本文介绍的诊断用FL-DNA试剂盒是一种省时且操作简便的方法，可用于确定结直肠癌病变存在的可靠概率。
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摘要
摘要
如今，粪便DNA可通过多种方法进行分离和分析。粪便中较长的DNA片段可通过qPCR检测，从而可靠地评估是否存在结直肠癌前病变或肿瘤性病变。该方法称为荧光长片段DNA检测（FL-DNA），是一种快速、无创的检测手段，是对现有初级预防体系的改进。该方法基于对粪便DNA完整性的评估，通过定量扩增基因组DNA的特定靶标实现。特别是，检测长度超过200 bp的DNA片段，可实现对结直肠病变患者的高特异性识别。然而，该系统以及目前所有可用的粪便DNA检测方法均存在一些需要解决的普遍问题（例如，检测应进行的频率，以及每位个体在每个时间点采集的最佳粪便样本数量）。但FL-DNA的主要优势在于，可将其与目前结直肠癌筛查项目中已使用的检测方法——基于免疫化学法的粪便隐血试验（iFOBT）联合应用。事实上，这两种检测可在同一样本上同时进行，从而降低成本，并更准确地预测结直肠病变的存在与否。
引言
结直肠癌（CRC）源于一个多阶段过程，健康的上皮细胞逐渐发展为腺瘤或息肉，并随时间推移进展为恶性癌1,2。尽管结直肠癌发病率较高，但在过去十年中，其死亡率呈下降趋势3。事实上，筛查项目中采用的早期诊断工具已实现了对癌前腺瘤或息肉的早期发现和切除4。然而，由于各种技术局限性，目前尚无一种方法能够达到理想效果。因此，为了提高敏感性和特异性，已提出多种粪便DNA检测方法，可单独使用或与现有的常规诊断检测联合使用5,6。
通常，健康的黏膜会向粪流中脱落凋亡的结肠上皮细胞，而病变的黏膜则会脱落非凋亡的结肠上皮细胞。长度在200 bp或以上的DNA片段是非凋亡DNA的特征。这种DNA被称为长链DNA（L-DNA），现已成为结直肠癌（CRC）早期诊断中可利用的生物标志物。L-DNA可从粪便样本中分离，并通过使用体外诊断FL-DNA试剂盒进行qPCR定量检测7,8,9,10,11,12。
该检测包含两个用于检测长度在138 bp至339 bp范围内的完整长链DNA（FL-DNA）片段的检测实验。每个实验均可扩增FL-DNA（FAM标记）以及内参 spike-in DNA（HEX标记）。为确保所有片段的最佳扩增效果，该检测被分为两个实验（命名为 "A" 和 "B"）。A 检测可识别第14外显子的两个区域 APC 基因（NM_001127511）和外显子7的一个片段 TP53 基因（NM_00127670）。B 检测可检测一段片段 外显子14的 APC 基因（NM_001127511）以及外显子5和8的两个区域 TP53 基因（NM_00127670）。这些检测无法区分所检测的区域。 spike-in DNA 对应于 Oncorhynchus keta 鲑鱼DNA，可用于验证操作流程是否正确，并检测可能存在的抑制物，以避免出现假阴性结果。FL-DNA浓度通过标准曲线法进行绝对定量，结果以ng/反应表示。
FL-DNA 方法是一种无创且经济的粪便 DNA 检测技术，与基于免疫化学的粪便隐血试验（iFOBT）联合使用，目前应用于结直肠癌筛查项目中，可更准确地预测结直肠癌和/或高风险腺瘤性病变12。
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方案
患者于2013年至2015年间在意大利梅尔多拉（FC，意大利）的罗马涅肿瘤研究与治疗科学研究所（IRST）招募。入组患者纳入由IRST - IRCCS AVR伦理委员会批准的协议IRSTB002（批准日期：2012年10月25日，版本1）。所有方法均按照相关指南和法规进行。所有患者均签署了书面知情同意书。
1. 从粪便中提取DNA
- 使用试剂盒制备粪便样本（参见材料表）。根据制造商说明书进行提取操作，选择并处理粪便材料。纯化后的DNA可直接进行扩增，或于-20 °C保存以备后续分析。
2. 阳性对照、标准品、加标 DNA 及临床样本的制备
- 标准品和样本的制备
- 为制备阳性对照、标准品、内参DNA以及所有临床样本，先将阳性对照、标准品和内参DNA的各份样品离心，然后加入适量提供的水重新悬浮各试剂（见下文）。随后，轻轻涡旋混匀阳性对照、标准品和内参DNA，再离心10秒。为确保干粉试剂完全重悬，在使用前将液体试剂在室温（RT）下静置30分钟。
- 阳性对照为人源DNA的干粉形式。每份样品用750 µL水重悬。
- 内参DNA为鲑鱼（Oncorhynchus keta）DNA，作为外源性内参对照，用于验证从粪便样本中提取的DNA是否存在可能的抑制物。每份样品用100 µL水重悬。
- 为制备标准曲线，从原液开始进行四次1:5倍比稀释。标准点浓度应分别为10 ng/反应、2 ng/反应、0.4 ng/反应和0.08 ng/反应。
- 为制备阳性对照、标准品、内参DNA以及所有临床样本，先将阳性对照、标准品和内参DNA的各份样品离心，然后加入适量提供的水重新悬浮各试剂（见下文）。随后，轻轻涡旋混匀阳性对照、标准品和内参DNA，再离心10秒。为确保干粉试剂完全重悬，在使用前将液体试剂在室温（RT）下静置30分钟。
- 1x内参DNA的制备
- 在使用前立即配制内参DNA对照。
- 通过将5 µL FL-DNa spike与20 µL无菌水混合来配制1x内参DNA对照。1x内参DNA对照的配制数量应根据待分析样本数量加上阳性对照的数量确定。
- 样本的制备
- 将75 µL样本（临床样本或阳性对照）与25 µL 1x内参DNA混合，总体积为100 µL。
3. 使用qPCR Easy PGX扩增并测定FL-DNA值
注意：针对人源 DNA 和内参对照的特异性引物和探针，其完整的扩增反应体系以冻干形式提供，分别装于 8 孔条状管中，即 FL-DNA Mix A 和 FL-DNA Mix B。标准品、阳性对照、阴性对照及待测样本必须同时使用两种冻干试剂混合物进行扩增。临床样本必须同时使用两种冻干试剂混合物进行双重复扩增。
- 参见材料表中的qPCR仪器及操作软件。
- 打开操作软件并设置板型和热循环程序：
- 按照表1所示设置板型：
- 将第1列所有8个孔位的孔类型设置为标准品。
- 将A2和B2孔的孔类型设置为无模板对照（NTC）。
- 将C2和D2孔（阳性对照）的孔类型设置为未知样品。
- 将其他所有孔位的孔类型设置为未知样品。
- 选中全部96个孔位，添加荧光染料FAM和HEX，点击同步板型（Sync Plate）。
- 根据表2设置热循环程序。
- 按照表1所示设置板型：
- 将所需数量的条带短暂离心10秒，使管内液体沉降至管底。
- 小心移除条带上的密封膜，注意防止液体损失，并向各对应条带中加入：阴性对照：20 µL 水；样品：20 µL DNA；标准曲线：20 µL 标准品1、2、3或4；阳性对照：20 µL 阳性对照。
- 使用8联管平头光学盖盖紧所有条带，涡旋振荡数秒钟。
- 将条带离心10秒后装入仪器，然后启动运行。
- 打开操作软件并设置板型和热循环程序：
4. 数据分析
注意：数据分析可根据所使用的软件选择自动或手动方式进行（参见材料表）。
- 运行结束后，选择 A、C、E、G 列用于“FAM：FL-DNA-A” 和 “HEX: IC，以及B、D、F、H列用于“FAM：FL-DNA-B”和“HEX: IC.
- 设置以下内容 标准起始量：A1和B1孔为10 ng/反应，C1和D1孔为2 ng/反应，E1和F1孔为0.4 ng/反应，G1和H1孔为0.08 ng/反应。
- 设置 阈值荧光 将FAM（FL-DNA A和FL-DNA B）和HEX（IC）通道的值均设为150。
- 在盒子中 结果表格, 点击 列选项 | 全选 | 好的 以获取两个通道中各自Cq（∆R）和∆R的最终数值结果。
注意：这些数值由实时 PCR 仪器软件提供。ΔR 最后值对应于归一化至最后一个扩增循环的荧光值。 - 在结果表格框中，右键单击表格以打开上下文菜单，然后单击 发送到 Excel 导出原始数据。
- 检查标准品的数值，以验证标准曲线的适用性。
- 对于每种FL-DNA混合物，检查R2 ["R² (∆R)" 列] 和效率 ["Efficiency (%)" 列] 的数值。如果它们处于可接受范围内，则可按照制造商说明书继续进行分析表3).
- 如果FAM通道的结果不在预期范围内，则删除标准曲线中的一个点并重新分析该次运行。
- 使用以下公式计算阴性对照和阳性对照的值，将“No Cq”值视为零：
- 将获得的数值与文献报道的数值进行比较 表4.
- 如果反应对照在预期值范围内，则继续进行样品分析。
注意：请验证获得的Cq值是否来源于真实的扩增反应（S型荧光曲线），而非来自人为假象（线性荧光曲线）。 - 为分析每个FL-DNA混合物中样本的适用性，需比较HEX通道的Cq值。若该值≥16，则继续进行样本分析；若该值＜16，则不宜用于后续分析。 <16 或无 Cq 值，可能由于 FL-DNA Spike 加样错误所致，因此无法分析样本。
- 使用以下公式计算阳性对照在“HEX”通道中的Cq值的平均值：
- 使用以下公式计算样本重复组在“HEX”通道中的Cq值的平均值：
- 根据以下公式计算 ∆CqHEX 值：
- 将样本的 ∆CqHEX 值与报告中的值进行比较 表5.
- 对于每种混合物（混合物A和混合物B），将FAM通道的Cq值与报告中的值进行比较 表6.
- 为确定每个合适样本的 FL-DNA 值，请使用以下公式，并将“No Cq”值视为零：
注意：根据 Rengucci 等人获得的 Fagan 线图结果，结直肠癌的风险和患病率取决于 iFOBT 和 FL-DNA 评估。12 (表7).
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结果
本方案的工作流程如图1所示。该流程包含两个质控步骤，并根据这些步骤的结果采取不同的操作。首先，如果样本的对照结果不符合要求，则必须重复扩增步骤。其次，如果扩增受到抑制，则必须从起始步骤重新处理样本，或将其判定为无检测价值。
图2显示了阳性样本和阴性样本产生的荧光曲线。（A）展示的是一个合适的阳性样本示例。该样本在HEX通道的信号处于可接受范围内，且FAM通道的阳性信号高于阈值。（B）展示的是一个合适的阴性/非阳性样本示例。该样本在HEX通道的信号处于可接受范围内，且FAM通道的阴性对照信号低于阈值。（C）展示的是一个不合适的样本示例。该样本在HEX通道的信号不在可接受范围内，因此可推测可能存在抑制作用。该样本必须从提取步骤开始重新检测。
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讨论
先前的研究表明，通过人工和半自动方法提取的粪便样本进行DNA完整性分析，可作为结直肠病变早期检测的一种替代工具7,8,9,10,11,12。多年来，已开发出多种用于结直肠癌检测的分子生物学无创筛查方法，但与其它筛查手段相比，这些方法因耗时较长且成本效益较差，其广泛应用受到限制。
这种方法相对便宜且不太耗时。由于新流程所需的 manual 步骤较少，因此在检测结直肠病变方面具有更高的准确性。本文所述方法操作快速、manual 步骤少，每周可轻松处理大量样本。DNA 提取过程无特殊困难，既可通过简单的 manual 操作完成，也可使用自动仪器进行。在后一种情况下，有必要确定能够获得最可重复结果的...
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披露
Maura Menghi 是 Diatech Pharmacogenetics srl 的全职员工。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 和 2 mL 聚丙烯旋盖管（无 DNase、RNase、无 DNA、无 PCR 抑制剂） | DNA 提取和实时 PCR 所需耗材 | ||
| 无水乙醇（分析纯级别） | DNA 提取所需试剂 | ||
| 台式离心机 | 最大转速为 20000 × g。DNA 提取所需仪器 | ||
| EasyPGX 分析软件版本 2.0.0 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | 分析软件 |
| EasyPGX 离心/涡旋 8 孔条 | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | 推荐用于实时 PCR 检测的仪器 |
| EasyPGX qPCR 96 孔仪器 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | 推荐用于实时 PCR 检测的仪器 |
| EasyPGX ready FL-DNA 试剂盒 | Diatech Pharmacogenetics | RT029 | 实时 PCR 检测所需试剂盒 |
| 微量移液器（体积范围 1 至 1.000 µL） | DNA 提取和实时 PCR 所需耗材 | ||
| 无粉一次性手套 | DNA 提取和实时 PCR 所需耗材 | ||
| QIAamp Fast DNA Stool 试剂盒 | Qiagen | 51604 | 推荐用于粪便样本 DNA 提取与纯化的试剂盒 |
| 无菌滤芯吸头（无 DNase、RNase，体积范围 1 至 1.000 µL） | DNA 提取和实时 PCR 所需耗材 | ||
| 加热模块，例如 EasyPGX 干式加热块 | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | DNA 提取所需仪器 |
| 涡旋振荡器，例如 EasyPGX 离心/涡旋 1.5 ml | Diatech Pharmacogenetics | RT802 | DNA 提取所需仪器 |
参考文献
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- Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
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- Levin, B., et al. Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology. Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).
- Bosch, L. J., et al. Molecular tests for colorectal cancer screening. Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).
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- De Maio, G., et al. Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis. World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).
- Rengucci, C., et al. Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection
Posted by JoVE Editors on 9/28/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. An affiliation was updated.
The first affiliation was updated from:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)
to:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy
