Summary

Avaliação do Risco e Prevalência de Câncer Colorretal por Detecção de Integridade do DNA das fezes

Published: June 08, 2020
doi:

Summary

O kit de DNA de DIAGNÓSTICO apresentado é um método de economia de tempo e fácil de usar para determinar a probabilidade confiável da presença de lesões de câncer colorretal.

Abstract

Hoje em dia, o DNA das fezes pode ser isolado e analisado por vários métodos. Os longos fragmentos de DNA nas fezes podem ser detectados por um ensaio qPCR, que fornece uma probabilidade confiável da presença de lesões colorretais pré-neoplásicas ou neoplásicas. Este método, chamado DNA longo fluorescência (FL-DNA), é um procedimento rápido e não invasivo que é uma melhoria no sistema de prevenção primário. Este método baseia-se na avaliação da integridade do DNA fecal por amplificação quantitativa de alvos específicos do DNA genômico. Em particular, a avaliação de fragmentos de DNA com mais de 200 bp permite a detecção de pacientes com lesões colorretais com especificidade muito alta. No entanto, este sistema e todos os testes de DNA de fezes disponíveis atualmente apresentam algumas questões gerais que precisam ser abordadas (por exemplo, a frequência em que os testes devem ser realizados e o número ideal de amostras de fezes coletadas em cada ponto de tempo para cada indivíduo). No entanto, a principal vantagem do FL-DNA é a possibilidade de usá-lo em associação com um teste atualmente utilizado no programa de triagem de CRC, conhecido como o exame de sangue oculto fecal à base imunoquímica (iFOBT). De fato, ambos os testes podem ser realizados na mesma amostra, reduzindo custos e obtendo uma melhor previsão da eventual presença de lesões colorretais.

Introduction

O câncer colorretal (CRC) deriva de um processo de várias etapas em que o epitélio saudável lentamente se desenvolve em adenomas ou pólipos, que progridem em carcinomas malignos ao longo do tempo1,,2. Apesar da alta taxa de incidência do CRC, observou-se tendência de queda no percentual de óbitos na última década3. De fato, as ferramentas de diagnóstico precoce adotadas em programas de triagem levaram à detecção e remoção precoce de adenomas pré-neoplásicos ou pólipos4. No entanto, devido aos diferentes limites técnicos, nenhum desses métodos é o ideal. De fato, para melhorar a sensibilidade e a especificidade, muitos testes de DNA de fezes foram propostos sozinhos ou em combinação com os testes de diagnóstico de rotina atuais5,6.

Tipicamente, a mucosa saudável se lança nos colonos apoptóticos do fluxo fecal, enquanto a mucosa doente esfolia colonos não apoptóticos. Fragmentos de 200 bp ou mais de comprimento caracterizam DNA não apoptótico. Este DNA é chamado de DNA longo (L-DNA) e tornou-se um biomarcador utilizado para o diagnóstico precoce do CRC. O L-DNA pode ser isolado da amostra de fezes e quantificado por qPCR usando um kit de DNA FL-DNA in vitrodiagnóstico 7,8,9,,10,,11,12.

O teste consiste em dois ensaios para a detecção de fragmentos de DNA FL variando de 138 bp a 339 bp. Cada ensaio permite a amplificação do FL-DNA (FAM) bem como o DNA de spike-in (HEX). Para garantir a amplificação ideal de todos os fragmentos, o teste foi dividido em dois ensaios (chamados “A” e “B”). O ensaio A detecta duas regiões do exon 14 do gene APC (NM_001127511) e um fragmento de exon 7 do gene TP53 (NM_001276760). O ensaio B detecta um fragmento de exon 14 do gene APC (NM_001127511) e duas regiões dos gônons 5 e 8 do gene TP53 (NM_001276760). Os ensaios não distinguem entre as regiões detectadas. O DNA de pico corresponde ao DNA do salmão Oncorhynchus keta e permite verificar que o procedimento foi feito corretamente e verifica a possível presença de inibidores, o que pode produzir resultados falsos negativos. A concentração fl-DNA é avaliada por quantificação absoluta usando o método de curva padrão e é expressa como ng/reação.

O método FL-DNA é um teste de DNA de fezes não invasivo e barato que, combinado com o exame de sangue oculto fecal à base imunoquímica (iFOBT), é atualmente usado em programas de triagem de CRC e permite melhores previsões de LESÕES de Adenomas de CRC e/ou de alto risco12.

Protocol

Os pacientes foram recrutados no Istituto Scientifico Romagnolo por lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) de Meldola (FC, Itália) entre 2013 e 2015. Os pacientes inscritos estavam no protocolo IRSTB002, aprovado pelo Comitê de Ética do IRST – IRCCS AVR (25/10/2012, ver. 1). Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes. 1. Extração de DNA de fezes Use um kit para p…

Representative Results

O fluxo de trabalho deste protocolo é mostrado na Figura 1. O fluxo de trabalho fornece duas etapas de controle e ações diferentes de acordo com os resultados desta etapa. Em primeiro lugar, se uma amostra apresenta controles inadequados, a amplificação deve ser repetida. Em segundo lugar, se a amplificação for inibida, a amostra deve ser reprocessada desde o início ou classificada como não valiosa. A Figura 2 mostra as curvas de fluorescência produz…

Discussion

Estudos anteriores demonstraram que a análise da integridade do DNA das fezes extraídas por abordagens manuais e semiautomáticas pode representar uma ferramenta alternativa para a detecção precoce das lesões colorretais7,,8,,9,,10,,11,,12. Testes de triagem molecular e não invasivo foram desenvolvidos ao longo dos anos…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores não têm reconhecimentos.

Materials

1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free) Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Absolute Ethanol (quality of analytical degree) Reagent required for DNA extraction
Benchtop centrifuge  Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction
EasyPGX analysis software version 2.0.0 Diatech Pharmacogenetics RT800-SW Analysis software 
EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips Diatech Pharmacogenetics RT803 Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX qPCR instrument 96  Diatech Pharmacogenetics RT800-96 Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX ready FL-DNA Diatech Pharmacogenetics RT029 Kit required for the Real Time PCR assay
Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL) Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Powder-free disposable gloves Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
QIAamp Fast DNA Stool Qiagen 51604 Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool
Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL) Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Thermal block e.g. EasyPGX dry block Diatech Pharmacogenetics RT801 Instrument required for DNA extraction
Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml  Diatech Pharmacogenetics RT802 Instrument required for DNA extraction

References

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Cite This Article
Rengucci, C., De Maio, G., Menghi, M., Benzi, F., Calistri, D. Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. J. Vis. Exp. (160), e59426, doi:10.3791/59426 (2020).

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