomhed, kan den relativt lav opløsning af de standard analytiske sek kolonner begrænse nøjagtige molar masse målinger opnåede af MALS12. Nogle eksempler på begrænsningerne af SEK-MALS løsninger, der indeholder træk oligomerer, høje niveauer af sammenlægning, der ikke er fuldt adskilt fra monomer peak og heterogene befolkninger med lignende kindtand masserne, såsom modificerede proteiner.

IEX er en mere kompleks kromatografi metode til at designe og gennemføre end sek, men oplysningerne fra et IEX-MALS eksperiment kan supplere og undertiden blive endnu mere informative end sek-MALS analyse. IEX-MALS har med held karakteriseret antistof varianter, der deler de samme molar masse, oligomerer, der ikke er helt adskilt på SEK og korte peptider, som er vanskelige at analysere af SEC12,24. Makromolekylære assemblies, der er for store til at være adskilt af SEC, som fuld (indeholdende viral DNA) og Tom partikler af adeno-associeret virus (AAV), kan også løses ved IEX25 inden MALS analyse. Sammenlignet med sek, IEX tilbyder flere forskellige adskillelse kapaciteter14 , og det har fleksibiliteten tilpasse flere parametre for at øge peak opløsning, som buffer pH, typer af salt, typer og længde af kolonnen, og andre. I modsætning til sek, er der ingen begrænsning af lydstyrke for prøven injektion i IEX, og ethvert molekyle kan analyseres uafhængigt af dets størrelse (se tabel 1 i Amartely et al.12). Dette er en stor fordel ved IEX-MALS, hovedsagelig for prøver med et lavt LS intensitet, som meget lille proteiner eller fortyndet proteiner med en tendens til sammenlægning efter fusionen. Da analytiske IEX kolonner er mere stabile og har tendens til at frigive færre partikler end sek kolonner, IEX-MALS kræver meget korte ekvilibreringstid og LS signaler er stabiliseret meget hurtigt. Dette giver mulighed for kørsel af individuelle eksperimenter som beskrevet i denne protokol og standsning af Kør som påkrævet.

I modsætning til SEC, som normalt giver fine resultater med kun et enkelt eksperiment (ved hjælp af en kolonne med det rigtige fraktionering udvalg), IEX kan kræve flere eksperimenter for at opnå optimal opløsning af tuning parametrene til. I IEX-MALS eksperimenter, der udføres med en salt gradient, buffer ledningsevne, og dermed RI ændre dramatisk i tiden, med deraf følgende ændringer til RI-signal. Dette kræver en ekstra blank køres for hver IEX-MALS eksperiment og en analyse med baseline subtraktion (som beskrevet i trin 5.2 i protokollen) medmindre koncentrationen analysen er begrænset til UV detektion (kræver et forudgående kendskab til udryddelsen koefficienter for hver top). Analyse med baseline subtraktion er robust for lineære farveforløb, selvom der stadig kræves for succesfuld baseline subtraktion af salt trinvis programmer yderligere udvikling af metoden. Dn/dc værdier af hver top bør tilpasses de specifikke buffer ledningsevne på eluted peak (beregninger kan findes i litteraturen12). Hvis et protein elueres ved en NaCl koncentration lavere end 200 mM (som i eksemplet med BSA), denne justering er ubetydelig.

Den relativt store mængde af protein anvendes i IEX-MALS (som beskrevet i trin 2.3 i protokollen) i forhold til sek-MALS er vigtigt at overvinde den dramatiske ændring af RI signalet forårsaget af salt gradient og RI udsving på grund af mangelfuld opblanding af den gradient buffere. Hvis der kun UV detektion anvendes til måling af masse, kan mindre mængder anvendes. Mængden af protein til at injicere afhænger molar masse protein, homogenitet, renhed og UV extinction koefficient. Den nødvendige injicerede masse bør være højere for mindre proteiner og lavere for større proteiner (~ 1 mg for en 20 kDa protein og ~0.2 mg for en 150 kDa protein). Heterogene prøver kræver indsprøjtning af flere prøve da mængden, der er delt mellem flere befolkningsgrupper. Analytiske højtydende væskekromatografi (HPLC) kan kræve mindre materiale end et FPLC system.

For nylig, i-line analyse ved hjælp af MALS under rensning procedurer er blevet rapporteret. Sådan en real-time analyse er meget effektiv til påvisning af sammenlægning produkter, som opstår under rensningen og kan fjerne behovet for nogen yderligere analyse af protein efter rensning26. IEX chromatografi bruges ofte som et mellemliggende rensning skridt; således er kan kombinationen af forberedende IEX kolonner med MALS være nyttigt ikke kun som en analytisk karakterisering metode men også som en real-time analyse af omfattende rensning procedurer. Nonanalytical IEX kolonner er også stabil, med en lav grad af partikel bremsen, og derfor kan bruges med MALS. Andre adskillelse teknikker, såsom affinitet kromatografi eller hydrofobe exchange kromatografi, kan også kombineres med MALS når de udsættes for relativt ren prøver (for at undgå kontaminering af MALS og RI-detektorer). Dette forudsætter tilpasning og optimering af metoden til at opnå ikke blot god peak adskillelse, men også tilstrækkeligt rene LS og RI signaler for en vellykket MALS analyse.

Disclosures

DS er ansat af Wyatt Technology Corporation, hvis produkter er udnyttet i denne protokol. A.T. er ansat af Madss Biotech, en distributør af Wyatt og ÄKTA instrumenter.

Acknowledgments

Forfatterne takke Dr. Tsafi Danieli (Wolfson Center for anvendt strukturbiologi, Hebrew University) for hendes råd og samarbejder. Forfatterne også takke Madss Biotech Ltd (Rehovot, Israel) for bistand og etablering af analysesystemet FPLC-MALS udnyttes i denne undersøgelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ÄKTA pure GE Healthcare 29-0182-26 FPLC 
0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm GE Healthcare 6809-1002 Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm GE Healthcare 6809-1012 Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm GE Healthcare 6809-2012 Mobile phase filter
BSA (purity >97%) Sigma  A1900 Bovine serum albumin
miniDAWN TREOS  Wyatt Technology WTREOS MALS
mono Q HR 5/50 GL GE Healthcare 17-5166-01 Anion exchange analytical column
Optilab T-rEX Wyatt Technology WTREX Refractometer
0.1 mm PES 1000 mL Stericup Millipore SCVPU11RE Mobile phase filter
Sodium chloride Sigma  71382 HPLC grade NaCl
TRISMA base Sigma  T-1503 TRIS buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lebendiker, M., Danieli, T., de Marco, A. The Trip Adviser guide to the protein science world: a proposal to improve the awareness concerning the quality of recombinant proteins. BMC Research Notes. 7, 585 (2014).
  2. Raynal, B., Lenormand, P., Baron, B., Hoos, S., England, P. Quality assessment and optimization of purified protein samples: why and how. Microbial Cell Factories. 13, 180 (2014).
  3. Oliveira, C., Domingues, L. Guidelines to reach high-quality purified recombinant proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (1), 81-92 (2018).
  4. Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
  5. Minton, A. P. Recent applications of light scattering measurement in the biological and biopharmaceutical sciences. Analytical Biochemistry. 501, 4-22 (2016).
  6. Sahin, E., Roberts, C. J. Size-Exclusion Chromatography with Multi-angle Light Scattering for Elucidating Protein Aggregation Mechanisms. Methods in Molecular Biology. 899, 403-423 (2012).
  7. Ogawa, T., Hirokawa, N. Multiple analyses of protein dynamics in solution. Biophysical Reviews. 10 (2), 299-306 (2018).
  8. Rebolj, K., Pahovnik, D., Žagar, E. Characterization of a Protein Conjugate Using an Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation and a Size-Exclusion Chromatography with Multi-Detection System. Analytical Chemistry. 84 (17), 7374-7383 (2012).
  9. Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. Heterogeneity of Monoclonal Antibodies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (7), 2426-2447 (2008).
  10. Hintersteiner, B., et al. Charge heterogeneity: Basic antibody charge variants with increased binding to Fc receptors. mAbs. 8 (8), 1548-1560 (2016).
  11. Wei, B., Berning, K., Quan, C., Zhang, Y. T. Glycation of antibodies: Modification, methods and potential effects on biological functions. mAbs. 9 (4), 586-594 (2017).
  12. Amartely, H., Avraham, O., Friedler, A., Livnah, O., Lebendiker, M. Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization. Scientific Reports. 8 (1), 6907 (2018).
  13. Goyon, A., et al. Evaluation of size exclusion chromatography columns packed with sub-3μm particles for the analysis of biopharmaceutical proteins. Journal of Chromatography A. 1498, 80-89 (2016).
  14. Fekete, S., Beck, A., Veuthey, J. -L., Guillarme, D. Ion-exchange chromatography for the characterization of biopharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 43-55 (2015).
  15. Gasteiger, E., et al. ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  16. Kopaciewicz, W., Regnier, F. E. Mobile phase selection for the high-performance ion-exchange chromatography of proteins. Analytical Biochemistry. 133 (1), 251-259 (1983).
  17. Lebendiker, M., Danieli, T. Production of prone-to-aggregate proteins. FEBS Letters. 588 (2), 236-246 (2014).
  18. Lebendiker, M., Maes, M., Friedler, A. A screening methodology for purifying proteins with aggregation problems. Methods in Molecular Biology. 1258, 261-281 (2015).
  19. Fu, D., et al. Ultraviolet refractometry using field-based light scattering spectroscopy. Optics Express. 17 (21), 18878-18886 (2009).
  20. Scafati, A. R., Stornaiuolo, M. R., Novaro, P. Physicochemical and Light Scattering Studies on Ribosome Particles. Biophysical Journal. 11 (4), 370-384 (1971).
  21. Berthaud, A., Manzi, J., Pérez, J., Mangenot, S. Modeling Detergent Organization around Aquaporin-0 Using Small-Angle X-ray Scattering. Journal of the American Chemical Society. 134 (24), 10080-10088 (2012).
  22. Umrethia, M., Kett, V. L., Andrews, G. P., Malcolm, R. K., Woolfson, A. D. Selection of an analytical method for evaluating bovine serum albumin concentrations in pharmaceutical polymeric formulations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 51 (5), 1175-1179 (2010).
  23. Hirano, A., Arakawa, T., Kameda, T. Effects of arginine on multimodal anion exchange chromatography. Protein Expression and Purification. 116, 105-112 (2015).
  24. Avraham, O., Bayer, E. A., Livnah, O. Crystal structure of afifavidin reveals common features of molecular assemblage in the bacterial dimeric avidins. The FEBS Journal. , (2018).
  25. Lock, M., Alvira, M. R., Wilson, J. M. Analysis of Particle Content of Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 8 Vectors by Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 56-64 (2012).
  26. Patel, B. A., et al. Multi-angle light scattering as a process analytical technology measuring real-time molecular weight for downstream process control. mAbs. 10 (7), 945-950 (2018).

Tags

Biokemi spørgsmålet 146 ionbytning (IEX) multi-vinkel lysspredning (MALS) kromatografi protein adskillelse molekylvægt bovint serumalbumin (BSA) oligomerer kvalitetskontrol
Ionbytning kromatografi (IEX) koblet til multi-vinkel lysspredning (MALS) for Protein adskillelse og karakterisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Amartely, H., Some, D., Tsadok, A.,… More

Amartely, H., Some, D., Tsadok, A., Lebendiker, M. Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization. J. Vis. Exp. (146), e59408, doi:10.3791/59408 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter