Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Protein ayrımı ve karakterizasyonu için birden fazla açıyla ışık saçılma (MALS) birleştiğinde iyon Kromatografi (IEX)

Published: April 5, 2019 doi: 10.3791/59408
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Alexander Silberman Institute of Life Science, The Hebrew University of Jerusalem, 2Wyatt Technology Corporation, 3Danyel Biotech Ltd

Summary

Bu iletişim kuralı bir doğru molar kütle tespiti için protein, protein kompleksleri ve peptidler türdeş olmayan bir örnek yüksek özgüllük iyon değiştirme Kromatografi çok açılı ışık saçılma ile kullanımını açıklar. Bu yöntem kalite değerlendirmesi için de yerli reaksiyonlar, ücret türevleri ve karışık-protein örnekleri karakterizasyonu gelince değerlidir.

Abstract

İyon değiştirme Kromatografi çok açılı ışık saçılma (IEX-MALS) ile protein ayrımı ve karakterizasyonu için güçlü bir yöntemdir. Türdeş olmayan protein örnekleri oligomeric formların veya protein nüfus, karışımları ile bile çok da dahil olmak üzere, karakterizasyonu IEX doğru molar kütle analiz MALS tarafından elde sağlar yüksek özgüllük ayırma tekniği kombinasyonu benzer molar kitleler. Bu nedenle, IEX-MALS protein karakterizasyonu ek bir düzeyi sağlar ve çok açılı ışık saçılma (sn-MALS) tekniği ile standart boyut-dışlama Kromatografi için tamamlayıcı olur.

Burada bir temel IEX MALS deneme ve sığır serum albumin (BSA) bu yöntemi göstermek için bir protokol açıklayın. IEX molar kütle analiz MALS her bireysel form tarafından izin oligomeric formları için BSA ayıran. IEX-MALS deney duruma getirilmesi de sunulan ve BSA, BSA monomerler ve daha büyük reaksiyonlar arasında mükemmel ayrılık elde üzerinde gösterdi. İyi ayırma ve molar kütle belirlenmesi bir örnek var birden fazla protein türlerin sağladığı IEX-MALS protein kalite değerlendirmesi için değerli bir tekniktir.

Introduction

Nicel protein ürünleri kalite kontrol (QC), aracı olarak giderek temel karakterizasyonudur biyofarmasotik sanayi ve güvenilirlik ve hayat bilgisi bütünlüğünü garanti altına almak için yasal amaçlar için her ikisi de1 araştırma , 2. protein Web sitelerinde açıklandığı gibi Avrupa'nın biyofiziksel araştırma ve moleküler biyofizik (ARBRE-MOBIEU) Avrupa'da Protein üretimi ve arıtma ortaklık Avrupa (P4EU) ve kaynakları Derneği iletişim (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs ve https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, sırasıyla), protein QC sadece nihai ürün, ama aynı zamanda oligomeric durumuna, Homojenizasyon, kimlik, saflık karakterize gerekir biçimi, yapısı, ardından değişiklikleri ve diğer özellikleri3,4.

SN-MALS en yaygın QC karakterizasyonu yöntemlerinden biridir. Bu yöntemde, analitik bir sn sütun MALS ve spektrofotometrik ve refractometric dedektörleri, her tepe5protein molar kütlesi doğru ölçümler etkinleştirme için birleştirilmiştir. SN-MALS elüsyon birimin bağımsız olarak eluted doruklarına molar kütle belirler ve sütun ayarı'nı kullanarak analitik sn yanlışlık üstesinden gelir. Dinamik bir ışık saçılım (DL) modül ilavesi hidrodinamik RADIUS belirlenmesi sağlayan boyutu ölçüm yeteneği ekler. Akademik araştırma, sn-MALS genellikle bir protein, onun uyum, saflık, toplama ve modifiye proteinleri glikoproteinlerin veya lipid çözündürüldükten membran proteinlerinin gibi düzey düzeyini oligomeric durumunu belirlemek için kullanılır (belirlemek protein molar kütle ve bileşenleri tek tek eşlenik)6,7,8.

Birçok durumda, bir arıtma sürecinin son protein iyi tanımlanmış moleküler türler değildir ama oldukça bazı heterojenite oluşmaktadır. Böyle bir karışımı protein yapısı (örneğin, farklı oligomeric formlar), biçimler veya protein izoformlarının açısından farklı olabilir. Protein heterojenite Ayrıca C-terminal lizin işleme veya asparagine/glutamin Deaminasyon, varyasyon9,10şarj etmek için önde gelen neden küçük kimyasal farklılıkları bir sonucu olabilir. Glikozilasyon gibi ardından değişiklikleri farklılıkları da şarj varyasyonları9türdeş olmayan örnekleri yol açabilir. Heterojenite farklı bu tür protein biyofiziksel özellikleri yansıtılır ve istikrar ve biyolojik Etkinlik hedef protein11etkileyebilir.

Güvenilir kalite kontrol deneyleri türdeş olmayan bu tür örneklerin çok resolutive analitik ayırma tekniği gerektirir. Nerede iyi ayrılık nedeniyle kusurlu sn-MALS analizine yol onların sınırlı çözünürlük ve renk ayrımı yetenekleri12, analitik sn sütunlarla ulaşmak için meydan okunabilir durumlar vardır. Bir yüksek-özgüllük ayırma tekniği gibi IEX MALS ile birleştirerek sn-MALS sınırlamayı heterojen örneklerinde aşmak ve protein karakterizasyonu (tablo 1 Amartely vd.12') için tamamlayıcı bir yöntem sağlayın. Oluştururlar onların hidrodinamik boyutu13tarafından ayıran, sn IEX onların yüzey ücret14tarafından oluştururlar ayırır. Anyon exchange (AIEX) ve katyon değişim (CIEX) matrisleri bağlama çeşitleri, sırasıyla olumsuz ve olumlu ücret. Bir nispeten yakın kitle veya şekil paylaşmak protein nüfus arasında iyi bir ayrım ile IEX-MALS başarıyla bireysel protein eyaletlerinde bir karışımı örnek12molar kütlesi belirler.

Burada bir IEX-MALS deney ayırma ve çözümleme var BSA oligomeric formları aynı örnek çalıştırmak için standart bir protokol mevcut. Bir IEX sütun belirli bir protein için önemli ve çok tartışılan, seçimdir arabellekleri pH ve iletkenlik koşullarının yanı sıra. IEX-MALS deneysel verilerin analizi de Adım adım açıklanmıştır. BSA reaksiyonlar ayrılması iyi ve sn-MALS yeterli olsa da, BSA IEX-MALS yetenekleri göstermek için ve bir deney optimizasyonu göstermek için iyi bir örnek olduğunu. Zavallı ayrılık elde sn-MALS ve uygun ayırma ve IEX-MALS tarafından etkin analiz örnekleri bir önceki çalışmada12içinde ele alınmıştır.

Protocol

1. sistemin hazırlanması

  1. Hızlı protein sıvı Kromatografi (FPLC) sistemi ve MALS/Kırılma Endeksi (RI) dedektörleri ( Tablo malzemelerigörmek) denetimi, veri toplama ve analiz üreticileri başına onların ilgili yazılım paketleri ile birlikte yükleyin talimatları.
  2. MALS ve RI dedektörleri aşağı FPLC'ın UV ve iletkenlik dedektörleri ile bağlayın. İnterdetector birimin UV ve MALS dedektörleri arasında en aza indirmek için pH degradeler için kesinlikle gerekli olmadıkça pH dedektörü atlamak. Kılcal Boru 0,25-0,5 kullanmak mm iç çap (kimlik) sütun ve dedektörleri ve 0,75 mm kimlik Kılcal Boru RI bulmak-e doğru israf veya kesir toplayıcı çıktısı üzerinde arasında.
  3. FPLC ve dedektörleri arasında gerekli sinyal bağlantıları, FPLC dedektörü MALS Aux girişi için bir UV analog çıkış ve dijital çıkışı MALS Autoinject içinde g/ç Box ile'den FPLC de dahil olmak üzere kurulmuş olduğunu emin olun.

2. örnek ve arabellek hazırlanması

  1. Çamaşır ve elüsyon arabellekleri 0,1 µm filtresiyle dahil olmak üzere tüm reaktifler filtre. Arabellek ilk 50-100 mL kuru filtrelerden parçacıkları ortadan kaldırmak için bir atık şişe içine filtre ve iyice süzülmüş suyla yıkanmış ve toz girmesini önlemek için şapkalı bir temiz, steril şişe arabellek geri kalanı tutmak.
  2. BSA örnek bir pH ve iyonik gücü ayarlayın (örneğin, pH = 8, 50 mM NaCl) izin veren IEX sütun bağlama seyreltme, Ultrafiltrasyon veya arabellek değişimi işlemleri sırasında.
    Not: Bu malzeme ilgi kaldırmaz küçük gözenek boyutu için protein örnek prefilter için tavsiye edilir (0.02-0,1 µm). Alternatif olarak, örnek yüksek hızda (13.000 – 16,000 x g) yağış büyük parçacıkların etkinleştirmek 10 dk centrifuged.
  3. Hazırlamak en az 0.3-0.5 mg BSA (iyi kalite MALS analiz ulaşmak için 1 mL sütununda (5/50 mm) enjekte etmek için Malzemeler tablobkz:). Enjeksiyon hacmi sınırsız olduğunu unutmayın.

3. seçimi ve gelişimi bir protein için bir IEX yöntemi

  1. ExPASy Protparam aracı gibi hangi sunucuları için Web sitesi kullanılan15olabilir birincil sıralamasına dayanan protein isoelectric noktası (PI) hesaplamak. BSA pI 5,8 olduğuna dikkat edin.
  2. Sütun türü ve tampon parametreleri seçin.
    1. Farklı arabellekleri için AIEX ve CIEX, pKbir arabellek ve arabellek iyonik doğası bağlı olarak kullanın. Katyonik arabellekleri AIEX sütun ve Anyonik arabellekleri CIEX sütun ile küçük counterions çalıştırırken çalışırken kullanın. Örneğin, 20 mM Tris-HCl tampon, pH 8, BSA analizi bir AIEX sütun için kullanın.
    2. Bir PI 7, BSA gibi daha düşük bir proteini için pH pI en az iki ünite ile daha yüksek bir AIEX sütun ve tampon kullanın. 7'den daha yüksek bir pI ile bir protein, protein pI ile en az iki ünite daha düşük pH CIEX sütun ve tampon kullanın.
    3. Tampon pH protein ile sütun matris arasındaki gücünü göre en iyi duruma getirme. Bir protein de sütuna bağlamak değil, pI uzak bir pH kullanın. Protein kullanılan pH dengeli olduğundan emin olun.
    4. Düşük tuz konsantrasyonu bağlamasında kullanın ve protein bağlayıcı yüklü örnek iyonik gücüne bağlı olduğundan Matrix, proteinin bağlantısına izin için arabellekleri yıkayın. Proteinler genellikle onların istikrar için biraz tuz gerektirir; Bu nedenle, 50 mM NaCl (veya alternatif tuz) sırasında sütun yıkama ve protein-yükleme adımları kullanın.
    5. Elüsyon arabellek için en fazla 0.5 M NaCl protein sütundan ayırmak için kullanın.
      Not: Daha yüksek tuz konsantrasyonları enstrümanın menzil sınırlaması nedeniyle standart tip RI Refraktometre ile çalışırken önerilmez. Ancak, bir yüksek konsantrasyon modeli kullanılır ve 2 M NaCl karşılayacak.
  3. İlk yöntem aşağıdaki gibi yapın.
    1. 1 mg BSA yük (170 µL 6 mg/ml) 20 mM Tris-HCl tampon, pH 8, bir yükleme tampon ~0.5 mL 50 mM NaCl içeren. Sütun kadar ışık saçılma (LS), UV, ilişkisiz moleküller ve partikülleri sisteminden, elüsyon tam izin vermek bir 10-15 sütun birim (CV) için aynı arabellek ile yıkama ve RI sinyalleri tam stabilize.
    2. 20-30 CV, elüsyon tampon 20 mm Tris-HCl, pH 8 kullanarak, sütun protein ayırmak için 0.5 M NaCl içeren bir kısa, doğrusal tuz degrade uygulayın. Bir degrade elüsyon arabellek % 0-% 100 (veya alternatif yaygın degrade) gerçekleştirmek veya iki gradyanlar bölme: elüsyon arabelleği % 0-% 50, % 50-% 100 elüsyon arabelleği, her degrade 10-20 CV için ek bir degrade izledi. BSA için yaygın degrade %15-%70 30 için kullanmak için ilk yöntem CV.
      Not: bazı durumlarda, ilk yöntem ayrılması için güvenilir bir MALS analiz sağlayabilir ve ek çalışır gerekli değildir. Çoğu durumda, ilk yöntemi daha fazla yöntemi en iyi duruma getirme için yalnızca kılavuzunu sağlar.
  4. IEX yöntem çözünürlüğünü artırmak ve en yüksek ayırma farklı parametreleri değiştirerek geliştirmek için en iyi duruma getirme.
    1. Degrade eğim ve uzunluğu değiştirin. Uzun gradyanlar hafif yamaçları ile daha iyi ayırma ile daha düşük tepeler sağlarken yüksek yamaçları ile kısa degradeler yoğun zirveleri daha az ayırma ile sağlar. En iyi MALS analizi için en yüksek çözünürlük ve sinyal yoğunluğu arasındaki dengeyi bulmak.
      Not: daha yüksek bir miktar protein yükleme LS, UV, artırabilir ve RI sinyalleri ama yok öyle çözünürlük pahasına.
    2. Bir kademeli tuz konsantrasyonu profil elüsyon için kullanın. Adımlar ve doğrusal gradyan yaygın olarak kullanılan hatırlıyorum.
    3. En yüksek ayırma geliştirmek için akış oranını azaltmak.
      Not: konik vida dişi paftaları için çok küçük parçacıklar ile bu çok önemli değil.
    4. Örnekteki protein nüfus arasında ücret varyasyonu artırmak ve bu türevleri arasındaki mesafeyi geliştirmek için arabellek pH değiştirin. Düzgün bir pH ayrılmış değil proteinler farklı pH ayrılmış olabilir unutmayın.
    5. Degrade, doğrusal veya kademeli, pH proteinler IEX sütundan ayırmak için kullanın. PH ve tuz toplama varyasyon gerekirse birleştirmek elüsyon degradeler kullanın.
    6. MgCl2veya sodyum asetat gibi zayıf tuzları gibi daha güçlü tuzları duyarlılık ve çözünürlük16artırmak için kullanın.
    7. Uzun IEX sütun veya farklı sütun matris daha küçük partikülleri ile ayırma yeteneklerini geliştirmek için kullanın.
    8. Sütun (AIEX/CIEX) farklı bir desen ayrılık sağlamak için türünü değiştirin. Matrisleri güçlü, zayıf veya kombine (karma mod) ligandlar ile are da elde edilebilir ve bazı örnekler çözünürlüğü artırabilir unutmayın.
    9. Bir sütun farklı bir tedarikçiden farklı matris reçineler için bağlı olduğu aynı ligand ile kullanın. Bağımsız olarak ligand reçine kendisi, farklı proteinler ile etkileşim ve ayrılık profil etkiler.
    10. Katkı maddeleri (çözüm protein stabilize moleküller) protein istikrarı geliştirmek ve protein toplama, IEX deney geliştirmek için önlemek için arabellekleri içerir.
      Not: Bu tür katkı maddeleri örnekler şekerler, alkoller, üre, Nonyonik veya zwitterionic deterjanlar ve chaotropic ve kosmotropic tuzlar17,18.

4. IEX-MALS deney

  1. New\Experiment yönteminden MALS yazılımında açın ve çevrimiçi yöntem Işık saçılma sistem yöntemleri klasöründen seçin. DLS modülü mevcuttur ve DLS veri elde edilebilir için çevrimiçi yöntem Işık Scattering\With QELS alt klasörü seçin.
  2. Çalıştır parametrelerini yapılandırma bölümünde ayarlayın.
    1. Debi ölçümü Genel pompa kısmındaki FPLC (1,5 mL/dk), kullanılan akış hızı ayarlama ve girin veya Solvent bölümünün altında arabellek parametreleri doğrulayın.
    2. Protein adı (BSA), Kırılma indisi artışı girin (dn/dc; standart proteinler için değerdir 0.185 mL/g), UV yok olma katsayısı, dalga boyu 280 nm (0,66 g/M-1·cm-1) ve (6 mg/mL) protein örnekte konsantrasyonu örnek sekmesinin altında enjektör parça. Numune hacmi enjeksiyon (170 µL) de altında aynı parça için ekleyin.
    3. Yordam bölümünde, Temel koleksiyon sekmesinde Autoinject üzerinde tetikleyici onay kutusunu seçin ve degradenin ulaştığında veri toplama için en az 5 dk devam edilecektir çalışma süresi ayarlamak onun son değer.
  3. FPLC yazılım deneme parametrelerini ayarlamak.
    1. Yöntemi Düzenleyicisi sekmesinde yeni bir deneme oluşturun. İlk deneme tuz veya pH doğrusal bir degrade olacak (bkz. Adım 3.3). İçin en iyi duruma getirilmiş yöntemi, daha özel bir degrade veya elüsyon sonuçlarına göre kademeli bir program sırasında ilk yöntem oluşturun (bkz. Adım 3.4 ve şekil 1). Bir darbe sinyal MALS yazılım veri toplama tetikleyecek yöntemi ekleyin.
    2. Sütun ve vanalar ile ilgili tampon yıkama: 20 mM Tris-HCl, pH 8, çamaşır tampon (vanası) ve 500 mM NaCl elüsyon tampon belleğin (B Vana) ile aynı tampon için 50 mM NaCl ile. Son sütun yıkama düşük tuz konsantrasyonu içeren bağlama arabellek sütun matris için proteinin bağlamasını etkinleştirmek için kullanıldığından emin olun. Kuvvetle ilişkili yabancı maddelerin büyük yıkaması için 0.5 M NaOH ile ilgili tampon nötralizasyon arabellek yıkama tarafından takip, yıkama önce kullanın.
    3. Protein örnek bir Ģırınga kullanarak döngü içinde bir yer. Daha--dan 10 mL örnek yüklü ise, bir superloop veya FPLC enstrümanın pompa Vana filtre pompa ve FPLC Mikser atlayarak kullanın.
  4. Denemenin ilk MALS yazılımında Çalıştır düğmesini ve ardından FPLC yazılım tıklayarak başlayın. Veri yolu ile belgili tanımlık MALS bulmak FPLC aracından darbe sinyali aldıktan sonra toplanacaktır.
  5. Aynı parametreleri çalışma ve IEX MALS el ile iş akışı sürekli modu yerine tek başına bir yöntem ile gerçekleştirdiyseniz açıklanan adımları 4.1-4.4 yönergeleri uygulayın.
  6. Son yöntem doğrulanmadı ve çalıştırmak sonra tam olarak aynı yöntemi boş enjeksiyon (örnek yerine yükleme arabellek) kullanarak gerçekleştirin. Autoinject darbe ve boş çalışma degrade arasındaki zamanlama çalıştırmak örnek için özdeş olması önemlidir.

5. IEX-MALS deneysel veri analizi

  1. Adım adım yordam bölümünde çözümlemesi MALS yazılımında gerçekleştirin. Temel koleksiyon görünümü deney ham veri koleksiyonunu görüntüler.
    1. Eğer onlar bir sürü gürültü sergi chromatograms düzeltmek için Despiking sekmesini kullanın. Normalde, normal düzeyi kullanın.
    2. Tüm sinyaller için temel tanımlamak (tüm LS, UV ve RI dedektörleri) temel görünümünde.
    3. Analiz için tepeler tepeler görünümünde tanımlayın. Dn/dc ve UV yok olma katsayısı altında her tepe protein için doğru değerleri doğrulayın.
      Not: proteinler için bir standart RI artış değeri 0.185 mL/g belirtmek yaygın kullanılır, ancak için oluştururlar, farklı dn/dc değerleri, molekül doğa göre kullanılmalıdır. Saccharides, sukroz gibi bir ortalama dn/dc değeri 0,145 mL/g20 ve 0,1-0,16 arasında lipidler ve deterjanlar aralığının dn/dc değerleri varken ortalama dn/polynucleotides (DNA/RNA), 0,17 mL/g19, DC'dir mL/g21.
    4. Molar kütle ve uygun parametreleri ve Molar kütlesi ve yarıçapı'daki ve Rh QELS sayısı altında korelasyon işlevi kullanarak RADIUS analiz.
  2. RI sinyal değişiklikleri IEX MALS sırasında önemli ölçüde tuz konsantrasyonu artış nedeniyle çalıştırın. Bu nedenle, boş enjeksiyon RI veri gerektiren Toplu hesaplamalar için temel sinyalini çıkarma.
    1. Hem protein hem de boş IEX-MALS deneyler açın. Protein deneme adı üzerinde sağ tıklatın, Uygulama yöntemiseçin ve Temel çıkarma klasör dosya iletişim kutusundan seçin. Doğru yöntem (örneğin, çevrimiçi) için standart molar kütle analiz türünü. Not yeni açılan yönteminin parametreleri ve protein deneme için tanımlanan ayarları kaydedilir.
    2. Temel çıkarma görünümü altında boş çalışma sinyalleri almak için Alma boş tıklatın. Aletleri altında ( Al boş düğme) yanında, tüm çıkarmak için dedektörleri kontrol.
    3. Çözüm RI sırasında çalışma12değiştirdikten sonra tepeler görünümünde nedeniyle protein tepe bölgesinde çözeltinin iletkenliği (gerekirse) dn/dc değerlerini ayarlayın.
  3. BSA monomer ile IEX-MALS sistemi kalibre.
    Not: Normalde, IEX-MALS sistem düzenli olarak en yüksek hizalama, grup genişletme ve açısal dedektörleri Eylemsizlik (Rg) yarıçaplı bir monodisperse protein kullanımı 90 ° Detector normalleştirme için kalibre edilmiş < 10 nm, BSA monomer gibi. Bu örnekte, BSA hem kalibrasyon molekül olarak hizmet vermektedir ve kendisi molar kütle analiz konusudur.
    1. Prosedürleri altında tepeler Hizala > yapılandırma görüntüsü.
    2. Normalleştirme 3.0 girerek normalleştirme görünümü altında gerçekleştirmek nm Rg değeri olarak.
    3. Grup genişletme aynı yapılandırma sekmesinde altında en üst nokta seçin ve Gerçekleştirmek uygun düğmesini kullanarak RI sinyal UV ve LS sinyalleri maç.
  4. Sonuçları grafiği Sonuçları uygun görünümde görüntülenir. Grafik üzerinde sağ tıklatıp Düzenleseçerek ve ardından Gelişmiş düğmesini tıklatarak eksen ölçekleri ve diğer grafik parametreleri değiştirin. Daha fazla görüntü seçenekleri ile bir grafik figür de EASI grafik sekmesinde mevcuttur: Molar kütle penceresinin en üstündeki görüntülemek aþaðý açýlan menüsünden seçin.
  5. Not molar kütle, RADIUS, saflık düzeyini ve diğerleri de dahil olmak üzere tüm sonuçları sonuçları bölümü altında rapor görünümünde (Özet veya detaylı) bulunur. Daha fazla sonuçları veya parametreleri, hem de rakamlar, rapora eklemek için Rapor Tasarımcısı düğmesini kullanın.

Representative Results

BSA ve IEX-MALS, hem de sn-MALS uygulamak için son derece uygundur Kromatografi içinde deneysel sistem22 kalibrasyonu için kullanılan ortak bir proteindir. Öncelikle 66.7 kDa teorik monomer kitle ile monomeric ve genellikle az sayıda dimer ve daha yüksek reaksiyonlar23birleştirmek.

BSA üzerinde IEX-MALS bir anyon Satım analitik sütun kullanarak analiz ( Tablo malzemelerigörmek). Geniş doğrusal degrade 30 / oluşan 350 mm NaCl 75 mm CV BSA monomerleri daha yüksek reaksiyonlar ayrılmış. Aşağı akım MALS analiz 66.8 ± 0.7 kDa hesaplanan monomer molar kütlesi ve 130 ± 5 kDa (şekil 1A) hesaplanan dimer molar kütlesi sonuçlandı.

Arabellek iletkenlik eluted tepeler, bağlı olarak, gradyandaki farklı bir program için değiştirildi: 175 mM NaCl uzun bir adım takip tarafından doğrusal gradyan 175 mM 500 mM NaCl. Yeni degrade büyük ölçüde geliştirilmiş çözünürlük ve daha yüksek oligomeric türünü (ile bir hesaplanan ortalama kitle 132 ± 2 kDa) arasındaki BSA monomer (ile hesaplanan molar kütlesi 66,1 ± 0.7 kDa) mükemmel uzaklığı (şekil 1B). Ayrıca yüksek oligomeric türler üzerinde odaklanabilmek için ve molar BSA her bireysel oligomeric şeklinde kitlelerin hesaplamak için 200 mM 250 mM NaCl ve kademeli bir program uygulandı. BSA monomer (ile hesaplanan bir kitle 62.4 ± 0,4 kDa), dimer (ile hesaplanan bir kitle 130 ± 10 kDa) ve trimer (hesaplanan kütle, 170 ± 10 kDa ile) arasında mükemmel bir ayrılık bu denemenin sonuçlandı (şekil 1C). Tüm IEX-MALS deneyler BSA sn-MALS sonuçları nerede elute BSA monomerleri %8512saflığı ile anlaşarak %80 saflığı ile çoğunlukla bir monomer elutes göster.

Figure 1
Resim 1 : IEX-MALS deneme BSA için duruma getirilmesi. (A)IEX-MALS deneme BSA 75-350 mM NaCl degrade bir programla. (B) IEX-MALS BSA 175-500 mM NaCl doğrusal bir degrade programı tarafından takip 175 mM NaCl adımının bir programla denemeler yapın. (C) IEX-MALS BSA 200 mM ve 250 mM NaCl bir adım programı ile denemeler yapın. Chromatograms UV 280 nm (mavi), ışık (kırmızı), 90 ° açı ve Kırılma indisi (pembe) ve iletkenlik (gri) eğrileri ile birlikte MALS (siyah) tarafından hesaplanan her tepe molar kütlesi saçılma görüntülemek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

IEX-MALS yerli reaksiyonlar, özgün olmayan toplamları, kovalent ve kovalent karakterize protein ayrımı ve saf protein de aynı derecede-in türdeş olmayan örnekleri, doğru molar kütle tayini sağlar karakterizasyonu için güçlü bir yöntem olduğunu kompleksleri ve conjugated proteinler. Doğrusal gradyan veya tuz konsantrasyonu adımlar bir dizi oluşan bir program iyi bir ayrılık protein örneğin alınma olasılığını elde etmek ve her bireysel Peak MALS tarafından uygun analiz izin verebilirsiniz. Daha fazla en iyi duruma getirme degrade gibi farklı parametreleri değişen tarafından (bkz. Adım 3.4 Protokolü) eğimlidir, daha iyi bir çözünürlük gerekliyse yapılabilir. Protein karakterizasyonu, sn-MALS gibi diğer yöntemler için tamamlayıcı bir ek, kritik düzeyi sağlar beri IEX-MALS değerli protein kalite kontrol tahlil olabilir.

SN-MALS protein molar kütle tayini için standart ve ortak teknik olmakla birlikte, standart analitik sn sütun nispeten düşük çözünürlük doğru molar kütle ölçüleri MALS12tarafından elde sınırlayabilir. Ardışık reaksiyonlar, toplama tam monomer tepe ve türdeş olmayan nüfus değiştirilmiş proteinler gibi benzer molar kitleler ile ayrılmış değil yüksek düzeyde içeren çözümler sn-MALS sınırlamaları bazı örnekler.

IEX tasarım ve sn yürütmek için daha karmaşık bir Kromatografi yöntemi, ama bir IEX-MALS deneyden elde edilen bilgileri tamamlamak ve bazen sn-MALS analiz daha daha da bilgilendirici. IEX-MALS başarıyla sn ve analiz etmek zor olan kısa peptidler sn12,24tarafından ayrılmış değil tamamen aynı molar kütle, reaksiyonlar paylaşmak antikor türevleri karakterize. Ayrıca, SEC tarafından tam (içeren viral DNA) ve boş adeno ilişkili virüs (AAV), parçacıkların gibi ayrılması için fazla büyüktür makromoleküllerin derlemeler IEX25 MALS analiz önce tarafından çözülebilir. SN için karşılaştırıldığında, IEX daha farklı renk ayrımı yetenekleri14 sağlar ve tampon pH, tuz, türleri ve uzunluğunu sütun ve diğerleri gibi en yüksek çözünürlüğünü artırmak için çeşitli parametreler ayarlama esnekliğe sahiptir. SN, IEX örnek enjeksiyon için hiçbir ses kısıtlaması yoktur ve herhangi bir molekül boyutuna bağımsız analiz edilebilir (bkz. Tablo 1 Amartely vd.12). Bu örnekleri çok küçük proteinler veya toplama toplama üzerine için bir eğilim ile seyreltilmiş proteinler gibi düşük bir LS yoğunluğu ile başta olmak üzere IEX-MALS, büyük bir avantajı var. Analitik IEX sütun daha istikrarlı ve daha az parçacıklar sn sütunları daha serbest bırakmak eğilimindedir beri IEX-MALS çok kısa denge zaman gerektirir ve LS sinyalleri çok hızlı stabilize. Bu bireysel deneyler bu protokolü açıklandığı gibi çalışan ve gerekli olarak çalıştır durdurma sağlar.

SN, genellikle sağlayan iyi sonuçlar bir tek (bir sütun ile doğru ayırma aralığı kullanarak) deneme, IEX yöntem parametreleri ayarlama tarafından en iyi çözünürlük elde etmek için çeşitli deneyler gerektirebilir. IEX-MALS deneylerde bu tuz degradeyle arabellek iletkenlik gerçekleştirilir ve bu nedenle, RI önemli ölçüde değiştirmek çalışma sırasında RI sinyal sonucu yapılan değişikliklerle. Bunun için ek bir boş konsantrasyon analizi (nesli bir temanın bilgi gerektiren UV algılama için sınırlı olmadığı sürece (protokol 5.2. adımında açıklandığı gibi) temel çıkarma ile her IEX-MALS deney ve bir analiz için çalıştırmak gerekir her tepe için katsayıları). Temel çıkarma ile analiz doğrusal gradyanlar için sağlam olmasına rağmen daha fazla geliştirme yöntemi tuz kademeli programları başarılı temel çıkarma için gerekli bir parametredir. Her tepe dn/dc değerleri belirli bir arabellek iletkenlik (hesaplamalar edebiyat12' bulunabilir) eluted zirvesinde göre ayarlanmalıdır. Eğer bu ayarı 200 mM (BSA örnekte benzeri), düşük bir NaCl konsantrasyon adlı bir protein eluted ihmal edilebilir düzeydedir.

SN-MALS için karşılaştırıldığında IEX-MALS (ayrıntılı olarak açıklandığı adım 2.3 iletişim kuralı) olarak kullanılan protein göreceli olarak büyük miktarda tuz degrade ve kusurlu karıştırılması nedeniyle RI dalgalanmalar nedeniyle RI sinyal dramatik değişim üstesinden gelmek önemlidir Degrade arabellekleri. UV algılama kitle ölçüm için kullanılan yalnızca, küçük miktarlarda kullanılır. Protein enjekte miktar protein, Homojenizasyon, saflık ve UV yok olma katsayısı molar kütlesi üzerinde bağlıdır. Gerekli enjekte kitle daha küçük proteinler için daha yüksek ve daha büyük proteinler (~ 1 mg 20 kDa protein ve ~0.2 mg 150 kDa protein için) daha düşük olmalıdır. Miktarı arasında birkaç nüfus ayrılmıştır beri türdeş olmayan örnekleri daha fazla örnek enjeksiyon gerektirir. Analitik yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) bir FPLC sistemi daha az malzeme gerektirebilir.

Son zamanlarda, satır içi analiz MALS arıtma işlemleri sırasında bildirilmiştir. Gerçek zamanlı bir analiz arıtma sırasında oluşur ve herhangi bir daha fazla çözümleme protein ihtiyacını arıtma26sonra ortadan kaldırabilir toplama ürünleri algılamak için çok etkilidir. IEX Kromatografi sık bir ara arıtma adım olarak kullanılır; Böylece, MALS ile partiye hazırlık IEX sütun birleşimi sadece bir analitik karakterizasyon yöntemi aynı zamanda büyük ölçekli arıtma işlemlerinin gerçek zamanlı bir analiz olarak yararlı olabilir. Nonanalytical IEX sütunları da istikrarlı, parçacık bırakmadan düşük bir derece ile ve bu nedenle, MALS ile kullanılabilir. Benzeşme Kromatografi veya hidrofobik Satım Kromatografi, gibi diğer ayırma teknikleri (MALS ve RI dedektörleri kirlenmesini önlemek için) ne zaman nispeten saf örnekleri için tabi MALS ile kombine edilebilir. Bu adaptasyon gerektirir ve sadece iyi en yüksek ayırma ama aynı zamanda yeterince temiz LS ve RI elde etmek için yöntem duruma getirilmesi için başarılı bir MALS analiz sinyalleri.

Disclosures

D.S. Wyatt Technology Corporation olan ürünler bu protokol için kullanılmaktadır, bir çalışandır. A.T. Danyel biyoteknoloji, Wyatt ve ÄKTA aletler distribütörü bir çalışandır.

Acknowledgments

Yazarlar Dr Tsafi Danieli (Yapısal Biyoloji, İbrani Üniversitesi uygulanan Wolfson Merkezi) onun tavsiye ve işbirlikleri için teşekkür ederiz. Yazarlar ayrıca Danyel biyoteknoloji Ltd. (Rehovot, İsrail) Bu çalışmada kullanılan analitik FPLC-MALS sisteminin kurulması ve yardım için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ÄKTA pure GE Healthcare 29-0182-26 FPLC 
0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm GE Healthcare 6809-1002 Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm GE Healthcare 6809-1012 Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm GE Healthcare 6809-2012 Mobile phase filter
BSA (purity >97%) Sigma  A1900 Bovine serum albumin
miniDAWN TREOS  Wyatt Technology WTREOS MALS
mono Q HR 5/50 GL GE Healthcare 17-5166-01 Anion exchange analytical column
Optilab T-rEX Wyatt Technology WTREX Refractometer
0.1 mm PES 1000 mL Stericup Millipore SCVPU11RE Mobile phase filter
Sodium chloride Sigma  71382 HPLC grade NaCl
TRISMA base Sigma  T-1503 TRIS buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lebendiker, M., Danieli, T., de Marco, A. The Trip Adviser guide to the protein science world: a proposal to improve the awareness concerning the quality of recombinant proteins. BMC Research Notes. 7, 585 (2014).
  2. Raynal, B., Lenormand, P., Baron, B., Hoos, S., England, P. Quality assessment and optimization of purified protein samples: why and how. Microbial Cell Factories. 13, 180 (2014).
  3. Oliveira, C., Domingues, L. Guidelines to reach high-quality purified recombinant proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (1), 81-92 (2018).
  4. Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
  5. Minton, A. P. Recent applications of light scattering measurement in the biological and biopharmaceutical sciences. Analytical Biochemistry. 501, 4-22 (2016).
  6. Sahin, E., Roberts, C. J. Size-Exclusion Chromatography with Multi-angle Light Scattering for Elucidating Protein Aggregation Mechanisms. Methods in Molecular Biology. 899, 403-423 (2012).
  7. Ogawa, T., Hirokawa, N. Multiple analyses of protein dynamics in solution. Biophysical Reviews. 10 (2), 299-306 (2018).
  8. Rebolj, K., Pahovnik, D., Žagar, E. Characterization of a Protein Conjugate Using an Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation and a Size-Exclusion Chromatography with Multi-Detection System. Analytical Chemistry. 84 (17), 7374-7383 (2012).
  9. Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. Heterogeneity of Monoclonal Antibodies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (7), 2426-2447 (2008).
  10. Hintersteiner, B., et al. Charge heterogeneity: Basic antibody charge variants with increased binding to Fc receptors. mAbs. 8 (8), 1548-1560 (2016).
  11. Wei, B., Berning, K., Quan, C., Zhang, Y. T. Glycation of antibodies: Modification, methods and potential effects on biological functions. mAbs. 9 (4), 586-594 (2017).
  12. Amartely, H., Avraham, O., Friedler, A., Livnah, O., Lebendiker, M. Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization. Scientific Reports. 8 (1), 6907 (2018).
  13. Goyon, A., et al. Evaluation of size exclusion chromatography columns packed with sub-3μm particles for the analysis of biopharmaceutical proteins. Journal of Chromatography A. 1498, 80-89 (2016).
  14. Fekete, S., Beck, A., Veuthey, J. -L., Guillarme, D. Ion-exchange chromatography for the characterization of biopharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 43-55 (2015).
  15. Gasteiger, E., et al. ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  16. Kopaciewicz, W., Regnier, F. E. Mobile phase selection for the high-performance ion-exchange chromatography of proteins. Analytical Biochemistry. 133 (1), 251-259 (1983).
  17. Lebendiker, M., Danieli, T. Production of prone-to-aggregate proteins. FEBS Letters. 588 (2), 236-246 (2014).
  18. Lebendiker, M., Maes, M., Friedler, A. A screening methodology for purifying proteins with aggregation problems. Methods in Molecular Biology. 1258, 261-281 (2015).
  19. Fu, D., et al. Ultraviolet refractometry using field-based light scattering spectroscopy. Optics Express. 17 (21), 18878-18886 (2009).
  20. Scafati, A. R., Stornaiuolo, M. R., Novaro, P. Physicochemical and Light Scattering Studies on Ribosome Particles. Biophysical Journal. 11 (4), 370-384 (1971).
  21. Berthaud, A., Manzi, J., Pérez, J., Mangenot, S. Modeling Detergent Organization around Aquaporin-0 Using Small-Angle X-ray Scattering. Journal of the American Chemical Society. 134 (24), 10080-10088 (2012).
  22. Umrethia, M., Kett, V. L., Andrews, G. P., Malcolm, R. K., Woolfson, A. D. Selection of an analytical method for evaluating bovine serum albumin concentrations in pharmaceutical polymeric formulations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 51 (5), 1175-1179 (2010).
  23. Hirano, A., Arakawa, T., Kameda, T. Effects of arginine on multimodal anion exchange chromatography. Protein Expression and Purification. 116, 105-112 (2015).
  24. Avraham, O., Bayer, E. A., Livnah, O. Crystal structure of afifavidin reveals common features of molecular assemblage in the bacterial dimeric avidins. The FEBS Journal. , (2018).
  25. Lock, M., Alvira, M. R., Wilson, J. M. Analysis of Particle Content of Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 8 Vectors by Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 56-64 (2012).
  26. Patel, B. A., et al. Multi-angle light scattering as a process analytical technology measuring real-time molecular weight for downstream process control. mAbs. 10 (7), 945-950 (2018).

Tags

Biyokimya sayı: 146 iyon değiştirme (IEX) çok açılı ışık saçılma (MALS) Kromatografi protein ayrımı molekül ağırlığı sığır serum albumin (BSA) reaksiyonlar kalite kontrol
Protein ayrımı ve karakterizasyonu için birden fazla açıyla ışık saçılma (MALS) birleştiğinde iyon Kromatografi (IEX)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Amartely, H., Some, D., Tsadok, A.,… More

Amartely, H., Some, D., Tsadok, A., Lebendiker, M. Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization. J. Vis. Exp. (146), e59408, doi:10.3791/59408 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter