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Biochemistry

आयन एक्सचेंज क्रोटोग्राफी (आईईईईएक्स) में प्रोटीन पृथक्करण और विशेषीकरण के लिए मल्टी-एंगल लाइट कैटरिंग (मलों) को युग्मित

Published: April 5, 2019 doi: 10.3791/59408
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Alexander Silberman Institute of Life Science, The Hebrew University of Jerusalem, 2Wyatt Technology Corporation, 3Danyel Biotech Ltd

Summary

यह प्रोटोकॉल एक विषम नमूना में प्रोटीन, प्रोटीन परिसरों, और पेप्टाइड्स के एक सटीक दाढ़ सामूहिक संकल्प के लिए बहु कोण प्रकाश बिखरने के साथ उच्च विशिष्टता आयन-विनिमय क्रोटोग्राफी के उपयोग का वर्णन करता है । इस विधि गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए मूल्यवान है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में देशी oligomers, प्रभारी वेरिएंट, और मिश्रित प्रोटीन नमूने के लक्षण वर्णन के लिए ।

Abstract

आयन-मल्टी कोण प्रकाश बिखरने के साथ विनिमय क्रोटोग्राफी (IEX-मलों) प्रोटीन जुदाई और लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली तरीका है । सटीक दाढ़ मास विश्लेषण के साथ उच्च विशिष्टता जुदाई तकनीक iex के संयोजन से प्राप्त विषमजातीय प्रोटीन नमूनों के लक्षण वर्णन, oligomeric रूपों या प्रोटीन की आबादी के मिश्रण सहित, यहां तक कि बहुत से इसी तरह की मोलर जनता । इसलिए, IEX-मलों एक अतिरिक्त स्तर के प्रोटीन लक्षण वर्णन प्रदान करता है और मानक आकार-बहिष्करण क्रोमेटोग्राफी के साथ बहु-कोण प्रकाश बिखरने (सेक-मलों) तकनीक के पूरक है ।

यहां हम एक बुनियादी iex-मलों प्रयोग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन और गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (bsa) पर इस विधि का प्रदर्शन । Iex अपने oligomeric रूपों के लिए bsa अलग प्रत्येक व्यक्ति के फार्म की मलों द्वारा एक दाढ़ व्यापक विश्लेषण की अनुमति । एक iex-मलों के अनुकूलन प्रयोग भी प्रस्तुत किया है और bsa पर प्रदर्शन, bsa मोनोमर और बड़ा oligomers के बीच उत्कृष्ट जुदाई को प्राप्त करने । Iex-मलों प्रोटीन गुणवत्ता के मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान तकनीक है क्योंकि यह दोनों ठीक जुदाई और एक नमूना में मौजूद है कि कई प्रोटीन प्रजातियों के दाढ़ सामूहिक संकल्प प्रदान करता है ।

Introduction

प्रोटीन उत्पादों की मात्रात्मक लक्षण वर्णन तेजी से गुणवत्ता नियंत्रण (QC) के एक साधन के रूप में आवश्यक है, दोनों biopharmaceutical उद्योग में नियामक प्रयोजनों के लिए और विश्वसनीयता और जीवन विज्ञान अनुसंधान की अखंडता की गारंटी1 , 2. जैसा कि यूरोप में प्रोटीन नेटवर्क प्रोटीन उत्पादन और शोधन भागीदारी की वेबसाइटों पर वर्णित (P4EU) और यूरोप में जैव भौतिकी अनुसंधान के लिए संसाधनों के संघ और यूरोप में आणविक जैव भौतिकी (आरबर्-मोबीयू) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs और https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, क्रमशः), प्रोटीन QC न केवल अंतिम उत्पाद की पवित्रता की विशेषता चाहिए, लेकिन यह भी अपने oligomeric राज्य, एकरूपता, पहचान, conformation, संरचना, posttranslational संशोधनों, और अंय गुण3,4।

सबसे आम QC लक्षण वर्णन विधियों में से एक SEC-मलों है । इस विधि में, एक विश्लेषणात्मक सेकंड कॉलम मलों और स्पेक्ट्रोफोटोमितीय और रिफ्रैक्टोमेट्रिक डिटेक्टरों के लिए युग्मित है, प्रत्येक चोटी5के प्रोटीन दाढ़ द्रव्यमान की सटीक माप को सक्षम करने । सेक-मलों eluted चोटियों के दाढ़ द्रव्यमान का निर्धारण स्वतंत्र रूप से स्फूर्ति की मात्रा से और कॉलम अंशांकन का उपयोग कर विश्लेषणात्मक सेकंड की अशुद्धि काबू । एक गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (dls) मॉड्यूल के अलावा आकार माप क्षमता द्रवगतिक त्रिज्या दृढ़ संकल्प की अनुमति कहते हैं । अकादमिक अनुसंधान में, सेकंड-मलों आमतौर पर एक प्रोटीन की oligomeric राज्य निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, इसकी रचना, शुद्धता के स्तर, एकत्रीकरण के स्तर, और संशोधित प्रोटीन, जैसे कि नच या लिपिड-सॉल्बिलाइज्ड झिल्ली प्रोटीन (निर्धारित प्रोटीन का मोलर द्रव्यमान और घटकों को व्यक्तिगत रूप से संयुग्मी करना)6,7,8.

कई मामलों में, एक शुद्धि प्रक्रिया के अंतिम प्रोटीन एक अच्छी तरह से परिभाषित आणविक प्रजातियों नहीं बल्कि कुछ विषमजनन शामिल हैं । इस तरह के मिश्रण में प्रोटीन संरचना (उदाहरण के लिए, विभिंन oligomeric रूपों), conformations, या प्रोटीन isoforms के मामले में अलग किया जा सकता है । प्रोटीन विविधता भी सी-टर्मिनल lysine प्रसंस्करण या asparagine/ग्लूटामिन deamination के कारण मामूली रासायनिक मतभेदों का एक परिणाम हो सकता है, परिवर्तन चार्ज करने के लिए अग्रणी9,10. ऐसे ग्लाइकोसिलेशन के रूप में posttranslational संशोधनों में अंतर भी आरोप विविधताओं9के साथ विषम नमूनों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । विविधता के इन विभिंन प्रकार के प्रोटीन जैव भौतिक विशेषताओं में परिलक्षित होते है और स्थिरता और लक्ष्य प्रोटीन11के जैविक गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं ।

इस तरह के विषम नमूनों की विश्वसनीय गुणवत्ता नियंत्रण assays एक अत्यधिक रिज़ॉल्टिव विश्लेषणात्मक पृथक्करण तकनीक की आवश्यकता होती है । वहां मामलों जहां अच्छा जुदाई विश्लेषणात्मक सेकंड कॉलम के साथ प्राप्त करने के लिए चुनौती दी जा सकती हैं, उनके सीमित संकल्प और जुदाई क्षमताओं12के कारण, त्रुटिपूर्ण सेकंड में जिसके परिणामस्वरूप-मलों विश्लेषण । ऐसी मलों के साथ IEX के रूप में एक उच्च विशिष्टता जुदाई तकनीक के संयोजन विषमजातीय नमूनों में सेक की सीमा को दूर कर सकते है और प्रोटीन लक्षण वर्णन के लिए एक पूरक विधि प्रदान (तालिका 1 Amartely एट अल.12में) । सेकंड के विपरीत, जो उनके द्रवगतिक आकार13द्वारा अणुओं अलग करता है, iex उनके सतह चार्ज14द्वारा अणुओं अलग करता है । Anion एक्सचेंज (AIEX) और धनायन एक्सचेंज (CIEX) matrixes नकारात्मक और सकारात्मक आरोप लगाया वेरिएंट, क्रमशः बाँध । एक अपेक्षाकृत करीब द्रव्यमान या आकार का हिस्सा है कि प्रोटीन आबादी के बीच एक ठीक जुदाई के साथ, iex-मलों सफलतापूर्वक एक मिश्रण नमूना12में प्रत्येक व्यक्ति प्रोटीन राज्य के दाढ़ द्रव्यमान निर्धारित करता है ।

यहाँ हम एक IEX-एक ही नमूना में मौजूद है कि BSA oligomeric रूपों के विभाजन और विश्लेषण के लिए प्रयोग-मलों चलाने के लिए एक मानक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. एक विशिष्ट प्रोटीन के लिए एक IEX कॉलम के चुनाव महत्वपूर्ण है और चर्चा की, के रूप में अच्छी तरह के रूप में पीएच और बफ़र्स की चालकता की स्थिति । IEX-मलों के प्रयोगात्मक डेटा का विश्लेषण भी कदम दर कदम बताया जाता है । हालांकि BSA oligomers के जुदाई अच्छा है और सेकंड में पर्याप्त-मलों, BSA एक अच्छा उदाहरण के लिए IEX-मलों क्षमताओं को दिखाने के लिए और एक प्रयोग के अनुकूलन का प्रदर्शन है । सेकंड-मलों द्वारा प्राप्त खराब पृथक्करण और आईईएक्स-मलों द्वारा सक्षम उचित पृथक्करण और विश्लेषण के उदाहरण पिछले अध्ययन12में चर्चा में हैं ।

Protocol

1. व्यवस्था की तैयारी

  1. फास्ट प्रोटीन लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (FPLC) प्रणाली और मलों/अपवर्तनांक (आरआई) डिटेक्टरों ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ अपने संबंधित सॉफ्टवेयर संकुल के साथ नियंत्रण, डेटा अधिग्रहण, और विश्लेषण के प्रति निर्माताओं को स्थापित करें ' निर्देश.
  2. मलों और आरआई डिटेक्टरों FPLC के यूवी और चालकता डिटेक्टरों के डाउनस्ट्रीम कनेक्ट करें । पीएच डिटेक्टर बाईपास जब तक यह पूरी तरह से पीएच gradients के लिए आवश्यक है, यूवी और मलों डिटेक्टरों के बीच interdetector मात्रा को कम करने के लिए । उपयोग केशिका टयूबिंग 0.25-0.5 मिमी भीतरी व्यास (आईडी) के बीच कॉलम और डिटेक्टरों और ०.७५ मिमी आईडी केशिका के आउटपुट पर आरआई डिटेक्टर अपशिष्ट या अंश कलेक्टर को ।
  3. सुनिश्चित करें कि FPLC और डिटेक्टरों के बीच आवश्यक संकेत कनेक्शन स्थापित किया गया है, FPLC डिटेक्टर से एक यूवी एनालॉग आउटपुट सहित मलों Aux इनपुट और डिजिटल आउटपुट के लिए FPLC से मलों में Autoinject, I/O बॉक्स के माध्यम से.

2. नमूना और बफर की तैयारी

  1. एक ०.१ μm फिल्टर के साथ, धोने और रेफरेंस बफ़र्स सहित सभी अभिकर्मकों फिल्टर । फिल्टर पहले 50-बफर के 100 मिलीलीटर एक अपशिष्ट बोतल में आदेश में सूखी फिल्टर से particulates को खत्म करने के लिए, और बफर के शेष एक साफ, बाँझ बोतल है कि अच्छी तरह से धोया गया है के साथ पानी में फ़िल्टर किया गया है और में प्रवेश करने से धूल को रोकने के लिए छाया हुआ ।
  2. एक पीएच और आयनिक शक्ति (जैसे, पीएच = 8, ५० मिमी nacl) के लिए एक bsa नमूना है कि कमजोर पड़ने, ultraफ़िल्ट्रेशन, या बफर विनिमय प्रक्रियाओं के दौरान ईओण कॉलम के लिए बाध्य करने की अनुमति समायोजित करें ।
    नोट: यह छोटी ताकना आकार है कि ब्याज की सामग्री (0.02 – 0.1 μm) को दूर नहीं करता करने के लिए प्रोटीन नमूने prefilter करने के लिए सिफारिश की है । वैकल्पिक रूप से, नमूना उच्च गति (13000-16000 x g) में 10 मिनट के लिए बड़े कणों की वर्षा को सक्षम करने के लिए केन्द्रापसारित किया जा सकता है ।
  3. एक अच्छी गुणवत्ता वाली मलों के विश्लेषण को प्राप्त करने के लिए एक 1 मिलीलीटर कॉलम (5/50 मिमी) में सुई लगाने के लिए ( सामग्री की मेजदेखें)-bsa के कम-से-0.5 मिलीग्राम की तैयारी करें । ध्यान दें कि इंजेक्शन की मात्रा असीमित है ।

3. एक प्रोटीन के लिए एक IEX विधि का चुनाव और विकास

  1. प्राथमिक अनुक्रम के आधार पर प्रोटीन के समविभव बिंदु (pI) की गणना, जिसके लिए expasy वेबसाइट पर protparam उपकरण के रूप में सर्वर15इस्तेमाल किया जा सकता है । ध्यान दें कि BSA की pI ५.८ है ।
  2. स्तंभ प्रकार और बफ़र पैरामीटर्स का चयन करें ।
    1. का उपयोग करें अलग बफ़र्स aiex और ciex, के आधार पर पीकेa बफ़र और बफ़र की ईओण प्रकृति के । जब छोटे counterions के साथ ciex स्तंभ चलाते समय aiex स्तंभ और ऋणायनी बफ़र्स चल रहे धनायनी बफ़र्स का उपयोग करें । इस उदाहरण में, एक AIEX स्तंभ पर BSA के विश्लेषण के लिए 20 मिमी Tris-HCl बफ़र, pH 8, का उपयोग करें ।
    2. एक प्रोटीन के लिए 7 से कम pI, जैसे BSA, के साथ एक AIEX कॉलम और बफर के साथ एक पीएच से कम दो इकाइयों द्वारा पीआई से अधिक का उपयोग करें । एक प्रोटीन के लिए एक pI के साथ अधिक से अधिक 7, एक CIEX कॉलम और बफर के साथ एक पीएच से कम दो इकाइयों द्वारा प्रोटीन पीआई का उपयोग करें ।
    3. प्रोटीन और कॉलम मैट्रिक्स के बीच बाध्यकारी की शक्ति के अनुसार बफर पीएच ऑप्टिमाइज़ करें । यदि कोई प्रोटीन कॉलम में अच्छी तरह से बाइंड नहीं करता है, तो pI से दूर एक pH का उपयोग करें । सुनिश्चित करें कि प्रोटीन इस्तेमाल किया पीएच पर स्थिर है ।
    4. बाइंडिंग में कम नमक एकाग्रता का उपयोग करें और बफ़र्स को प्रोटीन के बंधन को बांधने की अनुमति दें, क्योंकि प्रोटीन बाइंडिंग लोड किए गए नमूने की आयनिक क्षमता पर निर्भर करता है । प्रोटीन आमतौर पर उनकी स्थिरता के लिए कुछ नमक की आवश्यकता होती है; इसलिए प्रोटीन-लोडिंग और कॉलम-वाशिंग स्टेप के दौरान ५० एमएम NaCl (या वैकल्पिक नमक) का इस्तेमाल करें ।
    5. रेफरेंस बफर के लिए, स्तंभ से प्रोटीन अलग करने के लिए ०.५ मीटर nacl की एक अधिकतम का उपयोग करें ।
      नोट: उच्च नमक सांद्रता की सिफारिश नहीं कर रहे हैं जब मानक के साथ काम कर रहे हैं-मॉडल री रिफ्रैक्टमीटर साधन की सीमा सीमा के कारण. हालांकि, एक उच्च एकाग्रता मॉडल इस्तेमाल किया जा सकता है और 2 एम NaCl समायोजित करेगा ।
  3. एक प्रारंभिक विधि निम्नानुसार निष्पादित करें ।
    1. लोड 1 बीएसए के मिलीग्राम (१७० μL की 6 मिलीग्राम/एमएल) में ~ ०.५ मिलीलीटर 20 मिमी Tris-HCl बफर, पीएच 8, युक्त ५० मिमी NaCl की एक लोडिंग बफर की । एक 10-15 कॉलम वॉल्यूम (CV) के लिए एक ही बफर के साथ कॉलम धो प्रकाश बिखरने (एलएस), यूवी, और आरआई संकेतों को पूरी तरह से स्थिर हैं जब तक असीम अणुओं और सिस्टम से कणों की पूरी रेफरेंस की अनुमति देने के लिए ।
    2. 20-30 CV की एक छोटी, रैखिक नमक ढाल प्रदर्शन, 2 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 8 के रेफरेंस बफर का उपयोग करते हुए, कॉलम से प्रोटीन को अलग करने के लिए ०.५ मीटर NaCl युक्त । 0% की एक ढाल प्रदर्शन-100% (या रेफरेंस बफर के वैकल्पिक व्यापक ढाल) या यह दो gradients के लिए विभाजित: 0%-वेफरेंस बफर के 50% के एक अतिरिक्त ढाल के बाद बफर का 50%-वेफरेंस बफ़र के 100%, प्रत्येक ढाल के लिए 10 – 20 CV. BSA के लिए, 15% की एक व्यापक ढाल-30 CV के लिए 70% प्रारंभिक विधि के लिए उपयोग करें ।
      नोट: कुछ परिस्थितियों में, प्रारंभिक विधि एक विश्वसनीय मलों विश्लेषण के लिए पृथक्करण प्रदान कर सकते हैं, और अतिरिक्त रन आवश्यक नहीं हैं । कई मामलों में, प्रारंभिक विधि केवल मार्गदर्शन के लिए आगे विधि ऑप्टिमाइज़ेशन प्रदान करता है ।
  4. संकल्प को बढ़ाने और विभिन्न मापदंडों को बदलकर पीक जुदाई में सुधार करने के लिए IEX विधि का अनुकूलन.
    1. ग्रैडिएंट प्रवणता और लंबाई परिवर्तित करें । उच्च ढलान के साथ लघु gradients कम जुदाई के साथ तीव्र चोटियों प्रदान करते हैं, जबकि हल्के ढलानों के साथ लंबे gradients बेहतर जुदाई के साथ कम चोटियों प्रदान करते हैं । इष्टतम मलों के विश्लेषण के लिए पीक रिज़ॉल्यूशन और सिग्नल तीव्रता के बीच संतुलन ढूंढें ।
      नोट: प्रोटीन की एक उच्च मात्रा लोड हो रहा है LS, यूवी, और आरआई संकेतों को बढ़ा सकते हैं, लेकिन संकल्प की कीमत पर ऐसा करता है ।
    2. Elution के लिए एक पदश: नमक एकाग्रता प्रोफ़ाइल का प्रयोग करें । याद रखें कि कदम और रैखिक ढाल का एक संयोजन सामांयतः प्रयोग किया जाता है ।
    3. पीक जुदाई में सुधार करने के लिए प्रवाह की दर में कमी.
      नोट: बहुत छोटे कणों के साथ matrixes के लिए, यह बहुत महत्वपूर्ण नहीं है ।
    4. नमूना में प्रोटीन आबादी के बीच आरोप भिन्नता को बढ़ाने के लिए बफर पीएच बदलें और उन वेरिएंट के बीच जुदाई में सुधार होगा । ध्यान दें कि प्रोटीन है कि ठीक से एक पीएच पर अलग नहीं कर रहे है एक अलग पीएच पर अलग किया जा सकता है ।
    5. IEX कॉलम से प्रोटीन अलग करने के लिए, एक पीएच ढाल, रैखिक या stepwise का प्रयोग करें । यदि आवश्यक हो तो दोनों पीएच और नमक एकाग्रता विविधताओं गठबंधन कि रेफरेंस gradients का उपयोग करें.
    6. मजबूत लवण जैसे कि MgCl2, या कमजोर लवण जैसे सोडियम एसीटेट का प्रयोग करें, संवेदनशीलता और संकल्प को बढाने के लिए16.
    7. जुदाई क्षमताओं में सुधार करने के लिए छोटे कणों के साथ अब IEX कॉलम या एक अलग कॉलम मैट्रिक्स का उपयोग करें.
    8. जुदाई का एक अलग पैटर्न प्रदान करने के लिए कॉलम (AIEX/CIEX) के प्रकार बदलें । ध्यान दें कि मजबूत, कमजोर, या संयुक्त (मिश्रित-मोड) के साथ matrixes भी उपलब्ध हैं और कुछ नमूनों के समाधान में सुधार कर सकते हैं ।
    9. एक अलग आपूर्तिकर्ता से एक ही संलग्नी है कि विभिंन मैट्रिक्स रेजिन से जुड़ा हुआ है के साथ एक स्तंभ का उपयोग करें । खुद राल, ligand के स्वतंत्र रूप से, प्रोटीन के साथ अलग तरीके से बातचीत और जुदाई प्रोफ़ाइल को प्रभावित कर सकते हैं ।
    10. Additives में प्रोटीन स्थिरता में सुधार और प्रोटीन एकत्रीकरण से बचने के लिए buffers में (अणुओं है कि समाधान में प्रोटीन को स्थिर) शामिल IEX प्रयोग में सुधार करने के लिए ।
      ध्यान दें: ऐसे संयोजकों के उदाहरण शर्करा, अल्कोहल, यूरिया, नोनिओनिक या जवित्ट्रीयोनिक डिटर्जेंट, और चाओट्रॉपिक और कोस्मोट्रॉपिक लवण17,18हैं ।

4. आईईईईएक्स-मलों प्रयोग

  1. खोलें New\Experiment में विधि से मलों सॉफ्टवेयर और प्रकाश कैटरिंग सिस्टम विधियों फ़ोल्डर से ऑनलाइन विधि का चयन करें । DLS मॉड्यूल उपलब्ध है, और DLS डेटा प्राप्त किया जा करने के लिए हैं, तो ऑनलाइन विधि से प्रकाश कैटररिंग\ qels सबफ़ोल्डर के साथ का चयन करें ।
  2. कॉन्फ़िगरेशन अनुभाग के अंतर्गत चलाएँ के पैरामीटर सेट करें ।
    1. प्रवाह की दर को जेनेरिक पंप अनुभाग में फ्लो दर FPLC (१.५ mL/min) में उपयोग करने के लिए सेट करें, और दर्ज करें या विलायक खंड के अंतर्गत बफ़र पैरामीटर की जांच करें ।
    2. प्रोटीन नाम (BSA), अपवर्तनांक वृद्धि (डीएन/डीसी, प्रोटीन के लिए मानक मूल्य ०.१८५ मिलीलीटर/ग्राम), यूवी विलोपन गुणांक २८० एनएम की तरंग दैर्ध्य (०.६६ ग्राम/एल-1· सेमी-1) में दर्ज करें, और प्रोटीन के नमूने की एकाग्रता (6 मिलीग्राम/एमएल) नमूना टैब इंटैक्टर अनुभाग के अंतर्गत । इंजेक्शन (१७० μL) के लिए नमूना मात्रा के रूप में अच्छी तरह से एक ही खंड के तहत डालें ।
    3. मूल संग्रह टैब में, प्रक्रिया अनुभाग के अंतर्गत, Autoinject पर चेकबॉक्स ट्रिगर का चयन करें और चलाने की अवधि सेट ताकि डेटा संग्रह के लिए कम से 5 मिनट के लिए जारी रखा जाएगा ढाल उसके बाद तक पहुंच गया है अंतिम मान ।
  3. FPLC सॉफ़्टवेयर में प्रयोग पैरामीटर सेट करें ।
    1. विधि संपादक टैब में एक नया प्रयोग बनाएं । प्रारंभिक प्रयोग नमक या पीएच की एक रेखीय ढाल होगा (चरण ३.३ देखें) । अनुकूलित विधि के लिए, एक अधिक विशिष्ट ढाल या एक पदश: कार्यक्रम के अनुसार प्रारंभिक विधि के दौरान रेफरेंस परिणाम बनाने के लिए (चरण ३.४ और चित्रा 1देखें). विधि में पल्स सिग्नल शामिल करें जो डेटा संग्रह में मलों सॉफ़्टवेयर ट्रिगर करेगा ।
    2. संबंधित buffers के साथ कॉलम और वाल्व धो: 20 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 8, ५० मिमी nacl के साथ धोने बफर (एक वाल्व) और एक ही बफर के लिए ५०० mm nacl के साथ रेफरेंस बफर (बी वाल्व) । सुनिश्चित करें कि अंतिम स्तंभ धोने बाइंडिंग बफ़र का उपयोग करता है, एक कम नमक एकाग्रता युक्त, स्तंभ मैट्रिक्स के लिए प्रोटीन की बाइंडिंग सक्षम करने के लिए । दृढ़ता से बंधे अशुद्धियों के एक बड़े पैमाने पर धोने के लिए, एक बेअसर बफर धोने के बाद प्रासंगिक बफ़र्स के साथ धोने से पहले ०.५ मीटर NaOH का उपयोग करें ।
    3. एक सिरिंज का उपयोग लूप में प्रोटीन नमूना प्लेस । यदि नमूने के 10 मिलीलीटर से अधिक लोड है, फिल्टर पंप और FPLC के मिक्सर को दरकिनार करते हुए एक superloop या FPLC साधन के पंप वाल्व का उपयोग करें ।
  4. भागो बटन पर क्लिक करें और फिर FPLC सॉफ्टवेयर में मलों सॉफ्टवेयर में पहले प्रयोग शुरू करते हैं । डेटा मलों डिटेक्टर के माध्यम से FPLC साधन से पल्स सिग्नल प्राप्त करने के बाद एकत्र किया जाएगा.
  5. यदि IEX-मलों मैन्युअल रूप से एक स्टैंड-अलोन विधि के बजाय एक निरंतर प्रवाह मोड के साथ किया जाता है, तो चरण 4.1 – 4.4 में वर्णित चलाएँ और निर्देशों के समान पैरामीटर लागू करें ।
  6. एक बार अंतिम विधि सत्यापित किया गया है और चलाने के लिए, एक रिक्त इंजेक्शन का उपयोग कर बिल्कुल एक ही विधि प्रदर्शन (बफ़र के बजाय नमूना लोड हो रहा है) । यह महत्वपूर्ण है कि autoinject पल्स और रिक्त रन के ग्रैडिएंट के बीच समय नमूना रन के समान है ।

5. आईईएक्स-मलों के प्रयोगात्मक डाटा का विश्लेषण

  1. विश्लेषण चरण से चरण में प्रक्रिया खंड में मलों सॉफ़्टवेयर निष्पादित करें । मूल संग्रह दृश्य प्रयोग का कच्चा डेटा संग्रह प्रदर्शित करता है ।
    1. वे शोर का एक बहुत प्रदर्शन अगर chromatograms चिकनी करने के लिए Despiking टैब का प्रयोग करें. आम तौर पर, सामांय स्तर का उपयोग करें ।
    2. आधारभूत दृश्य में सभी संकेतों (सभी LS, UV, और RI डिटेक्टरों) के लिए आधार रेखा निर्धारित करें ।
    3. चोटियों को देखने के लिए विश्लेषण के लिए चोटियों को परिभाषित करें । Dn/dc के सही मान और प्रत्येक पीक के अंतर्गत प्रोटीन के लिए यूवी विलुप्त गुणांक की जांच करें ।
      नोट: प्रोटीन के लिए, यह ०.१८५ मिलीलीटर/जी के एक मानक आरआई वृद्धि मूल्य का उपयोग करने के लिए आम है, लेकिन अन्य macromolecules के लिए, विभिन्न डीएन/डीसी मूल्यों, अणु की प्रकृति के अनुसार इस्तेमाल किया जाना चाहिए । पॉलीन्यूक्लियोटिड्स (डीएनए/आरएनए) का औसत डीएन/डीसी ०.१७ एमएल/जी19है, जबकि सैकेराइड, जैसे सुक्रोज का औसत डीएन/डीसी मूल्य ०.१४५ एमएल/जी20 तथा लिपिड और डिटर्जेंट के डीएन/डीसी मान 0.1 से 0.16 एमएल/जी21के बीच है ।
    4. मोलर द्रव्यमान और त्रिज्या का उपयोग फिटिंग मापदंडों और सहसंबंध कार्य के अंतर्गत मोलर मास &Amp; त्रिज्या से LS और Rh qels दृश्यों से विश्लेषण ।
  2. आईईएक्स-मलों के दौरान नमक एकाग्रता में वृद्धि के कारण आरआई सिग्नल में काफी परिवर्तन होता है । इसलिए, कि आरआई डेटा की आवश्यकता होती है जन गणना के लिए रिक्त इंजेक्शन से आधार रेखा संकेत घटाना ।
    1. प्रोटीन और रिक् त आईईएक्स-मलों दोनों प्रयोगों को खोलें । प्रोटीन प्रयोग नाम पर राइट-क्लिक करें, विधि लागूकरेंका चयन करें, और फ़ाइल संवाद से आधार रेखा घटाव फ़ोल्डर चुनें । मानक दाढ़ मास विश्लेषण के लिए विधि का सही प्रकार (जैसे, ऑनलाइन) का चयन करें । ध्यान दें कि प्रोटीन प्रयोग के लिए निर्धारित मापदंडों और सेटिंग्स को नई खोली विधि पर सहेजा जाएगा ।
    2. आधार रेखा घटाव दृश्य के अंतर्गत, रिक्त चलाएँ संकेतों को आयात करने के लिए रिक्त आयात करेंक्लिक करें । उपकरण के तहत ( रिक्त आयात करें बटन के बगल में), सभी डिटेक्टरों की जांच करने के लिए घटाना ।
    3. चोटियों को देखने में, dn/dc मान समायोजित (यदि आवश्यक हो) के कारण प्रोटीन पीक क्षेत्र में समाधान की चालकता के बाद से समाधान की आरआई12रन के दौरान बदल गया है ।
  3. BSA monomer के साथ IEX-मलों प्रणाली कैलिब्रेट ।
    नोट: आम तौर पर, iex-मलों प्रणाली आवधिक रूप से पीक संरेखण के लिए calibrated है, बैंड विस्तार, और ९० ° डिटेक्टर के लिए कोणीय डिटेक्टरों के सामान्यीकरण परिभ्रमण की त्रिज्या (आरजी) के साथ एक monoबिखरने प्रोटीन का उपयोग कर < 10 एनएम, जैसे कि BSA monomer । इस उदाहरण में, BSA अंशांकन अणु के रूप में दोनों कार्य करता है और खुद को मोलर मास विश्लेषण का विषय है ।
    1. प्रक्रियाएँ > कॉन्फ़िगरेशन दृश्य के अंतर्गत, चोटियों संरेखित करें ।
    2. सामांयीकरण दृश्य के अंतर्गत निष्पादित करें, Rg मान के रूप में ३.० nm दर्ज कर रहा है ।
    3. एक ही विंयास टैब में बैंड विस्तार के तहत, पीक चुनें और आरआई संकेत करने के लिए यूवी और रास संकेतों मैच, प्रदर्शन फ़िट बटन का उपयोग कर ।
  4. परिणामों का ग्राफ परिणाम फिटिंग दृश्य में दिखाया गया है । ग्राफ़ पर राइट-क्लिक करके, संपादित करेंका चयन करके और फिर उन्नत बटन पर क्लिक करके अक्ष स्केल और अन्य ग्राफ़ पैरामीटर्स बदलें. अधिक प्रदर्शन विकल्पों के साथ एक ग्राफ आंकड़ा भी Easi ग्राफ टैब में उपलब्ध है: खिड़की के शीर्ष पर प्रदर्शन ड्रॉप-डाउन मेनू से मोलर मास का चयन करें.
  5. ध्यान दें कि सभी परिणाम, जिसमें मोलर द्रव्यमान, त्रिज्या, शुद्धता का स्तर और अन्य शामिल हैं, परिणाम अनुभाग के अंतर्गत रिपोर्ट दृश्य (सारांश या विस्तृत) में उपलब्ध हैं. रिपोर्ट के लिए अधिक परिणाम या पैरामीटर्स, और साथ ही आंकड़े जोड़ने के लिए रिपोर्ट डिज़ाइनर बटन का उपयोग करें ।

Representative Results

BSA एक आम प्रोटीन है जो प्रयोगात्मक प्रणाली22 के अंशांकन के लिए क्रोमेटोग्राफी में प्रयोग किया जाता है और iex-मलों, साथ ही साथ सेकंड-मलों के अभ्यास के लिए अत्यधिक उपयुक्त है । यह मुख्य रूप से एकलक ६६.७ केडीए के एक सैद्धांतिक एकलक द्रव्यमान के साथ है और आमतौर पर dimers और उच्च oligomers की एक छोटी संख्या23शामिल हैं ।

Bsa iex-एक ऋणायन एक्सचेंज विश्लेषणात्मक कॉलम ( सामग्री की मेजदेखें) का उपयोग कर मलों पर विश्लेषण किया गया । ७५ मिमी से ३५० मिमी nacl तक के 30 CV से मिलकर बना एक विस्तृत रैखिक ढाल उच्च oligomers से bsa मोनोमर अलग । डाउनस्ट्रीम मलों के विश्लेषण के परिणामस्वरूप एक परिकलित मोनोमर मोलर मास में ६६.८ ± ०.७ केडीए और १३० ± 5 केडीए के एक परिकलित डिमर मोलर मास में (चित्रा 1ए) ।

Eluted चोटियों पर बफर चालकता के आधार पर, ढाल एक अलग कार्यक्रम के लिए बदल गया था: १७५ मिमी NaCl का एक लंबा कदम १७५ मिमी से ५०० मिमी NaCl के लिए एक रैखिक ढाल के बाद. नई ढाल बहुत संकल्प और bsa एकलक के बीच उत्कृष्ट जुदाई में सुधार (६६.१ ± ०.७ केडीए की एक परिकलित मोलर द्रव्यमान के साथ) और उसके उच्च oligomeric प्रजातियों (१३२ ± 2 केडीए की एक गणना औसत द्रव्यमान के साथ) (चित्रा 1बी) । आदेश में भी उच्च oligomeric प्रजातियों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए और bsa के प्रत्येक व्यक्ति oligomeric फार्म के दाढ़ जनता की गणना करने के लिए, २०० मिमी और २५० mm nacl के एक पदश: कार्यक्रम लागू किया गया था । इस प्रयोग के परिणामस्वरूप bsa एकलक के बीच एक उत्कृष्ट जुदाई (६२.४ ± ०.४ केडीए की एक गणना द्रव्यमान के साथ), द्वितय (१३० ± 10 केडीए की एक गणना द्रव्यमान के साथ), और त्रितयाणु (१७० ± 10 केडीए की एक गणना द्रव्यमान के साथ) (चित्रा 1सी) । सभी iex-मलों प्रयोगों से पता चलता है कि bsa elutes ज्यादातर ८०% की शुद्धता के साथ एक एकलक के रूप में, सेक के साथ समझौते में-जहां bsa एकलक ८५%12की शुद्धता के साथ elutes परिणाम ।

Figure 1
चित्रा 1 : BSA के लिए IEX-मलों प्रयोग का अनुकूलन । (क) 75-350 एमएम एनएसीएल के ग्रैडिएंट कार्यक्रम के साथ बीएसए का आईईएक्स-मलों का प्रयोग । (ख) १७५ मिमी nacl चरण के एक कार्यक्रम के साथ bsa के iex-मलों प्रयोग 175-500 मिमी nacl के एक रैखिक ढाल कार्यक्रम के बाद । (ग) २०० मिमी और २५० मिमी nacl के एक कदम कार्यक्रम के साथ bsa का iex-मलों प्रयोग । Chromatograms २८० एनएम (नीला) पर यूवी प्रदर्शन, एक ९० ° कोण पर प्रकाश बिखरने (लाल), और अपवर्तक सूचकांक (गुलाबी) और चालकता (ग्रे) वक्र प्रत्येक शिखर के मोलर द्रव्यमान के साथ एक साथ मलों द्वारा परिकलित (काला). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

Iex-मलों प्रोटीन जुदाई और लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली तरीका है कि शुद्ध मोलर द्रव्यमान का दृढ़ संकल्प के रूप में अच्छी तरह के रूप में विषम नमूनों की अनुमति देता है, देशी oligomers, गैर देशी समुच्चय, सहसंयोजक और noncovalent विशेषता परिसरों, और संयुग्मित प्रोटीन । एक रेखीय ढाल या नमक एकाग्रता चरणों की एक श्रृंखला से मिलकर एक कार्यक्रम प्रोटीन की आबादी का एक अच्छा जुदाई को प्राप्त करने और मलों द्वारा प्रत्येक व्यक्ति चोटी के उचित विश्लेषण की अनुमति कर सकते हैं । इसके अलावा अनुकूलन विभिन्न मापदंडों, जैसे ग्रेडिएंट ढलान (चरण ३.४ प्रोटोकॉल के देखें) द्वारा, एक बेहतर समाधान की आवश्यकता है, तो किया जा सकता है । IEX-मलों एक मूल्यवान प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण परख हो सकता है के बाद से यह प्रोटीन लक्षण वर्णन के एक अतिरिक्त, महत्वपूर्ण स्तर प्रदान करता है, ऐसे सेकंड के रूप में अंय विधियों के पूरक-मलों ।

जबकि सेकंड-मलों प्रोटीन दाढ़ जन संकल्प के लिए एक मानक और आम तकनीक है, मानक विश्लेषणात्मक सेकंड कॉलम के अपेक्षाकृत कम संकल्प सटीक दाढ़ मास माप की सीमा हो सकता है12मलों द्वारा प्राप्त किया । SEC-मलों की सीमाओं के कुछ उदाहरणों में ऐसे समाधानों को शामिल किया गया है जिनमें क्रमिक रूप से oligomers, एकत्रीकरण के उच्च स्तर जो मोनोमर पीक से पूरी तरह अलग नहीं हैं, और समान मोलर द्रव्यमान वाली विषम जनसंख्या, जैसे संशोधित प्रोटीन.

Iex एक और अधिक जटिल क्रोमैटोग्राफी विधि के लिए डिजाइन और सेक से बाहर ले जाता है, लेकिन एक iex-मलों प्रयोग से प्राप्त जानकारी पूरक कर सकते है और कभी भी अधिक सेकंड से जानकारीपूर्ण-मलों विश्लेषण हो सकता है । Iex-मलों सफलतापूर्वक एंटीबॉडी वेरिएंट है कि एक ही मोलर मास, oligomers है कि पूरी तरह से सेकंड पर अलग नहीं कर रहे हैं, और छोटे पेप्टाइड्स कि धारा12,24द्वारा विश्लेषण करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं का हिस्सा विशेषता है । इसके अलावा, macromolecular विधानसभाओं कि भी सेकंड से अलग होने के लिए बड़े हैं, जैसे पूर्ण (वायरल डीएनए युक्त) और adeno के खाली कणों से जुड़े वायरस (AAV), IEX द्वारा हल किया जा सकता है25 से पहले मलों विश्लेषण. एसईसी की तुलना में, आईईएक्स अधिक विविध पृथक्करण क्षमताएं प्रदान करता है और इसमें कई मापदंडों को समायोजित करने का लचीलापन होता है, जैसे बफर पीएच, नमक के प्रकार, कॉलम की लंबाई और अन्य । सेकंड के विपरीत, वहां IEX में नमूना इंजेक्शन के लिए कोई मात्रा सीमा है, और किसी भी अणु अपने आकार के स्वतंत्र विश्लेषण किया जा सकता है (Amartely एट अल.12में तालिका 1 देखें) । यह IEX-मलों का एक बड़ा लाभ है, मुख्य रूप से एक कम रास तीव्रता के साथ नमूनों के लिए, जैसे बहुत छोटे प्रोटीन या पतला प्रोटीन एकाग्रता पर एकत्रीकरण के लिए एक प्रवृत्ति के साथ. चूंकि विश्लेषणात्मक iex कॉलम और अधिक स्थिर है और सेकंड कॉलम से कम कणों जारी करते हैं, iex-मलों बहुत कम साम्यन समय की आवश्यकता है, और रास सिग्नल बहुत तेजी से स्थिर हैं । यह इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में व्यक्तिगत प्रयोगों के चलने और आवश्यक के रूप में चलाने की रोक की अनुमति देता है ।

सेकंड के विपरीत, जो आम तौर पर केवल एक ही प्रयोग के साथ ठीक परिणाम प्रदान करता है (सही प्रभाजन रेंज के साथ एक स्तंभ का उपयोग), iex कई प्रयोगों के लिए विधि पैरामीटर ट्यूनिंग द्वारा इष्टतम संकल्प प्राप्त करने की आवश्यकता हो सकती है । आईईएक्स-मलों में प्रयोग किया जाता है कि एक नमक ढाल के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं, बफर चालकता और, इस प्रकार, RI नाटकीय रूप से चलाने के दौरान परिवर्तन, आरआई संकेत के परिणामस्वरूप परिवर्तन के साथ. यह प्रत्येक IEX-मलों प्रयोग के लिए एक अतिरिक्त रिक्त रन की आवश्यकता है और आधार रेखा घटाव के साथ एक विश्लेषण (के रूप में प्रोटोकॉल के चरण ५.२ में वर्णित) जब तक एकाग्रता विश्लेषण यूवी का पता लगाने के लिए सीमित है (विलुप्त होने के एक प्राथमिकताओं ज्ञान की आवश्यकता प्रत्येक चोटी के लिए गुणांक) । आधार रेखा घटाव के साथ विश्लेषण रैखिक gradients के लिए मजबूत है, भले ही विधि के आगे विकास अभी भी नमक पदश: कार्यक्रमों के सफल आधारभूत घटाव के लिए आवश्यक है । प्रत्येक चोटी के dn/dc मान eluted चोटी पर विशिष्ट बफर चालकता के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए (गणना में पाया जा सकता है साहित्य12) । यदि एक प्रोटीन एक NaCl एकाग्रता से कम २०० मिमी (BSA उदाहरण में की तरह) पर eluted, यह समायोजन नगण्य है ।

आईईईईएक्स-मलों में प्रयुक्त प्रोटीन की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा (जैसा कि प्रोटोकॉल के चरण २.३ में विस्तृत है) सेकंड-मलों की तुलना में नमक प्रवणता और आरआई के अपूर्ण मिश्रण के कारण होने वाले उतार चढ़ाव की वजह से री सिग्नल के नाटकीय परिवर्तन को दूर करना महत्वपूर्ण है ग्रैडिएंट बफ़र्स । यदि केवल यूवी का पता लगाने बड़े पैमाने पर माप के लिए प्रयोग किया जाता है, छोटी मात्रा में इस्तेमाल किया जा सकता है । इंजेक्शन प्रोटीन की मात्रा प्रोटीन, एकरूपता, शुद्धता, और यूवी विलोपन गुणांक के मोलर द्रव्यमान पर निर्भर करता है । आवश्यक इंजेक्शन बड़े पैमाने पर छोटे प्रोटीन के लिए अधिक होना चाहिए और बड़ा प्रोटीन के लिए कम (~ 1 एक 20 केडीए प्रोटीन के लिए मिलीग्राम और ~ ०.२ एक १५० केडीए प्रोटीन के लिए मिलीग्राम). विषम नमूनों की मात्रा कई आबादी के बीच विभाजित है के बाद से अधिक नमूने के इंजेक्शन की आवश्यकता होती है । विश्लेषणात्मक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) एक FPLC प्रणाली से कम सामग्री की आवश्यकता हो सकती है ।

हाल ही में, में लाइन विश्लेषण शुद्धिकरण प्रक्रियाओं के दौरान मलों का उपयोग कर रिपोर्ट किया गया है । इस तरह के एक वास्तविक समय विश्लेषण एकत्रीकरण उत्पादों है कि शुद्धिकरण के दौरान होने का पता लगाने के लिए बहुत कुशल है और26शुद्धि के बाद प्रोटीन के किसी भी आगे विश्लेषण की आवश्यकता को समाप्त कर सकते हैं । Iex क्रोमैटोग्राफी अक्सर एक मध्यवर्ती शुद्धि कदम के रूप में प्रयोग किया जाता है; इस प्रकार, मलों के साथ preparative IEX कॉलम के संयोजन न केवल एक विश्लेषणात्मक लक्षण वर्णन विधि के रूप में उपयोगी हो सकता है, लेकिन यह भी बड़े पैमाने पर शोधन प्रक्रियाओं के एक वास्तविक समय विश्लेषण के रूप में । Nonanalytical IEX कॉलम भी स्थिर कण के साथ एक कम डिग्री जारी कर रहे हैं, और इसलिए, मलों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । अंय जुदाई तकनीकों, जैसे संबध क्रोमैटोग्राफी या जलविरागी विनिमय क्रोटोग्राफी, भी जब अपेक्षाकृत शुद्ध नमूनों के अधीन मलों के साथ संयुक्त किया जा सकता है (मलों और आरआई डिटेक्टरों के संदूषण से बचने के लिए) । यह अनुकूलन और विधि के अनुकूलन के लिए न केवल अच्छा पीक जुदाई लेकिन यह भी पर्याप्त रूप से साफ रास और आरआई एक सफल मलों के विश्लेषण के लिए संकेतों को प्राप्त करने की आवश्यकता होगी ।

Disclosures

डी एस Wyatt प्रौद्योगिकी निगम, जिसके उत्पादों इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है के एक कर्मचारी है । एटी Danyel बायोटेक, Wyatt और ÄKTA उपकरणों के एक वितरक के एक कर्मचारी है ।

Acknowledgments

लेखक उसकी सलाह और सहयोग के लिए डॉ Tsafi डैनियल (Wolfson सेंटर फॉर एप्लाइड स्ट्रक्चरल बायोलॉजी, हिब्रू विश्वविद्यालय) का शुक्रिया अदा करते हैं । लेखकों की सहायता और विश्लेषणात्मक FPLC-मलों इस अध्ययन में उपयोग प्रणाली की स्थापना के लिए Danyel बायोटेक लिमिटेड (Rehovot, इसराइल) भी धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ÄKTA pure GE Healthcare 29-0182-26 FPLC 
0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm GE Healthcare 6809-1002 Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm GE Healthcare 6809-1012 Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm GE Healthcare 6809-2012 Mobile phase filter
BSA (purity >97%) Sigma  A1900 Bovine serum albumin
miniDAWN TREOS  Wyatt Technology WTREOS MALS
mono Q HR 5/50 GL GE Healthcare 17-5166-01 Anion exchange analytical column
Optilab T-rEX Wyatt Technology WTREX Refractometer
0.1 mm PES 1000 mL Stericup Millipore SCVPU11RE Mobile phase filter
Sodium chloride Sigma  71382 HPLC grade NaCl
TRISMA base Sigma  T-1503 TRIS buffer

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References

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जैव रसायन अंक १४६ आयन एक्सचेंज (IEX) बहु कोण प्रकाश बिखरने (मलों) क्रोमेटोग्राफी प्रोटीन जुदाई आणविक वजन गोजातीय सीरम एल्ब्युमियन (BSA) oligomers गुणवत्ता नियंत्रण
आयन एक्सचेंज क्रोटोग्राफी (आईईईईएक्स) में प्रोटीन पृथक्करण और विशेषीकरण के लिए मल्टी-एंगल लाइट कैटरिंग (मलों) को युग्मित
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Amartely, H., Some, D., Tsadok, A., Lebendiker, M. Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization. J. Vis. Exp. (146), e59408, doi:10.3791/59408 (2019).

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