Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Jonbyteskromatografi (IEX) kopplat till multi-Angle ljusspridning (MALS) för Protein Separation och karakterisering

Published: April 5, 2019 doi: 10.3791/59408
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Alexander Silberman Institute of Life Science, The Hebrew University of Jerusalem, 2Wyatt Technology Corporation, 3Danyel Biotech Ltd

Summary

Det här protokollet beskriver användningen av hög-specificitet-jonbyteskromatografi som med flera vinklar ljusspridning för en noggrann molära massan bestämning av proteiner, proteinkomplex och peptider i ett heterogent urval. Denna metod är värdefullt för kvalitetsbedömning, såväl som för karakterisering av infödda oligomerer, kostnad varianter och blandat-protein prover.

Abstract

Jonbyteskromatografi med flera vinklar ljusspridning (IEX-MALS) är en kraftfull metod för protein separation och karakterisering. Kombinationen av hög-specificitet separation tekniken IEX med korrekt molära massan analysen uppnås genom MALS tillåter karakterisering av heterogena protein prover, inbegripet blandningar av Oligomera former eller protein populationer, även med mycket liknande molar massorna. Därför IEX-MALS ger en extra nivå av protein karakterisering och är ett komplement till standard storlek-utslagning kromatografi med flera vinklar ljusspridning (SEC-MALS) teknik.

Här beskriver vi ett protokoll för en grundläggande IEX-MALS experimentera och Visa denna metod på bovint serumalbumin (BSA). IEX skiljer BSA att dess Oligomera former som tillåter en molär massa analys av MALS av varje enskilt formulär. Optimering av ett IEX-MALS experiment presenteras också och visade på BSA, att uppnå utmärkt separation mellan BSA monomerer och större oligomerer. IEX-MALS är en värdefull teknik för protein kvalitetsbedömning eftersom det ger både fin separation och molar massa Bestämning av flera protein arter som finns i ett urval.

Introduction

Kvantitativa karaktärisering av proteinprodukter är allt viktigt som ett medel för kvalitetskontroll (QC), både för tillsynen inom den biofarmaceutiska industrin och att garantera tillförlitlighet och integritet life science forskning1 , 2. enligt beskrivningen på webbplatserna för protein nätverk proteinproduktion och rening partnerskap i Europa (P4EU) och föreningen av resurser för biofysiska forskning i Europa och molekylär biofysik i Europa (ARBRE-MOBIEU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs och https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, respektive), protein QC måste prägla inte bara renheten av den slutliga produkten, men också dess Oligomera tillstånd, homogenitet, identitet, konformation, struktur, posttranslationell ändringar och andra egenskaper3,4.

En av de vanligaste metoderna för QC-karakterisering är SEC-MALS. I denna metod, är en Analyskolonn SEC kopplat till MALS och spektrofotometrisk och Fruktköttets detektorer, möjliggör noggranna mätningar av protein molära massan av varje topp5. SEC-MALS bestämmer molära massan av de eluerade topparna oberoende av elutionsvolymen och övervinner Felaktigheten av analytiska SEC använder kolumnen kalibrering. Tillägg av en dynamisk ljus-spridning (DLS) modul lägger storlek mätning kapacitet vilket gör att hydrodynamiska radien bestämning. Akademisk forskning, SEC-MALS vanligtvis används för att avgöra Oligomera tillstånd för ett protein, dess konformation, graden av renhet, nivå av aggregation och modifierade proteiner, såsom glykoproteiner eller lipid-solubilized membranproteiner (avgöra den Molmassa för protein och konjugat komponenter individuellt)6,7,8.

I många fall slutliga proteinet av en reningsprocess är inte en väl-definierade molekylstorleken utan består snarare av vissa heterogenitet. Proteinerna i sådan blandning kan varieras i form av struktur (till exempel olika Oligomera former), konformationer eller protein isoformer. Protein heterogenitet kan också vara en följd av mindre kemiska skillnader orsakas av C-terminal lysin bearbetning eller asparagin/glutamin Deaminering, leder till debitera variation9,10. Skillnader i posttranslationell ändringar, till exempel glycosylation kan också leda till heterogena prover med kostnad variationer9. Dessa olika typer av heterogenitet återspeglas i proteinets biofysiska egenskaper och kan påverka stabilitet och biologiska aktivitet mål protein11.

Pålitlig kvalitetskontroll analyser av dessa heterogena prover kräver en mycket hävningsklausulerna analytiska separation teknik. Det finns fall där god separation kan utmanas att uppnå med analytiska SEC kolumner, på grund av deras begränsade upplösning och separation förmågor12, vilket resulterar i bristfällig SEC-MALS analys. Att kombinera en hög-specificitet separation teknik såsom IEX med MALS kan övervinna begränsning av SEC-MALS i heterogena prover och ge en kompletterande metod för protein karakterisering (tabell 1 i Amartely et al.12). Till skillnad från SEC, som separerar makromolekyler av deras hydrodynamiska storlek13, separerar IEX makromolekyler av deras ytladdning14. Anjon exchange (AIEX) och katjon exchange (CIEX) matriser binder laddade negativt och positivt varianter, respektive. Med en fin separation mellan protein populationer som delar en förhållandevis nära massa eller form, bestämmer IEX-MALS framgångsrikt molära massan av varje enskild protein stat i en blandning prov12.

Här presenterar vi ett standardprotokoll för att köra ett IEX-MALS experiment för separation och analys av BSA Oligomera formulär som finns i samma prov. Valet av en IEX kolumnen för ett visst protein är viktigt och diskuteras, liksom pH och konduktivitet villkoren av buffertar. Analysen av IEX-MALS experimentella data är också beskrivs steg för steg. Även om separation av BSA oligomerer är bra och tillräcklig i SEC-MALS, är BSA ett bra exempel att Visa IEX-MALS funktionerna och demonstrera optimering av ett experiment. Exempel på dålig separation uppnås genom SEK-MALS och ordentlig separation och analys aktiverat av IEX-MALS diskuteras i en tidigare studie12.

Protocol

1. beredning av systemet

  1. Installera snabbt protein vätskekromatografi (FPLC) system och MALS/refractive index (RI) detektorer (se Tabell för material) tillsammans med deras respektive programvarupaket för kontroll, datainsamling och analys per tillverkarnas instruktioner.
  2. Anslut de MALS och RI detektorerna nedströms den FPLC UV och ledningsförmåga detektorer. Kringgå pH detektorn såvida det inte är absolut nödvändigt för pH övertoningar, att minimera interdetector volymen mellan UV och MALS detektorerna. Använda kapillär slangar av 0,25 – 0,5 mm innerdiameter (i.d.) mellan kolumnen och detektorer och 0,75 mm i.d. kapillär slangar på produktionen av RI detektorn till avfall eller bråkdel insamlaren.
  3. Säkerställa att nödvändiga signal anslutningarna mellan FPLC och detektorer har fastställts, inklusive en UV analog utgång från FPLC detektorn till MALS Aux-ingången och digital utgång från FPLC MALS Autoinject in, via i/o-Box.

2. beredning av provet och buffert

  1. Filtrera alla reagenser, inklusive tvätt- och eluering buffertar, med 0.1 µm filter. Filtrera de första 50 – 100 mL buffert till en avfallsflaskan för att eliminera partiklar från de torra filter, och hålla resten av bufferten i en ren och steril flaska som har tvättas noggrant med filtrerat vatten och ett tak för att förhindra damm från att komma in.
  2. Justera en BSA provet en pH och jonstyrka (t.ex. pH = 8, 50 mM NaCl) att tillåta bindning till kolumnen IEX under utspädning, ultrafiltrering eller buffert exchange förfaranden.
    Obs: Det rekommenderas att förfilter protein provet med minsta porstorlek som inte tar bort material av intresse (0,02 – 0,1 µm). Provet kan alternativt vara centrifugeras i hög hastighet (13 000 – 16 000 x g) i 10 min till aktivera utfällning av stora partiklar.
  3. Förbereda minst 0,3 – 0,5 mg av BSA (se Tabell för material) för att injicera i en 1 mL kolumn (5/50 mm) för att uppnå en god kvalitet MALS analys. Observera att volymen av injektion är obegränsad.

3. val och utveckling av en IEX metod för ett protein

  1. Beräkna den isoelektriska punkten (pI) av proteinet baserat på den primära sekvensen, för vilka servrar som Protparam verktyg på ExPASy webbplats kan vara begagnade15. Observera att produktinformationen för BSA är 5,8.
  2. Välj parametrarna kolumn typ och buffert.
    1. Använda olika buffertar för AIEX och CIEX, beroende på den pKen av bufferten och Joniska arten av bufferten. Använda katjoniska buffertar när du kör den AIEX kolumn och anjoniska buffertar när du kör kolumnen CIEX med små counterions. I det här exemplet Använd 20 mM Tris-HCl buffert, pH 8, för analys av BSA på en kolumn för AIEX.
    2. För ett protein med en pI som är lägre än 7, till exempel BSA, använda en AIEX kolumn och buffert med pH högre än pI av minst två enheter. För ett protein med en pI som är högre än 7, Använd en CIEX kolumn och buffert med pH lägre än protein pI av minst två enheter.
    3. Optimera buffert pH enligt styrkan i bindningen mellan protein och matrisen kolumn. Om ett protein som inte binder väl till kolumnen, Använd en pH vattenhastigheten pI. Kontrollera att proteinet är stabil på begagnade pH.
    4. Använd en låg saltkoncentration i bindningen och tvätta buffertar för att tillåta bindning av proteinet i matrisen, eftersom proteinbindningen beror på jonstyrka av inlästa provet. Proteiner kräver vanligen lite salt för deras stabilitet. därför använda 50 mM NaCl (eller alternativa salt) under stegen protein-lastnings- och kolumn-tvätt.
    5. För eluering buffert, använda högst 0,5 M NaCl för att lösgöra proteinet från kolumnen.
      Obs: Högre salt koncentrationerna rekommenderas inte när du arbetar med standard-modell RI refraktometern på grund av intervall begränsning av instrumentet. Dock en högkoncentrerad modell kan användas och kommer att rymma 2 M NaCl.
  3. Utföra en inledande metod enligt följande.
    1. Ladda 1 mg BSA (170 µL av 6 mg/mL) i ~0.5 mL en lastning buffert på 20 mM Tris-HCl buffert, pH 8, innehållande 50 mM NaCl. Tvätta kolonnen med samma bufferten för en 10 – 15 kolumn volym (CV) att tillåta den komplett elueringen av obundna molekyler och partiklar från systemet förrän ljusspridningen (LS), UV, och RI signaler är fullt stabiliserad.
    2. Utföra en kort, linjär salt gradient av 20 – 30 CV, använder eluering buffert på 20 mM Tris-HCl, pH 8, som innehåller 0.5 M NaCl för att lossa proteinet från kolumnen. Utföra en gradient av 0 – 100% (eller alternativa utbredd gradient) eluering bufferten eller dela den till två lutningar: 0 – 50% av eluering buffert följt av en ytterligare lutning av 50 – 100% av eluering buffert, varje övertoning för 10 – 20 CV. För BSA, använda en utbredd lutning på 15% – 70% för 30 CV för den ursprungliga metoden.
      Obs: I vissa fall kan den ursprungliga metoden kan ge separation för en tillförlitlig MALS analys, och ytterligare körningar behövs inte. I många fall ger första metoden endast vägledning för ytterligare metod optimering.
  4. Optimera metoden IEX för att öka upplösningen och förbättra peak separationen genom att ändra olika parametrar.
    1. Ändra lutning lutning och längd. Kort övertoningar med höga backar ger intensiv toppar med mindre separation, medan långa lutningar med mild backar ger lägre toppar med bättre separation. Hitta balans mellan maximal upplösning och signal intensiteten för optimal MALS analys.
      Obs: Laddar en högre mängd protein kan öka LS, UV, och RI signaler gör men det på bekostnad av upplösning.
    2. Använd en stegvis saltkoncentrationen profil för elueringen. Kom ihåg att en kombination av steg och linjär gradient ofta används.
    3. Minska flödet för att förbättra peak separation.
      Obs: För matriser med mycket små partiklar, detta är inte mycket betydande.
    4. Ändra buffert pH för att öka laddningen variationen mellan protein befolkningarna i provet och förbättra separationen mellan dessa varianter. Observera att proteiner som inte är ordentligt separerade vid ett pH kan skiljas vid olika pH.
    5. Använd en pH gradient, linjär eller stegvis, för att lossa proteiner från kolumnen IEX. Använd eluering övertoningar som kombinerar både pH och salthalt variationer vid behov.
    6. Använd starkare salter, såsom MgCl2eller svagare salter, såsom natriumacetat, för att öka känslighet och upplösning16.
    7. Använda längre IEX kolumner eller en annan kolumn matris med mindre partiklar för att förbättra separation förmågor.
    8. Ändra typen av kolumn (AIEX/CIEX) för att tillhandahålla olika mönster av separation. Observera att matriser med starka, svaga eller kombinerade (blandad) ligander är också tillgängliga och kan förbättra upplösning av vissa prover.
    9. Använda en kolumn från en annan leverantör med samma liganden som är kopplad till olika matrix hartser. Kådan själv, oberoende av liganden, kan interagera på olika sätt med proteiner och påverka separation profilen.
    10. Inkludera tillsatser (molekyler som stabilisera proteinet i lösningen) i buffertar att förbättra protein stabiliteten och undvika protein aggregering, för att förbättra IEX experimentet.
      Anmärkning: Exempel på sådana tillsatser är sockerarter, alkoholer, urea, icke-jonaktivt eller zwitterionic rengöringsmedel och chaotropic och kosmotropic salter17,18.

4. IEX-MALS experiment

  1. Öppna New\Experiment från metod i programvaran MALS och välj online -metoden från mappen Ljus spridning system metoder. Om modulen DLS finns och DLS data förvärvas, Välj online -metoden från undermappen Ljus Scattering\With QELS .
  2. Ställa in parametrar för körningen under avsnittet konfiguration .
    1. Ange flödet klassar av kör i avsnittet Generiska Pump till det flöde som används i FPLC (1,5 mL/min), och ange eller kontrollera parametrarna buffert under avsnittet lösningsmedel .
    2. Ange namnet protein (BSA), brytningsindex increment (dn/dc; standard värdet för proteiner är 0.185 mL/g), UV extinktionskoefficient vid våglängden av 280 nm (0.66 HB-1·cm-1), och koncentrationen av protein provet (6 mg/mL) i fliken prov under avsnittet injektor . Infoga provvolymen för injektion (170 µL) samt under samma avsnitt.
    3. På fliken Grundläggande samling , under avsnittet förfarande , markera kryssrutan utlösare på Autoinject och ange varaktigheten för körningen så att insamlingen av data kommer att fortsätta i minst 5 min efter toningen har nått sin slutliga värde.
  3. Ange parametrar för experiment i programvaran FPLC.
    1. Skapa ett nytt experiment i fliken Method Editor . Vid första försöket kommer att vara en linjär övertoning salt eller pH (se steg 3.3). För metoden med optimerad, skapa en mer specifik övertoning eller stegvis program enligt eluering resultaten under den första metoden (se steg 3,4 och figur 1). Inkludera en signal i den metod som kommer att utlösa datainsamling i programvaran MALS.
    2. Tvätta den kolumn och ventiler med relevanta buffertar: 20 mM Tris-HCl, pH 8, med 50 mM NaCl för tvätt bufferten (en ventil) och samma bufferten med 500 mM NaCl för eluering bufferten (B ventil). Se till att den sista kolumn tvätten använder bindande bufferten, som innehåller en låg salthalt, aktivera bindningen av proteinet i kolumnen matrisen. För en massiv starkt bundna orenheter, Använd 0,5 M NaOH innan tvätt med relevanta buffertar, följt av en neutralisering buffert tvätt.
    3. Placera protein provet i slingan med en spruta. Om mer än 10 mL av provet är laddad, använda en superloop eller pump-ventilen FPLC instrumentet medan kringgå filterpump och mixern av FPLC.
  4. Börja experimentet i MALS-programvaran genom att klicka på knappen kör och sedan i programvaran FPLC. Uppgifterna samlas efter får puls signalen från FPLC instrumentet via MALS detektorn.
  5. Tillämpa samma parametrar av kör och instruktioner som beskrivs i steg 4.1 – 4.4 om den IEX-MALS utförs manuellt med ett kontinuerligt flöde-läge i stället för en fristående metod.
  6. När den sista metoden har kontrollerats och köra, utföra exakt samma metod med hjälp av en tom injektion (lastning buffert istället för provet). Det är viktigt att tidpunkten mellan autoinject puls och lutningen av Tom kör är identisk med provet körs.

5. analys av IEX-MALS experimentella data

  1. Utför analysen steg under avsnittet förfarande i programvaran MALS. Vyn Grundläggande samling visar rådata insamling av experimentet.
    1. Använd fliken Despiking för att släta av kromatogram om de uppvisar en massa oväsen. Normalt Använd normal nivå.
    2. Definiera baslinjen för alla signaler (alla LS, UV och RI detektorer) i vyn baslinjen .
    3. Definiera topparna för analys i vyn toppar . Verifiera de korrekta värdena av dn/dc och UV utrotning koefficienten för proteinet under varje topp.
      Obs: För proteiner, är det vanligt att använda en standard RI ökningsvärdet 0.185 mL/g, men för andra makromolekyler, olika dn/dc värden bör användas, beroende på arten av molekylen. Den genomsnittliga dn/dc av polynukleotider (DNA/RNA) är 0.17 mL/g19, medan sackarider, såsom sackaros, har en genomsnittlig dn/dc värdet 0,145 mL/g20 och dn/dc värdena av lipider och rengöringsmedel intervallet 0,1 – 0,16 mL/g21.
    4. Analysera Molmassa och radien använder parametrarna montering och korrelationsfunktionens under Molmassa & radie från LS och Rh från QELS vyer.
  2. De RI signal förändringarna avsevärt under den IEX-MALS köras på grund av ökningen av salt koncentration. Därför, subtrahera baslinjen signalen från Tom injektionen för massa beräkningar som kräver RI data.
    1. Öppna både protein och Tom IEX-MALS experiment. Högerklicka på namnet protein experiment, Välj Tillämpa metodoch välj mappen Baslinjen subtraktion från fildialogrutan. Välj rätt typ av metod (t.ex. online) för standard molära massan analys. Observera att parametrar och inställningar som har definierats för protein experimentet kommer att sparas på den nya öppna metoden.
    2. Klicka på Importera Tom om du vill importera signalerar av Tom kör under vyn Baslinjen subtraktion . Kontrollera alla detektorerna att subtrahera under instrument (bredvid knappen Importera tomt ).
    3. I vyn toppar justera dn/dc värdena (vid behov) på grund av konduktiviteten i lösningen vid protein toppens, eftersom RI av lösningen ändras under den kör12.
  3. Kalibrera IEX-MALS systemet med BSA monomer.
    Obs: Normalt IEX-MALS systemet regelbundet kalibreras för peak justering, bandet breddning och normalisering av de kantiga detektorerna till 90° detektorn använder en monodisperse protein med en radie av gyration (R-g) av < 10 nm, såsom BSA monomer. I det här exemplet BSA serverar både som kalibrering molekylen och själv är föremål för den molära massan analysen.
    1. Justera topparna, enligt de förfaranden > konfiguration Visa.
    2. Utföra normalisering under vyn normalisering , in 3.0 nm som Rg värde.
    3. Välj topp under Bandet bredda samma på fliken konfiguration , och UV och LS signalerna till RI signalen, använda knappen Utför passar .
  4. Grafen av resultaten visas i vyn Resultat montering . Ändra axis skalorna och andra parametrar för diagrammet genom att högerklicka på diagrammet, välja Redigera, och sedan klicka på knappen Avancerat . En graf figur med mer visningsalternativ är också tillgänglig i fliken EASI graf : Välj Molmassa på Visa nedrullningsbara menyn längst upp i fönstret.
  5. Observera att alla resultat, inklusive Molmassa, radie, grad av renhet och andra, är tillgängliga i rapportvyn (Sammanfattning eller detaljerade) under avsnittet resultat . Använd knappen Report Designer att lägga till fler resultat eller parametrar, samt siffror i rapporten.

Representative Results

BSA är ett vanligt protein som används i kromatografi för kalibrering av den experimentella system22 och är mycket lämpliga för att öva IEX-MALS, liksom SEC-MALS. Det är främst monomer med en teoretisk monomer massa 66,7 kDa och oftast innehåller ett litet antal dimerer och högre oligomerer23.

BSA analyserades på IEX-MALS med hjälp av en anjon exchange Analyskolonn (se Tabell för material). En bred linjär gradient bestående av 30 CV från 75 mM till 350 mM NaCl separerade BSA monomerer från de högre oligomererna. Nedströms MALS analys resulterade i en beräknad monomer Molmassa av 66,8 ± 0,7 kDa och en beräknad dimer Molmassa av 130 ± 5 kDa (figur 1A).

Baserat på den buffert ledningsförmågan vid de eluerade topparna, toningen har ändrats till ett annat program: en lång steg på 175 mM NaCl följt av en linjär övertoning från 175 mM till 500 mM NaCl. Den nya övertoningen förbättrats avsevärt upplösning och utmärkt separation mellan BSA monomer (med en beräknad Molmassa av 66,1 ± 0,7 kDa) och dess högre Oligomera arter (med en beräknad genomsnittlig massa 132 ± 2 kDa) (figur 1B). För att kunna fokusera också på hög Oligomera arter och för att beräkna molära massan av varje enskild Oligomera form av BSA, tillämpades en stegvis program för 200 mM och 250 mM NaCl. Detta experiment resulterade i en utmärkt separation mellan BSA monomer (med en beräknad massa 62,4 ± 0,4 kDa), (med en beräknad massa 130 ± 10 kDa)-dimer och trimer (med en beräknad massa 170 ± 10 kDa) (figur 1C). Alla IEX-MALS experiment visar att BSA eluerar mestadels som en monomer med en renhet på 80%, i samförstånd med SEC-MALS resultat där BSA monomerer eluera med en renhetsgrad av 85%12.

Figure 1
Figur 1 : Optimering av IEX-MALS experiment för BSA. (A) IEX-MALS experiment av BSA med en gradient program 75 – 350 mm NaCl. (B) IEX-MALS experiment av BSA med ett program av en 175 mM NaCl steg följt av en linjär övertoning program av 175 – 500 mM NaCl. (C) IEX-MALS experiment av BSA med ett steg program av 200 mM och 250 mM NaCl. Kromatogram Visa UV vid 280 nm (blå), ljus spridning på 90° vinkel (röd), och brytningsindex (rosa) och ledningsförmåga (grå) kurvor tillsammans med den molära massan av varje topp som beräknas av MALS (svart). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

IEX-MALS är en kraftfull metod för protein separation och karakterisering som tillåter korrekt molära massan bestämning av rena proteiner samt per heterogena prover, karaktärisera infödda oligomerer, nonnative aggregat, kovalent och noncovalent komplex och konjugerad proteiner. Ett program bestående av en linjär övertoning eller en serie saltkoncentrationen steg kan uppnå en god separation av protein befolkningarna och möjliggöra korrekt analys av varje enskild topp av MALS. Ytterligare optimering genom att variera olika parametrar, såsom lutning lutning (se steg 3,4 i protokollet), kan utföras om en bättre upplösning krävs. IEX-MALS kan vara en värdefull protein kvalitet kontrollanalysen eftersom det ger en ytterligare, kritisk nivå av protein karakterisering, komplement till andra metoder såsom SEC-MALS.

SEC-MALS är en standard och gemensam teknik för protein molära massan beslutsamhet, begränsa den relativt låga matchningen av analytiska SEC standardkolumner noggranna molar massa mätningar genom MALS12. Några exempel på begränsningar av SEC-MALS lösningar som innehåller sammanhängande oligomerer, höga nivåer av aggregation som inte är helt separerade från monomer peak och heterogena populationer med liknande molära massan, såsom modifierade proteiner.

IEX är en mer komplex kromatografi metoden att utforma och genomföra än SEK, men den information som erhålls från ett IEX-MALS experiment kan komplettera och ibland vara ännu mer informativ än SEC-MALS analys. IEX-MALS har framgångsrikt präglat antikropp varianter som delar de samma molära massan, oligomerer som inte är helt separerade på SEC och kort peptider som är svåra att analysera av SEC12,24. Makromolekylära sammansättningar som är för stor för att vara avgränsade med SEC, såsom full (innehållande virus-DNA) och Tom partiklar av adeno-associerade virus (AAV), kan också lösas genom IEX25 före MALS analys. IEX jämfört med SEK, och erbjuder mer varierande separation kapacitet14 och det har flexibiliteten att kunna justera flera parametrar för att öka maximal upplösning, t ex buffert pH, typer av salt, typer och längd av kolumnen, m.fl. Till skillnad från SEC, det finns ingen volymbegränsning för prov injektion i IEX, och någon molekyl kan analyseras oberoende av dess storlek (se tabell 1 i Amartely et al.12). Detta är en stor fördel med IEX-MALS, främst för prover med en lågintensiv LS, såsom mycket små proteiner eller utspädda proteiner med en tendens för aggregering vid koncentrationen. Eftersom analytisk IEX kolumner är stabilare och tenderar att släppa färre partiklar än SEC kolumner, IEX-MALS kräver mycket kort Jämviktstiden tid och LS signaler är stabiliserad mycket snabbt. Detta gör att driften av enskilda experiment som beskrivs i detta protokoll och stoppa av kör som krävs.

Till skillnad från SEC, som vanligtvis ger fina resultat med en enda experiment (med en kolumn med rätt fraktionering utbud), IEX kan kräva flera experiment att uppnå optimal upplösning genom att trimma Metodparametrarna. I IEX-MALS experiment som utförs med en salt lutning, buffert ledningsförmåga och, därmed, RI förändras dramatiskt under körningen, med åtföljande förändringar av RI signalen. Detta kräver en extra Tom köra för varje IEX-MALS experiment och en analys med baslinjen subtraktion (enligt beskrivningen i steg 5.2 i protokollet) om koncentration analysen begränsas till UV-detektion (som kräver en priori kunskap om utrotning koefficienter för varje topp). Analysen med baslinjen subtraktion är robust för linjära övertoningar, även om ytterligare utveckling av metoden krävs fortfarande för den framgångsrika baslinjen subtraktionen av salt stegvis program. Dn/dc värdena för varje topp bör anpassas efter specifika buffert ledningsförmåga på eluerade toppen (beräkningar kan hittas i litteraturen12). Om ett protein elueras vid en koncentration av NaCl som är lägre än 200 mM (som i exemplet med BSA), denna justering är försumbar.

Den relativt stora mängden protein som används i IEX-MALS (enligt beskrivning i steg 2,3 i protokollet) jämfört med SEK-MALS är viktigt att övervinna dramatiska förändringen av RI signalen orsakas av salt toningen och RI svängningar på grund av ofullständig blandning av den Gradient buffertar. Om bara UV-detektion används för massa mätning, får mindre belopp användas. Mängden protein att injicera beror på molära massan av proteinet, homogenitet, renhet och den UV extinktionskoefficient. Den nödvändiga injicerade massan bör vara högre för mindre proteiner och lägre för större proteiner (~ 1 mg för en 20 kDa-protein och ~0.2 mg för en 150 kDa-protein). Heterogena prover kräver injektion av fler prov eftersom kvantiteten delas mellan flera populationer. Analytiska högpresterande vätskekromatografi (HPLC) kan kräva mindre material än ett FPLC system.

Nyligen, i-line analys med MALS under rening förfaranden har rapporterats. Sådan en realtidsanalys är mycket effektiv för att upptäcka aggregering produkter som uppstå vid rening och kan eliminera behovet av vidare analys av protein efter rening26. IEX kromatografi används ofta som en mellanliggande reningssteg; kombinationen av preparativ IEX kolumner med MALS kan således användbar inte bara som en analytisk karakterisering metod men också som en realtidsanalys av storskalig rening förfaranden. Nonanalytical IEX kolumner är också stabil, med en låg grad av partikel släppa och, därför, kan användas med MALS. Andra separation tekniker, såsom affinitetskromatografi eller hydrofoba exchange kromatografi, kan också kombineras med MALS när de utsätts för relativt ren prover (för att undvika kontaminering av de MALS och RI detektorerna). Detta kommer att kräva anpassning och optimering av metoden att få inte bara bra peak separation men också tillräckligt rena LS och RI signaler för en framgångsrik MALS analys.

Disclosures

D.S. är anställd av Wyatt Technology Corporation, vars produkter utnyttjas i detta protokoll. A.T. är anställd i Danyel Biotech, en distributör av Wyatt och ÄKTA instrument.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Dr Tsafi Danieli (Wolfson centrum för tillämpad strukturbiologi, Hebrew University) för hennes råd och samarbeten. Författarna också tacka Danyel Biotech Ltd (Rehovot, Israel) för bistånd och inrättandet av FPLC-MALS analyssystemet utnyttjas i denna studie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ÄKTA pure GE Healthcare 29-0182-26 FPLC 
0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm GE Healthcare 6809-1002 Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm GE Healthcare 6809-1012 Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm GE Healthcare 6809-2012 Mobile phase filter
BSA (purity >97%) Sigma  A1900 Bovine serum albumin
miniDAWN TREOS  Wyatt Technology WTREOS MALS
mono Q HR 5/50 GL GE Healthcare 17-5166-01 Anion exchange analytical column
Optilab T-rEX Wyatt Technology WTREX Refractometer
0.1 mm PES 1000 mL Stericup Millipore SCVPU11RE Mobile phase filter
Sodium chloride Sigma  71382 HPLC grade NaCl
TRISMA base Sigma  T-1503 TRIS buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lebendiker, M., Danieli, T., de Marco, A. The Trip Adviser guide to the protein science world: a proposal to improve the awareness concerning the quality of recombinant proteins. BMC Research Notes. 7, 585 (2014).
  2. Raynal, B., Lenormand, P., Baron, B., Hoos, S., England, P. Quality assessment and optimization of purified protein samples: why and how. Microbial Cell Factories. 13, 180 (2014).
  3. Oliveira, C., Domingues, L. Guidelines to reach high-quality purified recombinant proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (1), 81-92 (2018).
  4. Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
  5. Minton, A. P. Recent applications of light scattering measurement in the biological and biopharmaceutical sciences. Analytical Biochemistry. 501, 4-22 (2016).
  6. Sahin, E., Roberts, C. J. Size-Exclusion Chromatography with Multi-angle Light Scattering for Elucidating Protein Aggregation Mechanisms. Methods in Molecular Biology. 899, 403-423 (2012).
  7. Ogawa, T., Hirokawa, N. Multiple analyses of protein dynamics in solution. Biophysical Reviews. 10 (2), 299-306 (2018).
  8. Rebolj, K., Pahovnik, D., Žagar, E. Characterization of a Protein Conjugate Using an Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation and a Size-Exclusion Chromatography with Multi-Detection System. Analytical Chemistry. 84 (17), 7374-7383 (2012).
  9. Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. Heterogeneity of Monoclonal Antibodies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (7), 2426-2447 (2008).
  10. Hintersteiner, B., et al. Charge heterogeneity: Basic antibody charge variants with increased binding to Fc receptors. mAbs. 8 (8), 1548-1560 (2016).
  11. Wei, B., Berning, K., Quan, C., Zhang, Y. T. Glycation of antibodies: Modification, methods and potential effects on biological functions. mAbs. 9 (4), 586-594 (2017).
  12. Amartely, H., Avraham, O., Friedler, A., Livnah, O., Lebendiker, M. Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization. Scientific Reports. 8 (1), 6907 (2018).
  13. Goyon, A., et al. Evaluation of size exclusion chromatography columns packed with sub-3μm particles for the analysis of biopharmaceutical proteins. Journal of Chromatography A. 1498, 80-89 (2016).
  14. Fekete, S., Beck, A., Veuthey, J. -L., Guillarme, D. Ion-exchange chromatography for the characterization of biopharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 43-55 (2015).
  15. Gasteiger, E., et al. ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  16. Kopaciewicz, W., Regnier, F. E. Mobile phase selection for the high-performance ion-exchange chromatography of proteins. Analytical Biochemistry. 133 (1), 251-259 (1983).
  17. Lebendiker, M., Danieli, T. Production of prone-to-aggregate proteins. FEBS Letters. 588 (2), 236-246 (2014).
  18. Lebendiker, M., Maes, M., Friedler, A. A screening methodology for purifying proteins with aggregation problems. Methods in Molecular Biology. 1258, 261-281 (2015).
  19. Fu, D., et al. Ultraviolet refractometry using field-based light scattering spectroscopy. Optics Express. 17 (21), 18878-18886 (2009).
  20. Scafati, A. R., Stornaiuolo, M. R., Novaro, P. Physicochemical and Light Scattering Studies on Ribosome Particles. Biophysical Journal. 11 (4), 370-384 (1971).
  21. Berthaud, A., Manzi, J., Pérez, J., Mangenot, S. Modeling Detergent Organization around Aquaporin-0 Using Small-Angle X-ray Scattering. Journal of the American Chemical Society. 134 (24), 10080-10088 (2012).
  22. Umrethia, M., Kett, V. L., Andrews, G. P., Malcolm, R. K., Woolfson, A. D. Selection of an analytical method for evaluating bovine serum albumin concentrations in pharmaceutical polymeric formulations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 51 (5), 1175-1179 (2010).
  23. Hirano, A., Arakawa, T., Kameda, T. Effects of arginine on multimodal anion exchange chromatography. Protein Expression and Purification. 116, 105-112 (2015).
  24. Avraham, O., Bayer, E. A., Livnah, O. Crystal structure of afifavidin reveals common features of molecular assemblage in the bacterial dimeric avidins. The FEBS Journal. , (2018).
  25. Lock, M., Alvira, M. R., Wilson, J. M. Analysis of Particle Content of Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 8 Vectors by Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 56-64 (2012).
  26. Patel, B. A., et al. Multi-angle light scattering as a process analytical technology measuring real-time molecular weight for downstream process control. mAbs. 10 (7), 945-950 (2018).

Tags

Biokemi fråga 146 Ion exchange (IEX) flera vinklar ljusspridning (MALS) kromatografi protein separation molekylvikt bovint serum albumin (BSA) oligomerer kvalitetskontroll
Jonbyteskromatografi (IEX) kopplat till multi-Angle ljusspridning (MALS) för Protein Separation och karakterisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Amartely, H., Some, D., Tsadok, A.,… More

Amartely, H., Some, D., Tsadok, A., Lebendiker, M. Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization. J. Vis. Exp. (146), e59408, doi:10.3791/59408 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter