Evaluatie van colorectale kanker risico en prevalentie door ontlasting DNA Integriteit Detectie

Summary

De gepresenteerde diagnostische FL-DNA kit is een tijdbesparende en gebruiksvriendelijke methode om de betrouwbare waarschijnlijkheid van de aanwezigheid van colorectale kankerlaesies te bepalen.

Abstract

Tegenwoordig kan ontlasting DNA worden geïsoleerd en geanalyseerd door verschillende methoden. De lange fragmenten van DNA in ontlasting kunnen worden gedetecteerd door een qPCR-test, die een betrouwbare waarschijnlijkheid biedt van de aanwezigheid van pre-neoplastische of neoplastische colorectale laesies. Deze methode, genaamd fluorescentie lang DNA (FL-DNA), is een snelle, niet-invasieve procedure die een verbetering is ten opzichte van het primaire preventiesysteem. Deze methode is gebaseerd op de evaluatie van fecale DNA-integriteit door kwantitatieve versterking van specifieke doelen van genomisch DNA. Met name de evaluatie van DNA-fragmenten langer dan 200 bp maakt detectie van patiënten met colorectale laesies met een zeer hoge specificiteit mogelijk. Dit systeem en alle momenteel beschikbare dna-tests met ontlasting geven echter een aantal algemene problemen die moeten worden aangepakt (bijvoorbeeld de frequentie waarop tests moeten worden uitgevoerd en een optimaal aantal ontlastingsmonsters die op elk tijdstip voor elk individu worden verzameld). Het belangrijkste voordeel van FL-DNA is echter de mogelijkheid om het te gebruiken in combinatie met een test die momenteel wordt gebruikt in het CRC-screeningprogramma, bekend als de immunochemische fecale occulte bloedtest (iFOBT). Beide tests kunnen namelijk op hetzelfde monster worden uitgevoerd, waardoor de kosten worden verlaagd en een betere voorspelling wordt gedaan van de uiteindelijke aanwezigheid van colorectale laesies.

Introduction

Colorectale kanker (CRC) is afgeleid van een multi-step proces waarbij gezond epitheel zich langzaam ontwikkelt tot adenomen of poliepen, die in de loop van de tijd uitgroeien tot kwaadaardige carcinomen^1,2. Ondanks het hoge incidentiepercentage van CRC is er de afgelopen^tienjaar een neerwaartse trend in het percentage sterfgevallen waargenomen . Inderdaad, vroege diagnostische instrumenten die in screeningsprogramma's zijn aangenomen, hebben geleid tot vroegtijdige opsporing en verwijdering van pre-neoplastische adenomen of poliepen⁴. Echter, vanwege de verschillende technische limieten, geen van deze methoden is optimaal. Om de gevoeligheid en specificiteit te verbeteren, zijn veel dna-tests met ontlasting alleen of in combinatie met de huidige routinediagnosetests^5,6voorgesteld .

Typisch, gezonde slijmvlies werpt in de fecale stroom apoptotische colonocyten, terwijl zieke slijmvlies exfoliates niet-apoptotische colonocyten. Fragmenten van 200 bp of meer in lengte karakteriseren niet-apoptotisch DNA. Dit DNA heet lang DNA (L-DNA) en is uitgegroeid tot een bruikbare biomarker voor CRC vroege diagnose. Het L-DNA kan worden geïsoleerd van ontlasting specimen en gekwantificeerd door qPCR met behulp van een in vitro diagnostische FL-DNA kit^{7,8,9,10,11,12}.

De test bestaat uit twee tests voor de detectie van FL-DNA fragmenten variërend van 138 bp tot 339 bp. Elke test maakt de versterking van FL-DNA (FAM) en spike-in DNA (HEX) mogelijk. Om een optimale versterking van alle fragmenten te garanderen, is de test verdeeld in twee tests (genaamd "A" en "B"). De A-test detecteert twee gebieden van exon 14 van het APC-gen (NM_001127511) en een fragment van exon 7 van het TP53-gen (NM_001276760). De B-test detecteert een fragment van exon 14 van het APC-gen (NM_001127511) en twee gebieden van exonen 5 en 8 van het TP53-gen (NM_001276760). De tests maken geen onderscheid tussen de gedetecteerde regio's. Het spike-in DNA komt overeen met het Oncorhynchus keta zalm DNA en maakt het mogelijk om te controleren of de procedure goed is uitgevoerd en controleert op de mogelijke aanwezigheid van remmers, wat foutnegatieve resultaten kan opleveren. De FL-DNA concentratie wordt geëvalueerd door absolute kwantificering met behulp van de standaard curve methode en wordt uitgedrukt als ng / reactie.

De FL-DNA methode is een niet-invasieve en goedkope ontlasting DNA-test die, in combinatie met de immunochemische op basis van fecale occulte bloedtest (iFOBT), wordt momenteel gebruikt in CRC screening programma's en zorgt voor betere voorspellingen van CRC en / of hoog risico adenoma laesies¹².

Protocol

Tussen 2013 en 2015 werden patiënten aangeworven bij de Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) van Meldola (FC, Italië). Ingeschreven patiënten waren opgenomen in protocol IRSTB002, goedgekeurd door de Ethische Commissie van IRST - IRCCS AVR (25/10/2012, ver. 1). Alle methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met relevante richtlijnen en voorschriften. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten.

1. DNA-extractie uit ontlasting

1. Gebruik een kit om ontlastingsmonsters voor te bereiden (zie Tabel met materialen)). Selecteer en behandel het fecale materiaal door de extractie uit te voeren volgens de instructies van de fabrikant. Versterk het gezuiverde DNA direct of bewaar bij -20 °C voor latere analyse.

2. Voorbereiding van positieve controle, normen, spike-in DNA en klinische monsters

1. Bereiding van normen en monsters
   1. Om de positieve controle, normen, spike-in DNA, en alle klinische monsters voor te bereiden, centrifuge een aliquot van positieve controle, normen, en spike-in DNA, dan resuspend elk reagens door het toevoegen van de juiste hoeveelheid geleverd water (zie hieronder). Dan, zorgvuldig vortex de positieve controle, standaard, en spike-in DNA, dan centrifuge voor 10 s. Om een volledige resuspensie van de droge reagentia te bereiken, slaat u de vloeistofreagentia op kamertemperatuur (RT) gedurende 30 minuten voor gebruik op.
      1. De positieve controle is menselijk DNA in een droog formaat. Resuspend elke aliquot met 750 μL water.
      2. De spike-in DNA is zalm (Oncorhynchus keta) DNA, die wordt gebruikt als een exogene interne controle om de mogelijke aanwezigheid van remmers in DNA-monsters uit ontlasting te verifiëren. Resuspend elke aliquot met 100 μL water.
   2. Om de standaardcurve voor te bereiden, produceert u vier 1:5 verdunningen vanaf de voorraadoplossing. De standaardpunten moeten 10 ng/reactie, 2 ng/reactie, 0.4 ng/reactie, en 0.08 ng/reactie zijn.
2. Voorbereiding van het 1x spike-in DNA
   1. Bereid de spike-in DNA-controle direct voor gebruik voor.
   2. Bereid de 1x spike-in DNA-controle voor door 5 μL FL-DNa spike te mengen met 20 μL steriel water. Het aantal 1x spike-in DNA-controle monsters zal worden voorbereid op basis van het aantal van de monsters worden geanalyseerd, plus de positieve controle.
3. Bereiding van monsters
   1. Meng 75 μL van de monsters (klinische monsters of positieve controle) met 25 μL 1x spike-in DNA, wat een totaal volume van 100 μL oplevert.

3. Versterking en bepaling van de FL-DNA waarde met behulp van qPCR Easy PGX

OPMERKING: Volledige versterkingsmengsels die specifieke primers en sondes bevatten die gericht zijn op het menselijk DNA en de interne controle zijn voorzien in een lyofiel formaat in 8 putstrips voor FL-DNA Mix A en FL-DNA Mix B. Normen, positieve en negatieve controles en monsters moeten worden versterkt met beide lyoffiele mixen. Klinische monsters mogen alleen in tweevoud worden versterkt met beide lyofiele mengsels.

1. Zie de tabel van materialen voor qPCR-instrument en operationele software.
   1. Open de bedrijfssoftware en stel de plaat en het thermische profiel in:
      1. Stel de plaat in zoals aangegeven in tabel 1.
         1. Stel het puttype in voor alle acht posities in kolom 1 als Standaard.
         2. Stel het puttype in voor de A2- en B2-putten als NTC.
         3. Stel het brontype voor C2 en D2 (de positieve besturingselementen) in als Onbekend.
         4. Stel het puttype voor alle andere posities in als Onbekend.
         5. Selecteer alle 96 posities en voeg de Dyes FAM en HEXtoe. Klik op Synchronisatieplaat.
      2. Stel het thermische profiel in volgens tabel 2.
   2. Centrifuge het benodigde aantal strips voor 10 s om de inhoud naar de bodem van de buis te brengen.
   3. Verwijder voorzichtig de afdichtingen uit de stroken, met aandacht voor het behoud van de inhoud, en voeg toe aan de respectieve stroken: negatieve controle: 20 μL water; monster: 20 μL DNA; standaardcurve: 20 μL van standaard 1, 2, 3 of 4; positieve controle: 20 μL positieve controle.
   4. Sluit alle strips voorzichtig met behulp van de 8 strip platte optische doppen en vortex voor enkele seconden.
   5. Centrifugeren de strips voor 10 s en laad ze in het instrument. Start dan de run.

4. Gegevensanalyse

LET OP: Gegevensanalyse kan automatisch of handmatig worden uitgevoerd, afhankelijk van de software (zie Tabel met materialen).

1. Selecteer aan het einde van de run de kolommen A, C, E, G voor "FAM: FL-DNA-A" en "HEX: IC"en kolommen B, D, F, H voor "FAM: FL-DNA-B" en "HEX: IC".
2. Stel het volgende in voor het standaardhoeveelheid :10 ng/reactie voor A1- en B1-putten, 2 ng/reactie voor C1 en D1, 0,4 ng/reactie voor E1 en F1 en 0,08 ng/reactie voor G1 en H1.
3. Stel drempelfluorescentiewaarden in op 150 voor zowel FAM (FL-DNA A als FL-DNA B) en HEX (IC) kanalen.
4. Klik in het vak Resultaattabel op Kolomopties | Alles selecteren | Ok om de resultaten te verkrijgen in beide kanalen met hun respectieve Cq (∙R) en ∙R laatste waarden.
   LET OP: Deze waarden worden geleverd door de Real Time PCR-instrumentsoftware. ΔR komt laatst overeen met de fluorescentiewaarde genormaliseerd aan de laatste versterkingscyclus.
5. Klik in het vak Resultaattabel met de rechtermuisknop op de tabel om het contextmenu te openen en klik op Verzenden naar Excel om de ruwe gegevens te exporteren.
6. Controleer de waarden van de normen om de geschiktheid van de standaardcurve te controleren.
7. Controleer voor elke FL-DNA-mix de R² [R² (R²)" kolom en efficiëntie ["Efficiëntie (%)" kolom] waarden. Als ze zich in een aanvaardbaar bereik bevinden, is het mogelijk om de instructies van de fabrikant dienovereenkomstig te analyseren(tabel 3).
8. Als de resultaten van het FAM-kanaal zich niet in het verwachte bereik bevinden, laat dan één punt van de standaardcurve weg en heranalyseer de run.
9. Bepaal de waarden van de negatieve en positieve besturingselementen met de volgende formule, rekening houdend met de waarden 'Geen Cq' als nul:
   
   
10. Vergelijk de verkregen waarden met die welke in tabel 4worden vermeld .
11. Als de reactiebesturingselementen zich binnen het bereik van de verwachte waarden bevinden, gaat u verder met de analyse van de monsters.
    OPMERKING: Controleer of de verkregen Cq-waarden worden gegenereerd uit een echte versterkingsreactie (sigmoïdale fluorescentiecurve) en niet uit een artefact (lineaire fluorescentiecurve).
12. Als u de geschiktheid van het monster voor elke FL-DNA-mix wilt analyseren, vergelijkt u de Cq-waarden van het HEX-kanaal. Als de waarde ≥16 is, gaat u verder met de analyse van de monsters. Als de waarde <16 is of er geen Cq is, is dit waarschijnlijk te wijten aan een doseerfout van de FL-DNA Spike. Daarom is het niet mogelijk om de monsters te analyseren.
13. Bereken het gemiddelde van de Cq-waarden in het HEX-kanaal van het positieve besturingselement met behulp van de volgende formule:
    
14. Bereken het gemiddelde van de Cq-waarden in het HEX-kanaal van de voorbeeldrepliceert met de volgende formule:
    
15. Bereken de CqHEX-waarden volgens de volgende formule:
    
16. Vergelijk de CqHEX-waarden van de monsters met de in tabel 5gerapporteerde .
17. Vergelijk voor elke mix (Mix A en Mix B) de Cq-waarden van het FAM-kanaal met die welke in tabel 6 worden gerapporteerd.
18. Gebruik de volgende formule, rekening houdend met de waarden 'Geen Cq' als nul om de FL-DNA-waarde van elk geschikt monster te bepalen:
    
    
    OPMERKING: Colorectale kankerrisico en prevalentie is een functie van iFOBT- en FL-DNA-evaluaties volgens de Fagan nomogramresultaten verkregen door Rengucci et al.¹² (Tabel 7).

Representative Results

De werkstroom van dit protocol wordt weergegeven in figuur 1. De werkstroom biedt twee controlestappen en verschillende acties op basis van deze stapresultaten. Ten eerste, als een monster ongeschikte besturingselementen bevat, moet de versterking worden herhaald. Ten tweede, als de versterking wordt geremd, moet het monster vanaf het begin worden herverwerkt of als niet waardevol worden geclassificeerd.

Figuur 2 toont de fluorescentiecurven die worden geproduceerd door positieve en negatieve monsters. (A) Getoond is een voorbeeld van een geschikt positief monster. Het monstersignaal op het HEX-kanaal bevindt zich binnen het aanvaardbare bereik. Het positieve signaal ligt boven de drempel op het FAM-kanaal. (B) Getoond is een voorbeeld van een geschikte negatieve / niet positieve steekproef. Het monstersignaal bevindt zich binnen het aanvaardbare bereik op het HEX-kanaal. Het negatieve controlesignaal ligt onder de drempel op het FAM-kanaal. (C) Getoond is een voorbeeld van een niet geschikt monster. Het monstersignaal bevindt zich niet binnen het aanvaardbare bereik op het HEX-kanaal; zo kan een mogelijke remming worden aangenomen. Dit monster moet worden herhaald, te beginnen met de extractie.

Figuur 1: Workflow voor FL-DNA kwantificering. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Fluorescentiecurven die de versterking van Mix A (of Mix B) doelgenen (kanaal FAM) en interne controle (kanaal HEX) laten zien. A) FL-DNA positief monster. (B) FL-DNA negatief monster. (C) Remming van monsterversterking. Rode curve: positieve controle; groene curve: negatieve controle; zwarte curve: klinisch monster. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

X

A

Standaard 1

Water

DNA2

DNA4

DNA6

DNA8

DNA10

DNA12

DNA14

DNA16

DNA18

DNA20

1

FL-DNA Mix A

B

Standaard 1

Water

DNA2

DNA4

DNA6

DNA8

DNA10

DNA12

DNA14

DNA16

DNA18

DNA20

2

FL-DNA Mix B

C

Standaard 2

Pos

DNA2

DNA4

DNA6

DNA8

DNA10

DNA12

DNA14

DNA16

DNA18

DNA20

3

FL-DNA Mix A

D

Standaard 2

Pos

DNA2

DNA4

DNA6

DNA8

DNA10

DNA12

DNA14

DNA16

DNA18

DNA20

4

FL-DNA Mix B

E

Standaard 3

DNA1

DNA3

DNA5

DNA7

DNA9

DNA11

DNA13

DNA15

DNA17

DNA19

DNA21

5

FL-DNA Mix A

F

Standaard 3

DNA1

DNA3

DNA5

DNA7

DNA9

DNA11

DNA13

DNA15

DNA17

DNA19

DNA21

6

FL-DNA Mix B

G

Standaard 4

DNA1

DNA3

DNA5

DNA7

DNA9

DNA11

DNA13

DNA15

DNA17

DNA19

DNA21

7

FL-DNA Mix A

H

Standaard 4

DNA1

DNA3

DNA5

DNA7

DNA9

DNA11

DNA13

DNA15

DNA17

DNA19

DNA21

8

FL-DNA Mix B

Tabel 1: Set-up plaat met verdeling van de controle, curve, en monsters. Kolom X geeft het getelde nummer aan de bovenkant van de strip aan.

Stap	Temperatuur en tijd
Hot Start (1 cyclus)	95 °C gedurende 5 minuten
Versterking (40 cycli)	95 °C voor 15 s 54 °C voor 15 s 60 °C voor 45 s (gegevensverzameling)

Tabel 2: Thermisch profiel voor DNA-versterking.

Tabel 3: Bereik van HEX- en FAM-kanaalwaarden van de standaarden om de geschiktheid van de standaardcurve te verifiëren.

Tabel 4: Bereik van HEX- en FAM-kanaalwaarden van negatieve en positieve besturingselementen om de geschiktheid van de run te verifiëren.

Tabel 5: Bereik van hex- en FAM-kanaalwaarden van monsters om de geschiktheid van de monsteranalyse te verifiëren.

Tabel 6: Meng A- en Mix B Cq-waarden van het FAM-kanaal om de geschiktheid van FL-DNA-analyse te verifiëren.

Tabel 7: Kankerrisico-evaluatie als functie van iFOBT- en FL-DNA-waarden. Afhankelijk van de relatie tussen iFOBT- en FL-DNA-waarden schat de tabel de waarschijnlijkheid van colorectale neoplastische laesies.

Discussion

Eerdere studies hebben aangetoond dat DNA-integriteitsanalyse van ontlasting die wordt geëxtraheerd door handmatige en semi-automatische benaderingen een alternatief instrument kan zijn voor de vroegtijdige detectie van colorectale laesies^{7,8,9,10,11,12}. Moleculaire, niet-invasieve screening tests zijn ontwikkeld door de jaren heen voor de detectie van colorectale kanker, maar de wijdverbreide verspreiding van deze methoden is beperkt als gevolg van tijdrovende benaderingen en slechte kosteneffectiviteit in vergelijking met andere screening tests.

Deze aanpak is relatief goedkoop en niet te tijdrovend. Het heeft ook verhoogde nauwkeurigheid in het ontdekken van colorectale laesies als gevolg van een nieuwe procedure die weinig handmatige stappen. De hier beschreven aanpak is snel met minder handmatige stappen, en het is in staat om gemakkelijk te worden uitgevoerd op vele monsters per week. De DNA-extractie levert geen specifieke problemen op en kan worden uitgevoerd door eenvoudige handmatige stappen of het gebruik van een automatisch instrument. In het laatste geval is het noodzakelijk om het automatische DNA-extractie-instrument te bepalen, waardoor de meest reproduceerbare resultaten mogelijk zijn. De meest kritieke stap van DNA-extractie is het verzamelen van ontlasting en methode van de opslag ervan vóór DNA-extractie. Het is raadzaam om de ontlasting bevroren te houden en zo snel mogelijk verder te gaan met de extractie.

Een ander kritiek probleem wordt vertegenwoordigd door mogelijke remmers van de versterkingsreacties. De fecale extractie is niet in staat om het genomische DNA te zuiveren, omdat onzuiverheden de juiste versterkingsreactie compromitteren. In dit verband vereist het protocol het gebruik van spike-in DNA voor het verifiëren van de aanwezigheid/afwezigheid van reactieremmers.

Tot voor kort was de fecale occulte bloedtest de belangrijkste aanpak die wordt gebruikt om colorectale laesies in screeningsprogramma's te detecteren; hoewel, het presenteert een aantal grenzen in termen van nauwkeurigheid. Een alternatieve strategie voor de diagnose van colorectale kanker is gebaseerd op de analyse van DNA uit geëxfolieerde cellen uitgescheiden in ontlasting. Verschillende benaderingen zijn geëvalueerd in het afgelopen jaar, maar geen zijn beschikbaar voor gebruik in screening programma's.

De FL-DNA integriteitswaarde kan een nuttig alternatief zijn, dat in combinatie met de standaard screening iFOBT-testwaarde de aanwezigheid van tumoren en/of hoog-risico adenomen^11,12 kan voorspellen door een Fagan Nomogram-benadering¹⁰ (Tabel 7). Deze aanpak schat de gecombineerde testkansie van de aanwezigheid van neoplastische laesie, waardoor de diagnostische nauwkeurigheid wordt verbeterd in vergelijking met de standaardbenadering die alleen wordt gebruikt.

Deze informatie kan clinici helpen bij het plannen van diagnostische tests in aanvulling op een geschikte colonoscopie en het personaliseren van de bewaking. De FL-DNA kit vereenvoudigt de handmatige stappen en zorgt voor stabiele en consistente resultaten. Sommige problemen moeten echter nog worden opgehelderd om de diagnostische nauwkeurigheid van de methode te verbeteren. Zo moet bijvoorbeeld de frequentie waarop de tests moeten worden uitgevoerd en het aantal ontlastingsmonsters dat op specifieke tijdpunten voor elk individu moet worden geanalyseerd, zorgvuldig worden geselecteerd. Aangezien deze test gelijktijdig met iFOBT moet worden uitgevoerd, is een methode die om de twee jaar moet worden verzameld, zoals gebruikelijk is in tal van screeningprotocollen, noodzakelijk om de effectiviteit van deze test als vervanging of alternatief voor de huidige screeningtests te verifiëren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free)			Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Absolute Ethanol (quality of analytical degree)			Reagent required for DNA extraction
Benchtop centrifuge			Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction
EasyPGX analysis software version 2.0.0	Diatech Pharmacogenetics	RT800-SW	Analysis software
EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips	Diatech Pharmacogenetics	RT803	Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX qPCR instrument 96	Diatech Pharmacogenetics	RT800-96	Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX ready FL-DNA	Diatech Pharmacogenetics	RT029	Kit required for the Real Time PCR assay
Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL)			Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Powder-free disposable gloves			Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
QIAamp Fast DNA Stool	Qiagen	51604	Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool
Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL)			Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Thermal block e.g. EasyPGX dry block	Diatech Pharmacogenetics	RT801	Instrument required for DNA extraction
Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml	Diatech Pharmacogenetics	RT802	Instrument required for DNA extraction