Summary
Her beskriver vi to ikke-invasive metoder til kronisk kontrol af neuronal aktivitet ved hjælp af chemogenetik i mus. Øjendråber blev brugt til at levere clozapin-N-oxid (CNO) dagligt. Vi beskriver også to metoder til forlænget administration af CNO i drikkevand. Disse strategier for kronisk neuronal kontrol kræver minimal intervention reducere dyrs stress.
Abstract
Chemogenetiske strategier er dukket op som pålidelige værktøjer til fjernstyring af neuronal aktivitet. Blandt disse er designer receptorer udelukkende aktiveret af designer drugs (DREADDs) blevet den mest populære kemogenetiske tilgang, der anvendes i moderne neurovidenskab. De fleste undersøgelser leverer ligand clozapin-N-oxid (CNO) ved hjælp af en enkelt intraperitoneal injektion, som er egnet til akut aktivering/hæmning af den målrettede neuronal population. Der er dog kun et par eksempler på strategier for kronisk graduering af DREADD-kontrollerede neuroner, hvoraf de fleste er afhængige af brugen af leveringssystemer, der kræver kirurgisk indgreb. Her udvider vi på to ikke-invasive strategier for at levere ligand CNO til kronisk manipulere neurale befolkning i mus. CNO blev administreret enten ved hjælp af gentagne (daglige) øjendråber eller kronisk gennem dyrets drikkevand. Disse ikke-invasive paradigmer resulterer i robust aktivering af designer receptorerne, der varede gennem hele CNO-behandlingerne. De metoder, der er beskrevet her, tilbyder alternativer til kronisk DREADD-medieret kontrol af neuronal aktivitet og kan være nyttige for eksperimenter designet til at evaluere adfærd i frit bevægende dyr, med fokus på mindre invasive CNO leveringsmetoder.
Introduction
Tekniske fremskridt inden for neurovidenskab har gjort det muligt forskerne til præcist at identificere og kontrollere aktiviteten af bestemte neuronal populationer1. Dette har bidraget til bedre at forstå grundlaget for neuronal kredsløb og deres indvirkning på dyrs adfærd, samt, revidere etablerede dogmer2,3. Blandt disse nye værktøjer har optogenetiske og chemogenetiske strategier haft en dybtgående indvirkning ikke kun på kvaliteten af opdagelser, men også på den måde eksperimenter er udtænkt og designet4. I det nuværende manuskript fokuserer vi på chemogenetiske strategier for at kontrollere aktivering af neuroner via manipuleret receptor-ligand strategier. Designer receptorer udelukkende aktiveret af designer drugs (DREADDs) repræsenterer en af de mest populære kemogenetiske værktøjer til fjernstyring af neuronal aktivitet, som anmeldt af Roth 20165. DREADDs udnytte modificerede muskarine acetylcholin receptorer, der er specifikt aktiveret af en inaktiv ligand, clozapin-N-oxid (CNO)6.
De fleste undersøgelser bruger CNO administreret af intraperitoneal (IP) injektioner, som effektivt kontrollerer dosering og timing af manipuleret receptorer aktivering i en akut måde. Men, når gentagen eller kronisk DREADD aktivering er påkrævet, brugen af flere IP injektioner bliver uopnåelig. For at løse dette problem er der rapporteret om forskellige strategier for kronisk CNO-levering, herunder implanterede mini pumper7 og intrakranielle kanyle8,9. Til forskellige extents, alle disse strategier forårsage dyrene stress og smerte10, og kræver en kirurgisk indgreb, der også kunne have en direkte indvirkning på de adfærdsmæssige svar skal testes11. Her beskriver vi tre ikke-invasive strategier for den kroniske CNO-levering.
Til dette formål blev mus stereotaxatisk injiceret i hippocampus med en adeno-associeret virus (AAV), der indkoder en manipuleret version af den excitatoriske M3 muskariske receptor (hM3Dq), som, når den aktiveres af ligand CNO, fører til den brast lignende fyring af neuroner6. Det har tidligere vist sig, at en enkelt øjendråbe, der indeholder CNO, effektivt kan fremkalde en robust aktivering af DREADD-udtrykte neuroner12. Her beskriver vi en modificeret metode til gentagen levering af øjendråber. For at opnå kronisk og vedvarende kontrol af designeren receptorer, vi næste beskrive en ikke-invasiv strategi for at levere CNO til mus gennem drikkevand. Endelig beskriver vi et alternativt paradigme for at levere CNO i drikkevand i et begrænset tidsrum vindue. Mus bevægeapparatet aktivitet, samt drikke adfærd og forbruget af søde kaloriefattige løsninger, er for det meste begrænset til den mørke del af lys/mørk cyklus13,14. Derfor vedtog vi en protokol baseret på musens præference for saccharose. Ved at måle induktion af den umiddelbare tidlige gene c-FOS i AAV-inficerede celler, som en udlæser for neuronal aktivering12,15, vi fandt, at disse CNO levering strategier robust aktivere dreadd-kontrollerede neuroner over forlænget Varigheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr blev håndteret i overensstemmelse med retningslinjerne fra Udvalget for dyrepasning og-anvendelse under det nationale Institut for mental sundhed (NIMH). Alle bestræbelser blev gjort for at minimere smerten og antallet af dyr, der anvendes.
1. adeno-associerede virus injektioner i hippocampus
Bemærk: Vildtype hanmus af blandet baggrund (B6/129 F1 hybrid, 3 måneder gammel) blev for stereotaxatisk injiceres med en AAV kodning af M3 muskarin receptor (hM3Dq) i hippocampus. Under hele forsøget, mus var enkelt-husede, under en regelmæssig 12 h lys: 12 h mørk (T24) cyklus, med adgang til mad og vand ad libitum.
- Inden du udfører stereotaxiske operationer, skal du rengøre og sterilisere stereotaksisk frame og alle nødvendige instrumenter.
Bemærk: kirurgiske gardiner kan bruges til at opretholde et sterilt felt og reducere musens varmetab. - Dybt anæstetize musen ved hjælp af isoflurane. For at gøre dette skal du først justere oxygen flowmåleren til ca. 1,5 L/min, og derefter justere isofluran vaporizer til ca. 3-5% for induktion og ca. 1-3% for vedligeholdelse.
- For at sikre, at dyret er fuldt bevidstløs, Knib musens pote; dyret er ordentligt bedøvet, når den at blinke svar at knibe er fraværende.
- Placer musen på en varmepude for at opretholde stabiliteten af musens kropstemperatur.
- Barberer toppen af hovedet og fastgør hovedet af musen til stereotaksisk ramme. Derefter, anvende okulær beskyttende smøremiddel på øjnene, rense overfladen ved skrubbe med povidon-jod og 70% ethanol, og udsætte kraniet ved hjælp af en steril skalpel.
- Kalibrer rammen til bregma punkt, så bor ved en medial-lateral koordinat på 2,9 mm og en anterior-posterior koordinat-2,7 mm for at målrette hippocampus.
Bemærk: Hvis andre hjernens mål skal injiceres, bestemmes de ønskede koordinater for injektion ved hjælp af Paxinos og Franklin Mouse Atlas16. - Når hjernen er eksponeret, indsprøjtes ensidigt 90 nL af AAV ved rygnings dybden på-3,0 mm i hippocampus ved hjælp af en mikroinjektor og trak mikrokapillar pipetter (figur 1a).
Bemærk: Se tabel over materialer til titer af AAV, der anvendes i dette eksperiment. For andre hjerneområder justeres AAV-Injektionsvolumen efter behov. - Ved afslutningen af den kirurgiske procedure, lukke indsnit med nylon suturer og anvende aktuel antibiotika til sårstedet.
- Administration af analgetika (buprenorphin, 0,1 mg/kg) systemisk umiddelbart efter operationen og 4-6 timer efter.
- Begyndende 4 uger efter injektion, subject mus til nogen af de paradigmer, der er beskrevet i det følgende afsnit til kronisk kontrol neuroner udtrykker designeren excitatoriske receptor.
2. gentagen CNO-levering ved hjælp af øjendråber
- Akklimerer dyrene til håndtering ved at scruffing hver mus 3 min dagligt i 3-4 dage før administration af øjendråber.
- Clozapin-N-oxid (CNO, 5 mg) opløses i 1 mL steril 0,9% saltvandsopløsning (stamopløsning: 5 mg CNO/mL). Opløsningen opbevares i køleskab ved 4 °C.
- Afvejes hver mus, før eksperimentet påbegyndes, for at bestemme mængden af CNO, der skal leveres. Brug 1-3 μL dråbe (pr. øje) for at opnå 1,0 mg CNO/kg legemsvægt.
Bemærk: som et eksempel, en 20 g mus bør modtage bilateral (2 μL hver) øjendråber. - Levér øjendråber under den inaktive (lette) fase af mus, 2 timer før lys slukker (zeitgeber tid (ZT) 10). I tilfælde, hvor CNO skal leveres under den aktive (mørke) fase af mus, sikre tilstedeværelsen af svagt rødt lys for korrekt dyre håndtering.
Bemærk: der bør træffes forholdsregler for at undgå at forstyrre den cirkadiske (og den lette/mørke) cyklus af forsøgsdyr.- Brug en P10-mikropipette til at indlæse den påkrævede mængde (1-3 μL) CNO-opløsning for at opnå 1,0 mg CNO/kg.
Bemærk: Brug en ny og steril pipettespids til hvert øje-drop. I dette sæt eksperimenter blev der udført bilaterale øjendråber af CNO; men hvis der er behov for en lavere CNO-koncentration, kan ensidige øjendråber også anvendes. - Immobilize musen via Scruff.
- Udfør langsomt opløsningen, indtil der dannes stabile dråbe former på pipettespidsen.
- Medbring forsigtigt dråbe tæt på hornhinden i musens øje, indtil opløsningen er leveret. Pipettespidsen bør aldrig kontakte musens øje.
- Slip musen, placere den tilbage i sin hjem bur.
- Brug en P10-mikropipette til at indlæse den påkrævede mængde (1-3 μL) CNO-opløsning for at opnå 1,0 mg CNO/kg.
- Gentag denne procedure hver dag i 5 dage.
Bemærk: denne varighed kan justeres i forhold til forsøgskravene. - Til kontrol eksperimenter anvendes der AAV/DREADD-injicerede mus, som udsættes for Sham-behandling (øjendråber, der kun indeholder saltvandsopløsning), og mus, som injiceres med en tom vektor (f. eks. AAV/mCherry), som er eksponeret for den beskrevne CNO Eye-Drops-protokol.
3. kronisk CNO-behandling leveret gennem drikkevand
- Lav små flasker ved hjælp af 50 mL (plastik) koniske rør og gummiprop spouts; dæk med aluminiumsfolie for at undgå enhver let-medieret effekt på CNO stabilitet.
- Tre dage før du starter med CNO-behandlingen, skal du udskifte almindelige vandflasker med små flasker, der indeholder 10 mL almindeligt vand, for at give mus mulighed for at acclimere dem. Fastgør flaskerne til burene ved hjælp af tape.
- Mål det daglige vandforbrug for hver mus.
- Afvejes hver mus, før eksperimentet påbegyndes.
- Clozapin-N-oxid (CNO, 5 mg) opløses i 1 mL 0,9% steril saltvandsopløsning. Stamopløsningen opbevares ved 4 °C.
- Brug kropsvægten og den gennemsnitlige mængde vand, der forbruges til at definere koncentrationen af CNO-opløsning for at opnå 1,0 mg CNO/kg (legemsvægt).
Bemærk: voksne hanmus (~ 20 g legemsvægt) bruger ~ 5 mL vand pr. dag (figur 2a). For at opnå en CNO-koncentration på 1 mg CNO/kg bør der derfor tilsættes 6,4 μL CNO-stamopløsning til en endelig volumen på 8 mL vand (slutkoncentration: 4 μg CNO/mL). Således, dosis af CNO for en 20 g dyr, der drikker 5 mL vand pr. dag resulterer i 1 mg CNO/kg. - Bestem den optimale CNO-dosis, der viser maksimal effektivitet med minimal CNO-koncentration ved at teste en række koncentrationer. Foretag en analyse af dosisrespons for at bestemme den optimale CNO-dosis for drikkevands metoden.
Bemærk: følgende CNO-doser blev testet for dette eksperiment: 1,0 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,1 mg/mL og saltvand. 1,0 mg CNO/kg blev først afprøvet, baseret på IP-og øjendråber-protokoller. - På dag 1 fyldes flasken med 8 mL almindeligt vand og tilsættes den nødvendige mængde CNO.
Bemærk: denne mængde vand er nok til 24 h af ad libitum vand adgang for en voksen mandlig mus. Hvis der anvendes andre gnaverarter, skal du først måle mængden af vand, der forbruges dagligt for at bestemme den nødvendige mængde. - Overvåge dyrenes sundhed i hele protokollen for at sikre, at der ikke er nogen negative bivirkninger forårsaget af vand + CNO forbrug.
- Efter 24 h, Udskift flaskerne med ferskvand + CNO opløsning. Optag den forbrugte mængde i den foregående dag.
- Smid vand + CNO-opløsningen ud, som ikke blev forbrugt i affaldsbeholdere. Kassér plastikflasker og Udskift gummipropperne hver dag, efter rensning af dem i henhold til dyre facilitetens retningslinjer.
Bemærk: Bland ikke vandigt affald med organiske opløsningsmidler. Kontakt kemikalie bortskaffelses tjenesten for at få oplysninger om opbevaring og afhentning. - Udskift flaskerne på samme tidspunkt hver dag i 5 dage.
Bemærk: denne varighed kan justeres i forhold til forsøgskravene. - Medtag kontrolgrupper som beskrevet i trin 2,6.
4. begrænset CNO-behandling ved hjælp af musene præference for saccharose
- 3 dage før du starter med CNO-behandlingen, placeres en lille flaske indeholdende 10 mL vand + 1% saccharose på buret, helst væk fra den oprindelige vandflaske.
Bemærk: Brug de samme små flasker, der er beskrevet i trin 3,1. - Udsætter dyrene for vand + 1% saccharose i den sidste del af deres aktive fase (ZT 18 – 24). Efter denne eksponering fjernes flasken med vand + saccharose fra buret.
Bemærk: forskellige tidsvinduer af CNO-levering kunne anvendes. Desuden kan mus placeres under en inverteret lys/mørk cyklus, hvor lysets indtræden opstår i aften timer for at lette CNO levering. - Mål det daglige vand + 1% saccharoseforbrug for hver mus.
- Afvejes hver mus, før eksperimentet påbegyndes.
- Brug kropsvægten og den gennemsnitlige mængde vand + 1% saccharose, der forbruges for at bestemme dosen af CNO-opløsningen for at opnå 1,0 mg CNO/kg (legemsvægt).
Bemærk: den optimale CNO-dosis, der viser maksimal effektivitet med minimal CNO-koncentration, skal testes som forklaret i trin 3,6. - På dag 1 fyldes flasker med 5 mL vand + 1% saccharose + CNO (1 mg CNO/kg) og placeres på buret (altid på samme sted) i det fastsatte tidsvindue.
- I slutningen af den begrænsede tid vindue, fjerne flaskerne og måle mængden af vand + saccharose + CNO forbruges.
Bemærk: materialer og opløsninger desinficeres eller kasseres som tidligere beskrevet i trin 3,11. - Gentag denne procedure hver dag i 5 dage.
Bemærk: denne varighed kan justeres i forhold til forsøgskravene. - Medtag en kontrolgruppe som beskrevet i trin 2,6.
5. data analyse
- Perfuse mus intracardially med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) enten 2 eller 6 h efter at have modtaget den sidste gentagne (5. dag) CNO Eye-drop. Når CNO leveres gennem drikkevand, erstatte CNO + vand med vand i slutningen af musens aktive fase, derefter perfuse musen efter enten 2 eller 6 h post-CNO adgang.
Bemærk: hvis lys eksponering kan påvirke c-FOS induktion i det område af interesse, holde mus i konstant mørke i den sidste dag i forsøgene, og før perfusion. - Omhyggeligt dissekere hjernen ud og nedsænkes i 4% PFA løsning for 9-12h.
- Efter PFA fiksering, cryoprotect hjernevæv ved hjælp af en 30% saccharose opløsning (vente, indtil hjernen synker), derefter afsnit hjernen ved hjælp af en kryostat.
- De koronale hjerne sektioner (35 μm) overføres til en opløsning, der indeholder 1x PBS, 10% bovint serumalbumin og 0,3% Triton X-100 i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkuber hjerne sektionerne med en anti-c-FOS (1:2500) antistof opløsning ved 4 °C natten over med konstant agitation.
- Efter 3 skylninger af 5 min hver med en opløsning, der indeholder 1x PBS og 0,3% Triton X-100, inkubaterer prøverne med en Alexa-konjugeret sekundær antistof (1:500) opløsning i 1 time ved stuetemperatur væk fra lys og med konstant agitation.
- Få digitale billeder ved hjælp af et Konfokal mikroskop. Saml og Behandl optagede billeder med en billedredigerings-og analyse software (f. eks.
- For dataanalyse, skitsere og måle AAV-inficerede område (mCherry (+) celler) ved hjælp af ImageJ software, og kvantificere antallet af c-FOS (+) celler i denne region for at opnå antallet af aktiverede celler pr område. Kombinere de opnåede resultater fra 3 separate sektioner pr. dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi bemærkede, at gentagne CNO-levering ved hjælp af øjendråber fremkaldte en robust induktion af c-FOS-ekspression i de fleste inficerede neuroner (figur 1c), hvilket viser, at effektiviteten af CNO-levering opretholdes under gentagen eksponering. Desuden blev der observeret en signifikant induktion af c-FOS i prøver indsamlet 2 timer efter behandling med CNO, sammenlignet med prøver opnået 6 timer efter CNO-eksponering (figur 1d-E), hvilket viser, at ændringer induceret af CNO er tidsafhængige.
Derefter målte vi effektiviteten af den kroniske CNO-behandling, der blev leveret gennem drikkevand. Vi bemærkede, at det daglige forbrug af vand + CNO ikke var signifikant forskelligt i forhold til den samlede mængde almindeligt forbrugt vand (figur 2a). På samme måde blev mængden af vand + 1% saccharose, der forbruges i løbet af natten (6 timer), ikke påvirket af tilføjelsen af CNO (figur 2b). Der blev desuden ikke konstateret nogen forskelle i det daglige forbrug (5 dage) af både vand + CNO (figur 2c) og vand + saccharose + CNO (figur 2D) i hele forsøget for alle dyrene.
Svarende til hvad vi fandt ved hjælp af CNO øjendråber, robust induktion af c-FOS blev observeret efter 2 h, men ikke 6 h ved CNO adgang (figur 2E-F).
Endelig målte vi dosisrespons af CNO tilsat til drikkevand. For at gøre dette, mus blev udsat for følgende CNO doser: 1,0 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,1 mg/mL, saltvand. I alle tilfælde, dyr blev perfekt gjort 2 h efter CNO eksponering. Vi konstaterede, at der er en klar tærskel for effektivitet for CNO, hvor en lav CNO-dosis (0,1 mg/mL) ikke fremkalder c-FOS-aktivering sammenlignet med saltvands kontrol, hvorimod højere doser (0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL og 1,0 mg/mL) inducerede robust og lignende induktion af c-FOS ( Figur 2G).
Figur 1: gentagen CNO-levering ved hjælp af øjendråber. (A) AAV/HM3Dq-mcherry blev stereotaxatisk injiceret i hippocampus af voksne (3 måneder gamle) hanmus. B) fire uger efter injektionen blev CNO administreret med øjendråber én gang dagligt i 5 på hinanden følgende dage. Der blev anvendt en dosis på 1,0 mg CNO/kg. (C) Endelig blev mus ofret, og hjernevæv blev testet for C-FOS (grøn) immunoreactivity i det AAV-inficerede område (mcherry-positive celler, rød). En repræsentativ koronal del af injektionsstedet og den CNO-medierede c-FOS-aktivering vises. D) antallet af c-FOS-positive celler i det AAV-inficerede område blev målt i mus, der blev perfekt gjort 2 eller 6 timer efter den sidste CNO-administration. Data er middelværdien ± SEM. * * * p < 0,001; af elevens t-test (n = 2-3 mus). (E) der vises repræsentative billeder for de to grupper. Scale bar: 100 μm Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: kronisk CNO-behandling leveret gennem drikkevand. A) der blev ikke observeret forskelle i det samlede flydende forbrug mellem kontrol (vand) eller behandlet (vand + CNO, dosis: 1,0 mg CNO/kg) dyr. Data er middelværdien ± SEM (n = 13-14 mus). B) på samme måde blev der ikke observeret signifikante forskelle i mængden af vand + 1% saccharose (i løbet af en 6-h-periode) efter tilsætning af cno (1,0 mg/kg). Data er middelværdien ± SEM (n = 5 mus). C) det daglige forbrug af vand + CNO (1,0 mg/kg) for de enkelte mus vises. Der blev ikke observeret nogen forskelle i det daglige forbrug. Data er middelværdien ± SEM (n = 5 mus). D) det daglige væske forbrug (i et 6-h-tidsrum) på 1% saccharose + cno (1,0 mg/kg) for de enkelte mus vises. Der blev ikke observeret nogen forskelle i det daglige forbrug. Data er middelværdien ± SEM (n = 3 mus). (E) 2 eller 6 timer efter den sidste CNO administration blev mus ofret, og antallet af c-FOS positive celler blev kvantificeret i det AAV-inficerede område. Data er middelværdien ± SEM. * * * p < 0,001; af elevens t-test (n = 5 mus). (F) hjerne koronale sektioner blev testet for c-FOS (grøn) immunoreactivity i de AAV-inficerede (mcherry-positive celler, rød) region. Repræsentative billeder vises. G) der blev administreret fire CNO-doser (0,1, 0,25, 0,5 og 1,0 mg CNO/kg), og c-FOS-induktionen blev målt. Data er middelværdien ± SEM. * * * p < 0,001; af ANOVA efterfulgt af Tukey's test (n = 2 mus). Scale bar: 100 μm Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DREADDs er dukket op som en populær og effektiv tilgang til fjernt manipulere neuronal aktivitet17. Udformningen af alternative strategier for CNO levering vil stort set øge spektret af muligheder til rådighed for specifikke eksperimentelle indstillinger. Desuden, ikke-invasive strategier for levering af CNO minimere enhver potentiel fejlfortolkning af resultater ved at reducere bivirkninger, der direkte kan påvirke dyrets helbred. Her beskrev vi to ikke-invasive strategier for CNO-levering, der giver en robust aktivering af DREADDs (hM3Dq) og tilbyder et bredt spektrum af muligheder. Desuden mener vi, at de protokoller, der er beskrevet her, også kan være nyttige for forskellige DREADD-varianter til neuronal manipulation, herunder genmanipulerede muskarine-eller opioid-receptorer.
CNO levering ved hjælp af gentagne øjendråber repræsenterer en smertefri alternativ til gentagne intraperitoneale CNO injektioner samtidig bevare magt til præcist at kontrollere dosering og timing af CNO levering. Derfor anbefaler vi, at du bruger denne protokol, når der kræves gentagen DREADD-aktivering. Øjendråber er også den billigste mulighed for CNO levering, især i forhold til protokollen ved hjælp af CNO tilsat til drikkevandet. CNO leveret gennem drikkevand, på den anden side, giver en kronisk og vedvarende aktivering af DREADDS, undgå enhver mus håndtering. Det er vigtigt at nævne, at denne protokol mangler præcis kontrol over timingen af CNO levering. En tredje alternativ, tidsbegrænset adgang til en saccharoseopløsning, der indeholder CNO, kombinerer fordelene ved begge de tidligere diskuterede protokoller. Denne strategi er på samme tid ikke-invasiv, repetitive og let at udføre. Derudover, det giver en bedre kontrol af timingen af CNO levering sammenlignet med 24 h adgang til vand med CNO. En advarsel om denne fremgangsmåde er, at den kun kan anvendes i den aktive fase af dyrene. Vi anbefaler at bruge begge strategier, der involverer CNO i drikkevand i kombination med infrarøde kameraer eller et Lick-o-meter system for at opnå præcise tidsmæssige oplysninger om CNO-forbrug og dermed DREADD-aktivering.
Der er tidligere indberettet langtidsholdbare virkninger af CNO leveret gennem drikkevand. Vi har med succes anvendt en kronisk CNO (5 μg/mL) behandling i 14 på hinanden følgende dage15 for at evaluere de adfærdsmæssige konsekvenser af tonic aktivering af en thalamo-kortikale kredsløb involveret i humør kontrol. Alternativt, CNO leveres i drikkevandet i en koncentration på 40 mg/L er blevet brugt til at kronisk modulere aktiviteten af serotonerge neuroner i rygningen raphe Nucleus18, mens funktionen af bugspytkirtel β-celler blev kontrolleret ved hjælp af CNO ved en koncentration på 0,25 mg/mL vand19. Tilsammen tyder disse resultater på, at forskellige CNO-koncentrationer kan indstilles til effektivt at kontrollere DREADDs. Her fandt vi, at forskellige doser af CNO tilsat til drikkevand fremkaldte lignende c-FOS aktivering, tyder på, at en dosis-responsanalyse bør udføres for at definere den laveste og effektive CNO dosis kræves. Nylige undersøgelser har vist, at CNO ikke er helt farmakologisk inert20; Desuden blev det også påvist, at in vivo aktivering af DREADDs er medieret af CNO metabolit clozapin, som har flere endogene mål21. Derfor, forfatterne foreslår at bruge subthreshold doser af clozapin, i stedet for høje CNO doser. Selv om vi ikke har evalueret effektiviteten af clozapin i de beskrevne metoder, vi fandt, at CNO koncentration kunne reduceres uden signifikant at reducere neuronal aktivering, og derfor, at minimere bivirkninger forårsaget af CNO-til-clozapin Konvertering.
Kort sagt repræsenterer de her præsenterede strategier potentielle ordninger for CNO-levering, der let kan tilpasses til en række eksperimentelle designs. De blev udtænkt som ikke-invasive strategier, der kan være nyttige for gentagen eller kronisk CNO-medieret aktivering af DREADD-kontrollerede neuroner, hvilket reducerer virkningen af CNO levering på dyrs adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af murene Research program på National Institute of Mental Health (ZIA MH002964-02). Vi vil gerne takke støtte fra NIMH IRP gnaver adfærdsmæssige kerne (ZIC MH002952).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 inch |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5 mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 mL |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µL) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3 x 1012 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
References
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
- Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
- Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
- Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
- Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
- Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).
- LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. Neuroscience. 349, 229-238 (2017).
- Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
- Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
- MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
