제시된 진단 FL-DNA 키트는 대장암 병변의 존재의 신뢰할 수 있는 확률을 결정하는 시간 절약 및 사용자 친화적 인 방법입니다.
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이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
요즘 대변 DNA는 여러 가지 방법으로 분리되고 분석 될 수 있습니다. 대변에 있는 DNA의 긴 단편은 사전 신생물 또는 신생물 대고 병변의 존재의 믿을 수 있는 확률을 제공하는 qPCR 분석결과로 검출될 수 있습니다. 형광 긴 DNA에게 불린 이 방법은 (FL-DNA), 1 차적인 예방 시스템에 개선인 빠른, 비침범성 절차입니다. 이 방법은 게놈 DNA의 특정 표적의 정량적 증폭에 의한 배설물 DNA 무결성의 평가에 기초한다. 특히, 200 bp 보다 긴 DNA 단편의 평가는 매우 높은 특이성을 가진 대장 병변을 가진 환자의 검출을 허용합니다. 그러나, 이 시스템 및 현재 유효한 모든 발판 DNA 시험은 해결될 필요가 있는 몇몇 일반적인 문제점을 제출합니다 (예를 들면, 시험을 수행해야 하는 주파수 및 각 개별을 위한 각 시점에서 집합된 대변 견본의 최적 수). 그러나, FL-DNA의 주요 장점은 면역화학성 배설물 혈액 검사(iFOBT)로 알려진 CRC 스크리닝 프로그램에서 현재 사용되는 시험과 관련하여 이를 사용할 수 있는 가능성이다. 실제로, 두 시험은 비용을 감소시키고 대장 병변의 궁극적인 존재의 더 나은 예측을 달성하는 동일 견본에 수행될 수 있습니다.
서론
대장암 (CRC)은 건강한 상피가 천천히 선종 또는 폴립으로 발전하는 다단계 과정에서 파생되며, 이는 시간이 지남에 따라 악성 암으로 진행됩니다1,,2. CRC의 높은 발생률에도 불구하고, 죽음의 비율에 있는 하향 추세는 지난 10 년간 관찰되었습니다3. 실제로, 선별 프로그램에서 채택된 조기 진단 도구는 pre-neoplastic 선종 또는 폴립4의조기 발견 및 제거로 이끌어 냈습니다. 그러나 다른 기술적 한계로 인해 이러한 방법 중 어느 것도 최적입니다. 실제로, 민감도와 특이성을 향상시키기 위하여, 많은 발판 DNA 시험은 단독으로 또는 현재 일상적인 진단시험과조합하여 제안되었습니다5,6.
일반적으로 건강한 점막은 배설물 스트림 apoptotic colonocytes로 흘러 들어가는 반면, 병에 걸린 점막은 비 세포사선 대장세포가 제거됩니다. 길이가 200 bp 이상인 단편은 비-사멸 DNA를 특징짓는다. 이 DNA는 긴 DNA (L-DNA)에게....
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프로토콜
환자는 2013년과 2015년 사이 멜돌라 (FC, 이탈리아)의 로 스튜디오 e la Cura dei Tumori (IRST)당 Istituto Scientifico Romagnolo당에서 모집되었습니다. 등록된 환자는 IRST의 윤리위원회에 의해 승인된 프로토콜 IRSTB002로 - IRCCS AVR (25/10/2012, ver. 1). 모든 방법은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 서면 통보 된 동의는 모든 환자로부터 얻었다.
1. 대변에서 DNA 추출
- 키트를 사용하여 대변 샘플을 준비합니다(재료 표참조). 제조업체의 지침에 따라 추출을 수행하여 배설물을 선택하고 처리합니다. 정제된 DNA를 직접 증폭하거나 후속 분석을 위해 -20°C에 저장합니다.
2. 양성 대조군, 표준, 스파이크인 DNA 및 임상 샘플의 준비
- 표준 및 시료 준비
- 양성 대조군, 표준, 스파이크인 DNA 및 모든 임상 샘플을 준비하려면 양성 대조군, 표준 및 스파이크인 DNA의 알리쿼트를 원심분리한 다음 제공된 물의 정확한 양을 추가하여 각 시약을 다시 일시 중단합니다(아래 참조). 그런 다....
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결과
이 프로토콜의 워크플로는 그림 1에나와 있습니다. 워크플로는 이러한 단계 결과에 따라 두 가지 제어 단계와 서로 다른 작업을 제공합니다. 첫째, 샘플에 부적절한 컨트롤이 있는 경우 증폭을 반복해야 합니다. 둘째, 증폭이 억제되면 시료를 처음부터 재처리하거나 가치가 없는 것으로 분류해야 합니다.
도 2는 양성 및 음수 샘플에 의해 생성된 형광 곡선을 나타낸다. (A)도시된 것은 적합한 양성 샘플의 예이다. HEX 채널의 샘플 신호가 허용 범위 내에 있습니다. 양수 신호가 FAM 채널의 임계값을 초과합니다. (B)표시된 것은 적합한 음수/양수 샘플의 예입니다. 샘플 신호는 HEX 채널의 허용 범위 내에 있습니다. 음의 제어 신호가 FAM 채널의 임계값 보다 낮습니다. (C)도시된 것은 적합하지 않은 샘플의 예이다. 샘플 신호가 HEX.......
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토론
이전 연구는 수동 및 반자동 접근법에 의해 추출 된 대변의 DNA 무결성 분석이 대장 병변7,8,89,10,,,11,,12의조기 발견을위한 대체 도구를 나타낼 수 있음을 입증했다.10 분자, 비침습적 선별 검사는 대장암 의 검출을 위해 수년에 걸쳐 개발되었지만, 이러한 방법의 광범위한 확산은 다른 선별 검사에 비해 시간 소모적인 접근법과 비용 효율성 저하로 인해 제한됩니다.
이 방법은 비교적 저렴하고 시간이 많이 걸리지 않습니다. 또한 몇 가지 수동 단계를 필요로하는 새로운 절차로 인해 대장 병변을 검출하는 정확도가 증가했습니다........
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공개 사항
마우라 멘기는 디아텍 약전유전학 스월의 풀타임 직원입니다.
감사의 글
저자는 인정이 없습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 및 2 mL 폴리프로필렌 트위스트-락 튜브 (DNase-, RNase-, DNA-, PCR 억제제 없음) | DNA 추출 및 Real Time PCR | ||
| 절대 에탄올 (분석 정도의 품질) | 에 필요한 소모품 DNA 추출에 필요한 시약 | ||
| 벤치탑 원심분리기 | 최대 속도 20000 x g. DNA 추출에 필요한 기기 | ||
| EasyPGX 분석 소프트웨어 버전 2.0.0 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | 분석 소프트웨어 |
| EasyPGX 원심분리기/와류 8-웰 스트립 | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | 기기는 실시간 PCR 분석에 권장됩니다. |
| EasyPGX qPCR 기기 96 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | 기기는 Real Time PCR 분석에 권장됩니다. |
| EasyPGX 준비 FL-DNA | Diatech Pharmacogenetics | RT029 | Kit for the Real Time PCR assay |
| Micropipettes (volume from 1.000 µ L) | DNA 추출 및 Real Time PCR에 필요한 소모품 | ||
| 파우더 프리 일회용 장갑 | DNA 추출 및 Real Time PCR에 필요한 소모품 | ||
| QIAamp Fast DNA Stool | Qiagen | 51604 | 대변에서 DNA 추출 및 정제에 권장되는 키트 |
| 멸균 필터 팁 DNase-, RNase-free (1 - 1.000 µ L) | DNA 추출 및 Real Time PCR에 필요한 소모품 | ||
| 열 차단 예: EasyPGX 건조 블록 | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | DNA 추출에 필요한 기기 |
| Vortex 예: EasyPGX 원심분리기/소용돌이 1.5 ml | Diatech Pharmacogenetics | RT802 | DNA 추출에 필요한 기기 |
참고문헌
- Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
- Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
- SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National....
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection
Posted by JoVE Editors on 9/28/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. An affiliation was updated.
The first affiliation was updated from:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)
to:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy
