Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Ionebytte kromatografi (IEX) koblet til multi-Angle lysspredning (MALS) for proteiner og karakterisering

Published: April 5, 2019 doi: 10.3791/59408
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Alexander Silberman Institute of Life Science, The Hebrew University of Jerusalem, 2Wyatt Technology Corporation, 3Danyel Biotech Ltd

Summary

Denne protokollen beskriver bruk av høy-spesifisitet ion-exchange kromatografi med multi-Angle lysspredning for en nøyaktig molar masse bestemmelse av proteiner, protein komplekser og peptider i en heterogen prøve. Denne metoden er nyttig for kvalitetsvurdering, så vel som for karakterisering av innfødte oligomers, gratis varianter og blandet-protein prøver.

Abstract

Ion-exchange kromatografi med multi-Angle lysspredning (IEX-MALS) er en kraftig metode for proteiner og karakteristikk. Kombinasjonen av høy-spesifisitet separasjon teknikken IEX med nøyaktig molar masse analyse av MALS lar karakterisering av heterogene protein blodprøver, inkludert blandinger av oligomeric skjemaer eller protein befolkninger, selv med svært lignende molar massene. Derfor IEX-MALS gir et ekstra nivå av protein karakterisering og er utfyllende til den standard størrelse-utestenging kromatografi med multi-Angle lysspredning (SEC-MALS) teknikk.

Her beskriver vi en protokoll for en grunnleggende IEX-MALS eksperimentere og demonstrerer denne metoden på storfe serum albumin (BSA). IEX skiller BSA oligomeric former slik at en molar masse analyse av MALS av hvert enkelt skjema. Optimalisering av et IEX-MALS eksperiment er også presentert og vist på BSA, oppnå gode skille mellom BSA monomerer og større oligomers. IEX-MALS er en verdifull teknikk for protein kvalitetsvurdering siden det gir både fine separasjon og molar masse fastsettelse av flere protein som finnes i et utvalg.

Introduction

Kvantitativ karakteristikk av protein produkter er stadig mer avgjørende for kvalitetskontroll (QC), både for reguleringer i biofarmasøytisk industri og garantere pålitelighet og integritet av livet vitenskap forskning1 , 2. som beskrevet på hjemmesidene til protein nettverk Protein produksjon og rensing samarbeid i Europa (P4EU) og foreningen av ressurser for Biofysiske forskning i Europa og molekylære biofysikk i Europa (ARBRE-MOBIEU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs og https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, henholdsvis), protein QC må karakterisere ikke bare renheten av det endelige produktet, men også sin oligomeric tilstand, homogenitet, identitet, konformasjon, struktur, posttranslational modifikasjoner og andre egenskaper3,4.

En av de vanligste QC karakterisering metodene er sek-MALS. I denne metoden er en analytisk SEC kolonne kombinert MALS og Spektrofotometri og refractometric detektorer, slik at presise målinger av protein molar massen hver topp5. SEC-MALS bestemmer molar masse eluted toppene lydstyrken elueringsrør, og overvinner unøyaktighet i analytisk SEC bruke kolonnen kalibrering. Tillegg av en dynamisk lys-spredning (DLS) modul legger størrelse måling evne slik at etter radius besluttsomhet. I akademisk forskning, SEC-MALS brukes vanligvis til å fastslå oligomeric tilstanden til et protein, sin konformasjon, nivået av renhet, aggregering, og endret proteiner, som glykoproteiner eller lipid-solubilized membran proteiner (fastsette den molar masse protein og bøy komponentene individuelt)6,7,8.

I mange tilfeller det siste proteinet av en renselsesprosess er ikke en godt definert molekylær arter men heller består av noen heterogenitet. Proteinene i slike en blanding kan varieres i struktur (for eksempel ulike oligomeric former), konformasjonen eller protein isoformene. Protein heterogenitet kan også være et resultat av mindre kjemisk forskjeller forårsaket av C-terminalen lysin behandling eller asparagine/glutamin deamination, fører til belaste variant9,10. Forskjeller i posttranslational modifikasjoner som glykosylering kan også føre til heterogene prøver med gratis variasjoner9. Disse typer heterogenitet gjenspeiles i protein's Biofysiske egenskaper og kan påvirke stabiliteten og biologisk aktivitet målet protein11.

Pålitelig kvalitetskontroll analyser av slike heterogene prøver krever en svært resolutive analytisk separasjon teknikk. Det er tilfeller hvor god separasjon kan utfordres til å oppnå med analytiske SEC kolonner, på grunn av sin begrensede oppløsning og separasjon evner12, som resulterer i feil SEC-MALS analyse. Kombinerer en høy spesifisitet separasjon teknikk som IEX med MALS kan overvinne begrensning av SEC-MALS i heterogene prøver og komplementære metode for protein karakterisering (tabell 1 i Amartely et al.12). I motsetning til SEC, som skiller makromolekyler av deres etter størrelse13, skiller IEX makromolekyler av deres overflate kostnad14. Anion exchange (AIEX) og cation exchange (CIEX) matriser bind ladet negativt og positivt varianter, henholdsvis. Med et fint skille mellom protein populasjoner som deler en relativt tett masse eller figur, fastsettes IEX-MALS molar masse hver individuelle protein stat i en blanding eksempel12.

Her presenterer vi en standardprotokoll for å kjøre et IEX-MALS eksperiment for separasjon og analyse av BSA oligomeric former som finnes i samme utvalget. Valget av en IEX-kolonne for et bestemt protein er viktig og diskutert, samt de pH og ledningsevne forholdene i buffrene. Analyse av IEX-MALS eksperimentelle data er også beskrevet trinn for trinn. Selv om separasjon av BSA oligomers er gode og tilstrekkelig i SEC-MALS, er BSA et godt eksempel viser IEX-MALS mulighetene og demonstrere optimalisering av et eksperiment. Eksempler på dårlig separasjon av SEC-MALS og riktig separasjon og analyse aktivert av IEX-MALS er omtalt i en tidligere studie12.

Protocol

1. forberedelse av systemet

  1. Installere rask protein flytende kromatografi (FPLC) systemet og MALS/refraktiv indeks (RI) detektorer (se Tabell for materiale) med sine respektive programvarepakker for kontroll, datainnsamling og analysering. per produsentens instruksjoner.
  2. Koble de MALS og RI detektorer nedstrøms av den FPLC UV og ledningsevne detektorer. Omgå pH detektoren med mindre det er absolutt nødvendig for pH graderinger, minimere interdetector volumet mellom de UV og MALS detektorer. Bruke kapillær rør på 0,25-0,5 mm indre diameter (ID) mellom kolonnen og detektorer og 0,75 mm ID kapillær rør på produksjon av RI detektoren til samleren avfall eller brøkdel.
  3. Kontroller at nødvendig signal tilkoblinger mellom FPLC og detektorer er etablert, inkludert en UV analog utgang fra FPLC detektoren til MALS Aux-inngang og digital utgang fra FPLC MALS Autoinject in, via boksen I/O.

2. forberedelse av prøven og buffer

  1. Filtrere reagenser, inkludert vask og elueringsrør bufferne, med filtere 0,1 µm. Filtrere de første 50-100 mL bufferen i en avfall flasken for å fjerne partikler av tørr filtrene og holde resten av bufferen i en ren, sterile flaske som har blitt vasket grundig med filtrert vann og avkortet for å hindre støv fra å komme inn.
  2. Justere et BSA eksempel pH og ioniske styrke (f.eks pH = 8, 50 mM NaCl) som tillater binding til kolonnen IEX under fortynning, ultrafiltrasjon eller bufferen utveksling prosedyrer.
    Merk: Det anbefales å forhåndsfiltrere protein prøven til laveste porestørrelse som ikke fjerner materialet rundt (0,02-0,1 µm). Alternativt kan prøven være sentrifugeres i høy hastighet (13.000-16.000 x g) i 10 min å aktivere nedbør av store partikler.
  3. Forbered minst 0,3 – 0,5 mg av BSA (se Tabell for materiale) å injisere i en 1 mL kolonne (5/50 mm) for å oppnå en god kvalitet MALS analyse. Merk at volumet av injeksjon er ubegrenset.

3. valg og utvikling av en IEX metode for et protein

  1. Beregne isoelectric punktet (pI) av proteinet basert på den primære sekvensen, hvilke servere som Protparam verktøyet på ExPASy nettside kan være brukt15. Merk at pI av BSA 5,8.
  2. Velg kolonnen type og buffer parameterne.
    1. Bruk ulike buffere for AIEX og CIEX, avhengig av den pKen bufferstørrelsen og ioniske innholdet i bufferen. Bruke kationisk buffere AIEX kolonnen, og anionic buffere når kolonnen CIEX med små counterions. I dette eksemplet bruk 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8 for analyse av BSA på en AIEX kolonne.
    2. For et protein med en pI lavere enn 7, som BSA, kan du bruke en AIEX kolonne og buffer med pH høyere enn pI med minst to enheter. For et protein med en pI høyere enn 7, kan du bruke en CIEX kolonne og buffer med pH lavere enn protein pI med minst to enheter.
    3. Optimaliser buffer pH ifølge styrken av binding mellom protein og kolonnen matrix. Hvis et protein som ikke binder seg godt til kolonnen, kan du bruke en pH lenger fra pI. Kontroller at protein er stabilt på brukte pH.
    4. Bruk en lav salt konsentrasjon i bindingen og vask bufferne for å tillate binding av protein til matrisen, siden protein bindende avhenger av ionisk styrke lastet prøven. Proteiner krever vanligvis litt salt for deres stabilitet; derfor bruke 50 mM NaCl (eller alternativ salt) under protein-lasting og kolonne-vask trinnene.
    5. For elueringsbufferen, bruk maksimum 0,5 M NaCl koble protein fra kolonnen.
      Merk: Høyere saltkonsentrasjoner anbefales ikke når du arbeider med standard-modellen RI refractometer på grunn av rekkevidde begrensning av instrumentet. Men en høy-konsentrasjon modell kan brukes og vil innkvartere 2 M NaCl.
  3. Utfør en innledende metode som følger.
    1. Laste 1 mg av BSA (170 µL av 6 mg/mL) i ~0.5 mL lasting bufferen 20 mM Tris-HCl bufferen, pH 8, inneholder 50 mM NaCl. Vask kolonnen med samme bufferen for en 10-15 kolonnen volum (CV) å tillate komplett tilsettes ubundet molekyler og partikler fra systemet til lysspredning (LS), UV, og RI signaler er full stabilisering.
    2. Utføre en kort, lineær salt gradient 20-30 CV, bruker elueringsbufferen 20 mm Tris-HCl, pH 8, som inneholder 0,5 M NaCl å koble protein fra kolonnen. Utføre en gradient 0%-100% (eller alternativ utbredt gradering) av elueringsbufferen eller dele den to gradienter: 0%-50% av elueringsbufferen etterfulgt av en ekstra gradering av 50%-100% av elueringsbufferen, hver forløpning for 10-20 CV. Bruke en utbredt gradient på 15%-70% for 30 BSA, CV for første metoden.
      Merk: I noen tilfeller den første metoden kan gi separasjon for en pålitelig MALS analyse, og flere kjører er ikke nødvendig. I mange tilfeller gir den første metoden bare veiledning for ytterligere metoden optimalisering.
  4. Optimalisere metoden IEX for å øke oppløsningen og forbedre peak separasjon ved å endre ulike parametere.
    1. Endre gradient skråningen og lengde. Kort forløpninger med høye skråninger gir intens topper med mindre separasjon, mens lang forløpninger med mild bakker gi lavere topper med bedre separasjon. Finne balansen mellom høyeste oppløsning og signal intensitet for optimal MALS analyse.
      Merk: Lasting et høyere antall protein kan øke LS, UV, og RI signaler gjør men det på bekostning av oppløsning.
    2. Bruk en trinnvis saltkonsentrasjon profilen for tilsettes. Husk at en kombinasjon av trinnene og lineær gradient er vanlig.
    3. Redusere infusjonshastigheten for å forbedre peak separasjon.
      Merk: For matriser med svært små partikler, dette er ikke viktig.
    4. Endre buffer pH for å øke kostnad variasjonen mellom protein befolkningen i utvalget og forbedre avstanden mellom disse variantene. Merk at proteiner som ikke er riktig atskilt ved en pH kan skilles ved en annen pH.
    5. Bruke en pH gradering, lineær eller gradvis, koble proteiner fra kolonnen IEX. Bruk elueringsrør forløpninger som kombinerer både pH og saltkonsentrasjon variasjoner om nødvendig.
    6. Bruk sterkere salter, for eksempel MgCl2eller svakere salter slik som natrium acetate, for å øke følsomhet og oppløsning16.
    7. Bruk lengre IEX kolonner eller en annen kolonne matrise med mindre partikler å forbedre separasjon evner.
    8. Endre typen kolonne (AIEX/CIEX) for å gi et annet mønster av separasjon. Merk at matriser med sterk, svak eller kombinert (blandet modus) ligander er også tilgjengelig og kan forbedre oppløsningen på eksempler.
    9. Bruke en kolonne fra en annen leverandør med samme ligand som er knyttet til ulike matrix harpiks. Harpiksen, uavhengig av ligand, kan samhandle annerledes med proteiner og påvirker separasjon profilen.
    10. Inkluder tilsetningsstoffer (molekyler som stabiliserer protein i løsningen) i bufferne forbedre protein stabilitet og unngå protein aggregering, for å forbedre IEX eksperimentet.
      Merk: Eksempler på slike tilsetningsstoffer er sukker, alkoholer, urea, ikke-ionisert eller zwitterionic vaskemidler, og chaotropic og kosmotropic salter17,18.

4. IEX-MALS eksperiment

  1. Åpne New\Experiment fra metoden i MALS programvare og Velg metoden online fra mappen Lys spredning system metoder. Hvis modulen DLS er tilgjengelig og DLS data er ervervet, Velg metoden online fra undermappen Lys Scattering\With QELS .
  2. Angi parameterne for kjøre under konfigurasjon .
    1. Angi inntakets kjøre i inndelingen Generelle pumpe til infusjonshastigheten i FPLC (1,5 mL/min), og angi eller kontrollere parameterne buffer under delen løsemiddel .
    2. Angi protein (BSA), brytningsindeks økning (dn/dc, standard verdien for proteiner er 0.185 mL/g), UV utryddelse koeffisient på bølgelengden til 280 nm (0,66 finans-1·cm-1), og konsentrasjonen av protein prøven (6 mg/mL) i kategorien Sample under delen injektor . Sett inn prøven volumet for injeksjon (170 µL) samt under samme inndeling.
    3. I kategorien Grunnleggende samling prosedyren i delen avkrysningsruten utløseren på Autoinject og sette hele kjøre slik at datainnsamling skal videreføres i minst 5 min etter graderingen har nådd sin sluttverdien.
  3. Angi parameterne eksperiment i programmet FPLC.
    1. Opprett et nytt eksperiment i kategorien Method Editor . Første eksperimentet vil være en lineær gradient salt eller pH (se trinn 3.3). For metoden optimalisert opprette mer bestemt gradering eller et gradvis program ifølge elueringsrør resultatene under den første metoden (se trinn 3.4 og figur 1). Inkluder en puls signal i metoden som vil utløse datainnsamling i MALS programvaren.
    2. Vask kolonne og ventiler med relevante bufferne: 20 mM Tris-HCl, pH 8, med 50 mM NaCl for vaske bufferen (en ventil) og samme buffer med 500 mM NaCl for elueringsbufferen (B valve). Kontroller at den siste kolonnen vasken bruker bindingen buffer, som inneholder en lav salt konsentrasjon, aktivere binding av protein til kolonnen matrix. En massiv vask av sterkt bundet urenheter, bruke 0,5 M NaOH før vask med de relevante bufferne, etterfulgt av en nøytralisering buffer vask.
    3. Plass protein prøven i løkken bruker en sprøyte. Hvis mer enn 10 mL av prøven er lastet, bruk en superloop eller pumpe-ventilen FPLC instrument mens omgåelsen filter pumpe og blandebatteri til FPLC.
  4. Start eksperimentet først i MALS programvaren ved å klikke på knappen Kjør , og deretter i FPLC programvaren. Dataene samles etter mottar puls signalet fra FPLC apparatet via MALS detektoren.
  5. Bruke samme parametre for kjøre og instruksjonene som er beskrevet i trinnene 4.1-4,4 Hvis IEX-MALS utføres manuelt med en kontinuerlig strøm-modus i stedet for en frittstående metode.
  6. Når den siste metoden er bekreftet og kjøre, utføre akkurat samme måte ved hjelp av en tom injeksjon (lasting buffer i stedet for prøven). Det er viktig at timingen mellom byens autoinject og graderingen av Tom kjøringen er identisk med prøven kjøre.

5. analyse av IEX-MALS eksperimentelle data

  1. Utføre analyse trinnvis prosedyre delen i MALS programvaren. Grunnleggende samlinger -visningen viser den rådata samlingen av eksperimentet.
    1. Bruk kategorien Despiking til å jevne chromatograms hvis de viser mye støy. Normalt bruk normale .
    2. Definere grunnlinjen for alle signaler (alle LS, UV og RI detektorer) i den opprinnelige visningen.
    3. Definere toppene for analyse i visningen topper . Kontroller de riktige verdiene av dn/dc og UV utryddelse koeffisient for protein under hver topp.
      Merk: For proteiner, er det vanlig å bruke en standard RI økningsverdien for 0.185 mL/g, men for andre makromolekyler, ulike dn/dc verdier skal brukes, i henhold til innholdet i molekylet. Den gjennomsnittlige dn/dc polynucleotides (DNA/RNA) er 0,17 mL/g19, mens saccharides, for eksempel sukrose, har en gjennomsnittlig dn/dc verdi 0.145 mL/g-20 og dn/dc verdiene av lipider og vaskemidler varierer mellom 0,1-0,16 mL/g21.
    4. Analysere molar massen og radius bruker parameterne montering og funksjonen korrelasjon under visningene Molar masse & Radius fra LS og Rh fra QELS .
  2. Endres RI signalet betraktelig i løpet av IEX-MALS kjøre på grunn av økningen i saltkonsentrasjon. Derfor trekke planlagte signalet fra Tom injeksjon i masse beregninger som krever RI data.
    1. Åpne både protein og tom IEX-MALS eksperimenter. Høyreklikk på protein Eksperimentnavn, velg Brukog velg mappen Planlagte subtraksjon fra dialogboksen. Velg riktig metode (f.eks online) for standard molar masse analyse. Merk at parameterne og innstillingene for protein eksperimentet blir lagret på den nye åpnede metoden.
    2. Velg Importere tomt hvis du vil importere signaler om Tom kjøre under visningen Planlagte subtraksjon . Kontroller alle detektorer trekke under instrumenter (ved siden av knappen Importer tomt ).
    3. I visningen topper justere dn/dc verdiene (om nødvendig) på grunn av ledningsevne løsningen på området protein topp siden RI av løsningen er endret under de kjøre12.
  3. Kalibrere IEX-MALS systemet med BSA monomer.
    Merk: Vanligvis IEX-MALS systemet er regelmessig kalibrert for topp justering, bandet utvide og normalisering av de kantete detektorer til 90° detektoren bruker et monodisperse protein med en radius på gyration (Rg) av < 10 nm, som BSA monomer. I dette eksemplet BSA serverer både kalibrering molekylet, og er gjenstand for molar masse analysen.
    1. Justere toppene, under prosedyrer > konfigurasjon visning.
    2. Utføre normalisering under visningen normalisering inn 3.0 nm som Rg verdien.
    3. Under Bandet utvide i samme konfigurasjon -kategorien, velger toppen og matche det UV og LS signaler å RI signalet, ved hjelp av knappen Utføre passer .
  4. Grafen til resultatene vises i visningen Resultater montering . Endre aksen skalaer og uteffekt diagrammet ved å høyreklikke diagrammet, velger Rediger, og deretter klikke på knappen Avansert . En graf figur med flere visningsalternativer er også tilgjengelig i kategorien EASI graf : Velg Molmasse fra rullegardinmenyen Vis rullegardinmenyen øverst i vinduet.
  5. Merk at alle resultater, inkludert Molmasse, radius, renhetsgrad og andre, er tilgjengelig i rapportvisning (Sammendrag eller detaljerte) under resultatinndelingen . Bruk Rapportgeneratoren knappen for å legge til flere resultater eller parametere, samt tall, i rapporten.

Representative Results

BSA er en vanlig protein som brukes i kromatografi for kalibrering av eksperimentelle systemet22 og er velegnet for å praktisere IEX-MALS, samt SEC-MALS. Det er hovedsakelig monomerisk med en teoretisk monomer masse 66.7 kDa og vanligvis omfatter et lite antall dimers og høyere oligomers23.

BSA ble analysert på IEX MALS bruke en anion exchange analytisk kolonne (se Tabell for materiale). En bred lineær gradient bestående av 30 CV fra 75 mM til 350 mM NaCl atskilt BSA monomerer fra de høyere oligomers. Nedstrøms MALS analyse resulterte i en beregnet monomer molar masse 66.8 ± 0,7 kDa og beregnede dimer molar masse 130 ± 5 kDa (figur 1A).

Basert på bufferen ledningsevne på de eluted toppene, forløpningen ble endret til et annet program: et langt skritt 175 mm NaCl etterfulgt av en lineær gradient fra 175 mM til 500 mM NaCl. Den nye graderingen forbedret oppløsning og utmerket skille mellom BSA monomer (med en beregnet molar masse 66,1 ± 0,7 kDa) og dens høyere oligomeric arter (med en beregnet gjennomsnitt masse 132 ± 2 kDa) (figur 1B). For å fokusere også på høy oligomeric arter og beregne molar masser av hver individuelle oligomeric form av BSA, ble en gradvis program av 200 mM og 250 mM NaCl brukt. Resulterte dette eksperimentet i en utmerket skille mellom BSA monomer (med en beregnet masse 62,4 ± 0,4 kDa) dimer (med en beregnet masse 130 ± 10 kDa) og trimer (med en beregnet masse 170 ± 10 kDa) (figur 1C). Alle IEX-MALS eksperimenter viser at BSA elutes som en monomer med renhet av 80%, med SEC-MALS resultater der BSA monomerer elute med renhet av 85%12.

Figure 1
Figur 1 : Optimalisering av IEX-MALS eksperiment for BSA. (A) IEX-MALS eksperimenter av BSA med en gradient program 75-350 mm NaCl. (B) IEX-MALS eksperimenter av BSA med et program med en 175 mM NaCl trinn etterfulgt av en lineær gradient program 175-500 mm NaCl. (C) IEX-MALS eksperimenter av BSA med et trinn program for 200 mM og 250 mM NaCl. Chromatograms viser UV 280 nm (blå), lys spredning på en 90-graders vinkel (rød), og brytningsindeks (rosa) og ledningsevne (grå) kurver med molar masse hver topp beregnet av MALS (svart). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

IEX-MALS er en kraftig metode for proteiner og karakterisering som lar nøyaktig molar masse fastsettelse av ren proteiner også fra heterogene prøver, karakteriserer innfødte oligomers, finne aggregat, Kovalente og noncovalent komplekser, og conjugated proteiner. Et program som består av en lineær forløpning eller en rekke saltkonsentrasjon trinn kan oppnå en god separasjon av protein befolkningen og la riktig analyse av hver individuelle peak av MALS. Ytterligere optimalisering av varierende ulike parametere, for eksempel gradering skråningen (se trinn 3.4 protokollen), kan utføres hvis en bedre oppløsning. IEX-MALS kan være en verdifull protein kvalitetskontroll analysen siden det gir et ekstra, kritisk nivå av protein karakterisering, utfyllende til andre metoder som SEC-MALS.

SEC-MALS er en standard og felles teknikk for protein molar masse besluttsomhet, kan analytiske SEC standardspalter relativt lav oppløsning begrense nøyaktig molar masse målinger av MALS12. Noen av begrensningene for SEC-MALS eksempler som inneholder påfølgende oligomers, høye nivåer av aggregering som ikke er fullstendig atskilt fra monomer peak og heterogene populasjoner med lignende molar massene, som endret proteiner.

IEX er en mer kompleks kromatografi metode for å utforme og gjennomføre enn SEC, men informasjonen fra et IEX-MALS eksperiment kan utfylle og være enda mer informative enn SEC-MALS analyse. IEX-MALS har med hell preget antistoff varianter som deler de samme molar masse, oligomers som ikke er fullstendig skilt på SEC og kort peptider som er vanskelige å analysere av SEC12,24. Macromolecular samlinger som er for stor til å være atskilt av SEC, som full (inneholder virus-DNA) og tom partikler av adeno-assosiert virus (AAV), kan også løses ved IEX25 før MALS analyse. Sammenlignet med SEC, IEX tilbyr mer variert separasjon evner14 og har fleksibilitet til å justere flere parametere for å øke topp oppløsning, for eksempel buffer pH, salt, typer og lengden av kolonnen, og andre. I motsetning til SEC, det er ingen volumbegrensning for eksempel injeksjon i IEX, og et molekyl kan analyseres uavhengig av størrelsen (se tabell 1 i Amartely et al.12). Dette er en stor fordel av IEX-MALS, hovedsakelig for prøver med en lav LS intensitet, som svært små proteiner eller utvannet proteiner med en tendens til samling på konsentrasjon. Siden analytisk IEX kolonner er mer stabil og slipp færre partikler enn SEC kolonner, IEX-MALS krever svært kort balanse tid og LS signaler er stabilisert veldig fort. Dette gjør at driften av individuelle eksperimenter som beskrevet i denne protokollen og stopp av Kjør som nødvendig.

I motsetning til SEC, som vanligvis gir gode resultater med bare én eksperimentet (med en kolonne med høyre fraksjoneres området), IEX kan kreve flere eksperimenter for å oppnå optimal oppløsning ved å justere metodeparameterne. IEX-MALS eksperimenter som utføres med salt gradering, buffer ledningsevne, og derfor RI endre dramatisk under kjøringen, med påfølgende endringer RI signalet. Dette krever en ekstra tom kjøre for hvert IEX-MALS eksperiment og en analyse med planlagte subtraksjon (som beskrevet i trinn 5.2 protokollen) med mindre konsentrasjon analysen er begrenset til UV gjenkjenning (krever en priori kunnskap om utryddelse koeffisientene for hver topp). Analysen med planlagte subtraksjon er robust lineære forløpninger selv om videre utvikling av metoden er fortsatt nødvendig for vellykket planlagte subtraksjon av salt gradvis programmer. Dn/dc verdiene for hver topp bør justeres i henhold til tjenestespesifikke bufferen ledningsevne på eluted toppen (beregninger kan bli funnet i litteraturen12). Hvis et protein elut på en NaCl konsentrasjon lavere enn 200 mM (som i eksemplet BSA), denne justeringen er ubetydelig.

Den relativt store mengden protein brukes i IEX-MALS (som beskrevet i trinn 2.3 protokollen) sammenlignet med SEC-MALS er viktig å overvinne den dramatiske endringen av RI forårsaket av salt graderingen og RI svingninger på grunn av imperfektum blanding av den gradient buffere. Hvis bare UV klippsøking for masse måling, kan mindre mengder brukes. Mengden av protein for å injisere avhenger av molar masse protein, homogenitet, renhet og UV utryddelse koeffisient. Nødvendig injisert massen bør være høyere for mindre proteiner og lavere for større proteiner (~ 1 mg for en 20 kDa protein og ~0.2 mg for en 150 kDa protein). Heterogen prøver kreve injeksjon av flere prøven siden antallet deles mellom flere populasjoner. Analytiske Væskekromatografi (HPLC) kan kreve mindre materiale enn et FPLC system.

Nylig, innebygd analyse bruker MALS under rensing prosedyrer har blitt rapportert. Så sanntid analyse er svært effektiv for å oppdage samling produkter som oppstår under rensing og kan eliminere behovet for noen videre analyse av proteinet etter rensing26. IEX kromatografi brukes ofte som en mellomliggende rensing trinn; Dermed kan kombinasjonen av skytevåpen IEX kolonner med MALS være nyttig ikke bare som en analytisk karakterisering metode men også som en analyse i sanntid av storskala rensing prosedyrer. Nonanalytical IEX-kolonner er også stabilt, med en lav grad av partikkel slippe, og derfor kan brukes med MALS. Andre separasjon teknikker, for eksempel affinitet kromatografi eller hydrofobe exchange Ture, kan også kombineres med MALS når de utsettes for ren prøver (for å unngå forurensning av de MALS og RI detektorer). Dette krever tilpasning og optimalisering av metoden ikke bare god peak separasjon men også tilstrekkelig ren LS og RI signaler for en vellykket MALS analyse.

Disclosures

DS er ansatt av Wyatt teknologien aksjeselskap, som benyttes i denne protokollen. At er ansatt i Danyel Biotech, en distributør av Wyatt og ÄKTA instrumenter.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Tsafi Danieli (Wolfson senter for anvendt strukturell biologi, hebraiske universitetet) for hennes råd og samarbeid. Forfatterne takker også Danyel Biotech Ltd (Rehovot, Israel) for hjelp og etablering av analytisk FPLC-MALS systemet benyttes i denne studien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ÄKTA pure GE Healthcare 29-0182-26 FPLC 
0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm GE Healthcare 6809-1002 Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm GE Healthcare 6809-1012 Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm GE Healthcare 6809-2012 Mobile phase filter
BSA (purity >97%) Sigma  A1900 Bovine serum albumin
miniDAWN TREOS  Wyatt Technology WTREOS MALS
mono Q HR 5/50 GL GE Healthcare 17-5166-01 Anion exchange analytical column
Optilab T-rEX Wyatt Technology WTREX Refractometer
0.1 mm PES 1000 mL Stericup Millipore SCVPU11RE Mobile phase filter
Sodium chloride Sigma  71382 HPLC grade NaCl
TRISMA base Sigma  T-1503 TRIS buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lebendiker, M., Danieli, T., de Marco, A. The Trip Adviser guide to the protein science world: a proposal to improve the awareness concerning the quality of recombinant proteins. BMC Research Notes. 7, 585 (2014).
  2. Raynal, B., Lenormand, P., Baron, B., Hoos, S., England, P. Quality assessment and optimization of purified protein samples: why and how. Microbial Cell Factories. 13, 180 (2014).
  3. Oliveira, C., Domingues, L. Guidelines to reach high-quality purified recombinant proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (1), 81-92 (2018).
  4. Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
  5. Minton, A. P. Recent applications of light scattering measurement in the biological and biopharmaceutical sciences. Analytical Biochemistry. 501, 4-22 (2016).
  6. Sahin, E., Roberts, C. J. Size-Exclusion Chromatography with Multi-angle Light Scattering for Elucidating Protein Aggregation Mechanisms. Methods in Molecular Biology. 899, 403-423 (2012).
  7. Ogawa, T., Hirokawa, N. Multiple analyses of protein dynamics in solution. Biophysical Reviews. 10 (2), 299-306 (2018).
  8. Rebolj, K., Pahovnik, D., Žagar, E. Characterization of a Protein Conjugate Using an Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation and a Size-Exclusion Chromatography with Multi-Detection System. Analytical Chemistry. 84 (17), 7374-7383 (2012).
  9. Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. Heterogeneity of Monoclonal Antibodies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (7), 2426-2447 (2008).
  10. Hintersteiner, B., et al. Charge heterogeneity: Basic antibody charge variants with increased binding to Fc receptors. mAbs. 8 (8), 1548-1560 (2016).
  11. Wei, B., Berning, K., Quan, C., Zhang, Y. T. Glycation of antibodies: Modification, methods and potential effects on biological functions. mAbs. 9 (4), 586-594 (2017).
  12. Amartely, H., Avraham, O., Friedler, A., Livnah, O., Lebendiker, M. Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization. Scientific Reports. 8 (1), 6907 (2018).
  13. Goyon, A., et al. Evaluation of size exclusion chromatography columns packed with sub-3μm particles for the analysis of biopharmaceutical proteins. Journal of Chromatography A. 1498, 80-89 (2016).
  14. Fekete, S., Beck, A., Veuthey, J. -L., Guillarme, D. Ion-exchange chromatography for the characterization of biopharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 43-55 (2015).
  15. Gasteiger, E., et al. ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  16. Kopaciewicz, W., Regnier, F. E. Mobile phase selection for the high-performance ion-exchange chromatography of proteins. Analytical Biochemistry. 133 (1), 251-259 (1983).
  17. Lebendiker, M., Danieli, T. Production of prone-to-aggregate proteins. FEBS Letters. 588 (2), 236-246 (2014).
  18. Lebendiker, M., Maes, M., Friedler, A. A screening methodology for purifying proteins with aggregation problems. Methods in Molecular Biology. 1258, 261-281 (2015).
  19. Fu, D., et al. Ultraviolet refractometry using field-based light scattering spectroscopy. Optics Express. 17 (21), 18878-18886 (2009).
  20. Scafati, A. R., Stornaiuolo, M. R., Novaro, P. Physicochemical and Light Scattering Studies on Ribosome Particles. Biophysical Journal. 11 (4), 370-384 (1971).
  21. Berthaud, A., Manzi, J., Pérez, J., Mangenot, S. Modeling Detergent Organization around Aquaporin-0 Using Small-Angle X-ray Scattering. Journal of the American Chemical Society. 134 (24), 10080-10088 (2012).
  22. Umrethia, M., Kett, V. L., Andrews, G. P., Malcolm, R. K., Woolfson, A. D. Selection of an analytical method for evaluating bovine serum albumin concentrations in pharmaceutical polymeric formulations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 51 (5), 1175-1179 (2010).
  23. Hirano, A., Arakawa, T., Kameda, T. Effects of arginine on multimodal anion exchange chromatography. Protein Expression and Purification. 116, 105-112 (2015).
  24. Avraham, O., Bayer, E. A., Livnah, O. Crystal structure of afifavidin reveals common features of molecular assemblage in the bacterial dimeric avidins. The FEBS Journal. , (2018).
  25. Lock, M., Alvira, M. R., Wilson, J. M. Analysis of Particle Content of Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 8 Vectors by Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 56-64 (2012).
  26. Patel, B. A., et al. Multi-angle light scattering as a process analytical technology measuring real-time molecular weight for downstream process control. mAbs. 10 (7), 945-950 (2018).

Tags

Biokjemi problemet 146 Ion-exchange (IEX) multi-Angle lysspredning (MALS) Ture proteiner molekylvekt storfe serum albumin (BSA) oligomers kvalitetskontroll
Ionebytte kromatografi (IEX) koblet til multi-Angle lysspredning (MALS) for proteiner og karakterisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Amartely, H., Some, D., Tsadok, A.,… More

Amartely, H., Some, D., Tsadok, A., Lebendiker, M. Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization. J. Vis. Exp. (146), e59408, doi:10.3791/59408 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter