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Neuroscience

DREADD-नियंत्रित न्यूरोनल गतिविधि के पुराने हेरफेर के लिए गैर इनवेसिव रणनीतियाँ

Published: August 25, 2019 doi: 10.3791/59439
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Section on Light and Circadian Rhythms (SLCR), National Institute of Mental Health, 2Howard Hughes Medical Institute, Department of Neuroscience, Scripps Research Institute

Summary

यहाँ हम चूहों में chemogenetics का उपयोग कर न्यूरोनल गतिविधि को लंबे समय से नियंत्रित करने के लिए दो गैर इनवेसिव तरीकों का वर्णन. नेत्र-बूंदों का उपयोग रोजाना क्लोज़ापिन-एन-ऑक्साइड (सीएनओ) देने के लिए किया जाता था। हम भी पीने के पानी में CNO के लंबे समय तक प्रशासन के लिए दो तरीकों का वर्णन. पुरानी न्यूरॉन नियंत्रण के लिए इन रणनीतियों जानवरों के तनाव को कम करने के कम से कम हस्तक्षेप की आवश्यकता है.

Abstract

Chemogenetic रणनीतियों न्यूरॉन गतिविधि के रिमोट कंट्रोल के लिए विश्वसनीय उपकरण के रूप में उभरा है. इनमें से, डिजाइनर रिसेप्टर्स विशेष रूप से डिजाइनर दवाओं द्वारा सक्रिय (DREADDs) आधुनिक तंत्रिका विज्ञान में इस्तेमाल सबसे लोकप्रिय chemogenetic दृष्टिकोण बन गए हैं. अधिकांश अध्ययन एक एकल इंट्रापेरिटोनल इंजेक्शन का उपयोग करके लिगन्ड क्लोज़ापिन-एन-ऑक्साइड (सीएनओ) प्रदान करते हैं, जो लक्षित न्यूरोनल आबादी के तीव्र सक्रियण/अवरोध के लिए उपयुक्त है। वहाँ रहे हैं, तथापि, केवल DREADD नियंत्रित न्यूरॉन्स की पुरानी मॉडुलन के लिए रणनीतियों के कुछ उदाहरण, जिनमें से अधिकांश प्रसव प्रणाली है कि शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप की आवश्यकता के उपयोग पर भरोसा करते हैं. यहाँ, हम लंबे समय से चूहों में तंत्रिका आबादी में हेरफेर करने के लिए ligand CNO देने के लिए दो गैर इनवेसिव रणनीतियों पर विस्तार. CNO या तो दोहराव (दैनिक) आंख की बूंदों का उपयोग करके प्रशासित किया गया था, या लंबे समय से जानवर के पीने के पानी के माध्यम से. इन गैर इनवेसिव प्रतिमानों डिजाइनर रिसेप्टर्स कि CNO उपचार भर में बनी के मजबूत सक्रियण में परिणाम. यहाँ वर्णित तरीकों न्यूरोनल गतिविधि के पुराने DREADD मध्यस्थता नियंत्रण के लिए विकल्प प्रदान करते हैं और स्वतंत्र रूप से चलती जानवरों में व्यवहार का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन प्रयोगों के लिए उपयोगी हो सकता है, कम इनवेसिव CNO वितरण विधियों पर ध्यान केंद्रित.

Introduction

तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में तकनीकी प्रगति ने वैज्ञानिकों को विशेष न्यूरोनल जनसंख्या 1 की गतिविधि की ठीक पहचान करने और नियंत्रित करने की अनुमति दीहै. इससे न्यूरोनल सर्किट के आधार और पशुओं के व्यवहार पर उनके प्रभाव को बेहतर ढंग से समझने में योगदान हुआ है, साथ ही स्थापित हठधर्मिता2,3में संशोधन करने में भी योगदान दिया है। इन उपन्यास उपकरणों में, ऑप्टोजेनेटिक और रसायन-आनुवंशिक रणनीतियों का न केवल खोजों की गुणवत्ता पर गहरा प्रभाव पड़ा है बल्कि प्रयोगों की कल्पना और डिजाइन किए जाने के तरीके पर भी गहरा प्रभाव पड़ाहै 4. वर्तमान पांडुलिपि में, हम इंजीनियर रिसेप्टर-लिगंड रणनीतियों के माध्यम से न्यूरॉन्स के सक्रियण को नियंत्रित करने के लिए chemogenetic रणनीतियों पर ध्यान केंद्रित. डिजाइनर रिसेप्टर्स विशेष रूप से डिजाइनर दवाओं द्वारा सक्रिय (DREADDs) न्यूरॉन गतिविधि के रिमोट कंट्रोल के लिए सबसे लोकप्रिय chemogenetic उपकरणों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं, के रूप में Roth द्वारा की समीक्षा की 20165. DREADDs संशोधित muscarinic acetylcholine रिसेप्टर्स कि विशेष रूप से एक निष्क्रिय ligand, clozapine-एन-ऑक्साइड (CNO)6द्वारा सक्रिय कर रहे हैं का उपयोग करें.

अधिकांश अध्ययनों में इंट्रापर्टोनियल (आई.पी.) इंजेक्शन द्वारा प्रशासित CNO का उपयोग करें, जो प्रभावी रूप से एक तीव्र फैशन में इंजीनियर रिसेप्टर्स सक्रियण की खुराक और समय को नियंत्रित करता है। हालांकि, जब दोहराव या पुरानी DREADD सक्रियण की आवश्यकता है, कई i.p. इंजेक्शन का उपयोग unfeasible हो जाते हैं. इस मुद्दे का समाधान करने के लिए, पुरानी CNO वितरण के लिए विभिन्न रणनीतियों की सूचना दी गई है, जिसमें प्रत्यारोपित मिनीपंप7 और इंट्राक्रैनियल कैनुला8,9 शामिलहैं। अलग अलग हद तक, इन सभी रणनीतियों जानवरों तनाव और दर्द10का कारण है, और एक शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप है कि भी व्यवहार प्रतिक्रियाओं पर सीधा प्रभाव हो सकता है की आवश्यकता का परीक्षण किया जा करने के लिए11. यहाँ, हम पुरानी CNO वितरण के लिए तीन गैर इनवेसिव रणनीतियों का वर्णन.

इस उद्देश्य के लिए, चूहों को एक एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) के साथ हिप्पोकैम्पस में स्टीरियोटैक्सिक रूप से इंजेक्ट किया गया था, जो उत्तेजक एम 3 मस्कारिनिक रिसेप्टर (एचएम3डीक्यू) के इंजीनियर संस्करण को एन्कोडिंग करता है जो लिगन्ड सीएनओ द्वारा सक्रिय होने पर फट-जैसे फायरिंग की ओर जाता है न्यूरॉन्स6| यह पहले से पता चला था कि CNO युक्त एक आंख ड्रॉप प्रभावी ढंग से DREADD-expressing न्यूरॉन्स12के एक मजबूत सक्रियण प्रकाश में लाना कर सकते हैं. यहाँ हम आंखों की बूंदों के दोहराव वितरण के लिए एक संशोधित विधि का वर्णन. डिजाइनर रिसेप्टर्स की पुरानी और निरंतर नियंत्रण प्राप्त करने के लिए, हम अगले पीने के पानी के माध्यम से चूहों को CNO देने के लिए एक गैर इनवेसिव रणनीति का वर्णन. अंत में, हम एक प्रतिबंधित समय खिड़की के दौरान पीने के पानी में CNO देने के लिए एक वैकल्पिक प्रतिमान का वर्णन. चूहे चलन गतिविधि, साथ ही पीने के व्यवहार और मिठाई गरमी समाधान की खपत, ज्यादातरप्रकाश के अंधेरे भाग तक ही सीमित हैं / इसलिए, हम sucrose के लिए माउस की पसंद के आधार पर एक प्रोटोकॉल अपनाया. AAV संक्रमित कोशिकाओं में तत्काल-early जीन सी-Fos के प्रेरण को मापने के द्वारा, न्यूरॉन सक्रियण के लिए एक readout के रूप में12,15,हमने पाया कि इन CNO वितरण रणनीतियों मजबूती से विस्तारित पर DREADD नियंत्रित न्यूरॉन्स सक्रिय Durations.

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Protocol

सभी जानवरों को राष्ट्रीय मानसिक स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएमएच) के पशु देखभाल और उपयोग समितियों के दिशानिर्देशों के अनुसार संभाला गया था। दर्द और इस्तेमाल किए गए जानवरों की संख्या को कम करने के लिए सभी प्रयास किए गए।

1. हिप्पोकैम्पस में एडेनो-संबद्ध वायरस इंजेक्शन

नोट: मिश्रित पृष्ठभूमि के जंगली प्रकार के पुरुष चूहों (B6/129 F1 संकर, 3 महीने पुराने) stereotaxically एक AAV के साथ इंजेक्शन के लिए थे M3 muscarinic रिसेप्टर एन्कोडिंग (hM3DQ) हिप्पोकैम्पस में. पूरे प्रयोग के दौरान, चूहों एकल घर थे, एक नियमित रूप से 12 एच प्रकाश के तहत: 12 एच अंधेरे (T24) चक्र, भोजन और पानी विज्ञापन libitumके लिए उपयोग के साथ.

  1. स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी प्रदर्शन करने से पहले, स्वच्छ और stereotaxic फ्रेम और सभी की जरूरत उपकरणों बाँझ।
    नोट: सर्जिकल पर्दे एक बाँझ क्षेत्र को बनाए रखने और माउस की गर्मी के नुकसान को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. इसतरह का उपयोग करके माउस को गहराई से एनेस्थेटाइज करें। ऐसा करने के लिए, पहले लगभग 1.5 L/मिनट के लिए ऑक्सीजन प्रवाह मीटर समायोजित करें, और फिर शामिल करने के लिए लगभग 3-5% और रखरखाव के लिए लगभग 1-3% करने के लिए isoflurane vaporizer समायोजित करें।
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए कि जानवर पूरी तरह से बेहोश है, माउस के पंजा को चुटकी; जब चुटकी के लिए लात प्रतिक्रिया अनुपस्थित है जानवर ठीक से एनेस्थेटाइज किया जाता है।
  3. माउस के शरीर के तापमान की स्थिरता बनाए रखने के लिए माउस को हीटिंग पैड पर रखें।
  4. सिर के शीर्ष दाढ़ी और stereotaxic फ्रेम करने के लिए माउस के सिर को ठीक. फिर, आंखों पर नेत्र सुरक्षात्मक स्नेहक लागू करें, पोविडोन-आयोडीन और 70% इथेनॉल के साथ स्क्रबिंग करके सतह को साफ करें, और एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके खोपड़ी को बेनकाब करें।
  5. bregma बिंदु करने के लिए फ्रेम अंशांक, तो 2.9 मिमी और एक पूर्वकाल-पश्चीय निर्देशांक -2.7 मिमी हिप्पोकैम्पस को लक्षित करने के लिए एक मध्यम-पक्षीय निर्देशांक पर ड्रिल।
    नोट: यदि अन्य मस्तिष्क लक्ष्य इंजेक्शन की जरूरत है, Paxinos और फ्रेंकलिन माउस एटलस16का उपयोग कर इंजेक्शन के लिए वांछित निर्देशांक निर्धारित करते हैं.
  6. एक बार मस्तिष्क के संपर्क में आने के बाद, एक माइक्रोइंजेक्टर का उपयोग करते हुए हिप्पोकैम्पस में -3.0 मिमी की पृष्ठीय-वेंट्रल गहराई पर एएवी के 90 एनएल को एक माइक्रोइंजेक्शन और खींचा गया माइक्रोकैपिलरी पिपेट्स (चित्र 1क)।
    नोट: इस प्रयोग में प्रयुक्त AAV के titer के लिए सामग्री की तालिका देखें. अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए, की जरूरत के रूप में इंजेक्शन की AAV मात्रा को समायोजित.
  7. शल्य प्रक्रिया के अंत में, नायलॉन टांके के साथ चीरा बंद करें और घाव साइट पर सामयिक एंटीबायोटिक दवाओं को लागू करें।
  8. सर्जरी के तुरंत बाद, और 4-6 घंटे बाद एनाल्जेसिक (ब्यूप्रेनोर्फिन, 0.1 मिलीग्राम/किग्रा) व्यवस्थित रूप से प्रशासित करें।
  9. 4 सप्ताह के बाद इंजेक्शन की शुरुआत, विषय चूहों निम्नलिखित अनुभाग में वर्णित प्रतिमानों में से किसी के लिए लंबे समय से नियंत्रित न्यूरॉन्स डिजाइनर उत्तेजक रिसेप्टर व्यक्त करने के लिए.

2. दोहराव CNO वितरण आंख की बूंदों का उपयोग कर

  1. आंखों की बूंदों के प्रशासन से पहले 3-4 दिनों के लिए प्रत्येक माउस 3 मिनट दैनिक scruffing द्वारा संभाल करने के लिए जानवरों acclimate.
  2. Clozapine-N-ऑक्साइड भंग (CNO, 5 मिलीग्राम) में 1 एमएल बाँझ 0.9% नमकीन समाधान (स्टॉक समाधान: 5 मिलीग्राम CNO / घोल को 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में रखें।
  3. वितरित किए जाने वाले CNO की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रयोग शुरू करने से पहले प्रत्येक माउस का वजन करें. 1-0 मिलीग्राम CNO/ किलो शरीर के वजन को प्राप्त करने के लिए 1-3 डिग्री एल ड्रॉप (प्रति आंख) का उपयोग करें।
    नोट: एक उदाहरण के रूप में, एक 20 ग्राम माउस द्विपक्षीय प्राप्त करना चाहिए (2 $L प्रत्येक) आंख की बूंदों.
  4. चूहों के निष्क्रिय (प्रकाश) चरण के दौरान आंख की बूंदों उद्धार, 2 एच से पहले रोशनी बंद कर देते हैं(zeitgeber समय (जेडटी) 10). मामलों में जहां CNO चूहों के सक्रिय (अंधेरे) चरण के दौरान वितरित करने की जरूरत है, उचित पशु से निपटने के लिए मंद लाल बत्ती की उपस्थिति सुनिश्चित करें.
    नोट: प्रयोगात्मक जानवरों के सर्कैडियन (और प्रकाश/अंधेरे) चक्र को बाधित करने से बचने के लिए सावधानियां बरतनी चाहिए।
    1. एक P10 micropipette का उपयोग करना, आवश्यक राशि लोड (1-3 $L) CNO समाधान के लिए प्राप्त करने के लिए 1.0 मिलीग्राम CNO /
      नोट: प्रत्येक आंख ड्रॉप के लिए एक नया और बाँझ पिपेट टिप का प्रयोग करें। प्रयोगों के इस सेट में, CNO के द्विपक्षीय आँख बूँदें प्रदर्शन किया गया; हालांकि, अगर एक कम CNO एकाग्रता की आवश्यकता है, एकतरफा आँख बूँदें भी लागू किया जा सकता है.
    2. स्क्रफ के माध्यम से माउस को स्थिर करें।
    3. धीरे धीरे पाइपेट टिप पर एक स्थिर छोटी बूंद रूपों जब तक समाधान निष्कासित।
    4. ध्यान से बूंद माउस की आंख की कॉर्निया के करीब लाने के लिए जब तक समाधान दिया जाता है. पिपेट टिप को माउस की आंख से कभी संपर्क नहीं करना चाहिए।
    5. माउस रिलीज, यह अपने घर पिंजरे में वापस रखकर.
  5. इस प्रक्रिया को हर दिन 5 दिनों के लिए दोहराएँ.
    नोट: इस अवधि प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार समायोजित किया जा सकता है.
  6. नियंत्रण प्रयोगों के लिए, AAV/DREADD-इंजेक्शन चूहों का उपयोग करने के लिए शर्म उपचार के अधीन (आंख की बूंदों केवल नमकीन समाधान युक्त), और चूहों एक खाली वेक्टर के साथ इंजेक्शन (उदाहरण के लिए, AAV/mCherry) वर्णित CNO आँख-ड्रॉप प्रोटोकॉल के संपर्क में.

3. पुरानी CNO उपचार पीने के पानी के माध्यम से दिया

  1. 50 एमएल (प्लास्टिक) शंकु ट्यूब और रबर डाट spouts का उपयोग कर छोटी बोतलें बनाओ; CNO स्थिरता पर किसी भी प्रकाश मध्यस्थता प्रभाव से बचने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर.
  2. CNO उपचार के साथ शुरू करने से पहले तीन दिन, छोटे बोतलों के साथ नियमित रूप से पानी की बोतलों की जगह, नियमित रूप से पानी के 10 एमएल युक्त, चूहों उन्हें acclimate करने के लिए अनुमति देने के लिए. टेप का उपयोग कर पिंजरों के लिए बोतलों को सुरक्षित.
  3. प्रत्येक माउस के लिए दैनिक पानी की खपत को मापने.
  4. प्रयोग शुरू करने से पहले प्रत्येक माउस का वजन करें.
  5. Clozapine-N-ऑक्साइड भंग (CNO, 5 मिलीग्राम) 0.9% बाँझ नमकीन समाधान के 1 एमएल में. स्टॉक विलयन को 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में रखना।
  6. शरीर के वजन और पानी की औसत मात्रा का उपयोग करने के लिए CNO समाधान की एकाग्रता को परिभाषित करने के लिए प्राप्त करने के लिए 1.0 मिलीग्राम CNO / किलो (शरीर का वजन).
    नोट: वयस्क नर चूहे (२० ग्राम शरीर का भार) प्रतिदिन $5 एमएल जल का उपभोग करते हैं (चित्र 2क)। इसलिए, 1 मिलीग्राम CNO/kg की CNO सांद्रता प्राप्त करने के लिए, 6.4 $L CNO स्टॉक समाधान के लिए पानी के 8 एमएल के अंतिम मात्रा में जोड़ा जाना चाहिए (अंतिम सांद्रता: 4 g CNO/ इस प्रकार, एक 20 ग्राम पशु के लिए CNO की खुराक है कि पेय 5 एमएल पानी प्रति दिन में परिणाम 1 मिलीग्राम CNO /
  7. सांद्रता की एक श्रृंखला का परीक्षण करके न्यूनतम CNO एकाग्रता के साथ अधिकतम प्रभावशीलता प्रदर्शित करता है कि इष्टतम CNO खुराक का निर्धारण. पीने के पानी की विधि के लिए इष्टतम CNO खुराक निर्धारित करने के लिए एक खुराक प्रतिक्रिया विश्लेषण प्रदर्शन.
    नोट: निम्नलिखित CNO खुराक इस प्रयोग के लिए परीक्षण किया गया: 1.0 mg/एमएल, 0.5 mg/एमएल, 0.25 mg/mL, 0.1 mg/ mL, और नमकीन. 1.0 मिलीग्राम CNO / किलो पहले परीक्षण किया गया था, आई.पी. और आंख की बूंदों प्रोटोकॉल के आधार पर.
  8. 1 दिन, नियमित रूप से पानी के 8 एमएल के साथ बोतल को भरने और CNO की आवश्यक राशि जोड़ें.
    नोट: पानी की यह राशि एक वयस्क पुरुष माउस के लिए विज्ञापन libitum पानी का उपयोग के 24 एच के लिए पर्याप्त है. यदि अन्य कृंतक प्रजातियों का उपयोग किया जाता है, तो पहले आवश्यक मात्रा निर्धारित करने के लिए दैनिक उपभोग किए जाने वाले पानी की मात्रा को मापें।
  9. यह सुनिश्चित करने के लिए कि पानी + CNO खपत के कारण कोई प्रतिकूल दुष्प्रभाव नहीं हैं प्रोटोकॉल भर में पशुओं के स्वास्थ्य की निगरानी करें।
  10. 24 ज के बाद, बोतलों को ताजे पानी + CNO समाधान से बदलें। पिछले दिन के दौरान खपत मात्रा रिकॉर्ड करें।
  11. अपशिष्ट कंटेनरों में उपभोग नहीं किया गया था कि पानी + CNO समाधान के निपटान। प्लास्टिक की बोतलों को त्यागें और पशु सुविधा दिशानिर्देशों के अनुसार उन्हें साफ करने के बाद, हर दिन रबर स्टॉपर की जगह लें।
    नोट: कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ जलीय अपशिष्ट मिश्रण न करें। संग्रहण और पिक-अप के लिए निर्देशों के लिए रासायनिक निपटान सेवा से संपर्क करें.
  12. 5 दिनों के लिए हर दिन एक ही समय में बोतलों को बदलें।
    नोट: इस अवधि प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार समायोजित किया जा सकता है.
  13. चरण 2.6 में वर्णित के रूप में नियंत्रण समूह शामिल करें।

4. Sucrose के लिए चूहों की पसंद का उपयोग प्रतिबंधित CNO उपचार

  1. CNO उपचार के साथ शुरू करने से 3 दिन पहले, एक छोटी बोतल जिसमें 10 एमएल पानी + 1% पिंजरे पर सुक्रोज रखें, अधिमानतः मूल पानी की बोतल से दूर।
    नोट: चरण 3.1 में वर्णित एक ही छोटी बोतलों का उपयोग करें।
  2. पानी के लिए जानवरों को उजागर + 1% उनके सक्रिय चरण के अंतिम भाग के दौरान sucrose (जेड टी 18 - 24). इस जोखिम के बाद, पानी के साथ बोतल को हटा दें + पिंजरे से sucrose.
    नोट: CNO वितरण के विभिन्न समय windows उपयोग किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, चूहों को एक उल्टे प्रकाश/अंधेरे चक्र के तहत रखा जा सकता है, जहां प्रकाश की शुरुआत शाम के घंटों में होती है ताकि CNO वितरण को सुविधाजनक बनाया जा सके।
  3. प्रत्येक माउस के लिए दैनिक पानी + 1% sucrose खपत को मापने।
  4. प्रयोग शुरू करने से पहले प्रत्येक माउस का वजन करें.
  5. शरीर के वजन और पानी की औसत मात्रा का उपयोग करें + 1% sucrose 1.0 मिलीग्राम CNO / किलो (शरीर के वजन) को प्राप्त करने के लिए CNO समाधान की खुराक निर्धारित करने के लिए भस्म।
    नोट: इष्टतम CNO खुराक है कि कम से कम CNO एकाग्रता के साथ अधिकतम प्रभावशीलता प्रदर्शित करता है परीक्षण किया जाना चाहिए, के रूप में चरण में समझाया 3.6.
  6. 1 दिन, 5 एमएल पानी के साथ बोतलों को भरने + 1% sucrose + CNO (1 मिलीग्राम CNO / किलो) और उन्हें पिंजरे पर जगह (हमेशा एक ही स्थान पर) निर्धारित समय खिड़की के दौरान.
  7. प्रतिबंधित समय खिड़की के अंत में, बोतलों को हटाने और पानी की मात्रा को मापने + sucrose + CNO भस्म.
    नोट: सामग्री और समाधान sanitized या पहले चरण 3.11 में वर्णित के रूप में खारिज कर रहे हैं.
  8. इस प्रक्रिया को हर दिन 5 दिनों के लिए दोहराएँ.
    नोट: इस अवधि प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार समायोजित किया जा सकता है.
  9. चरण 2.6 में वर्णित के रूप में एक नियंत्रण समूह शामिल करें।

5. डेटा विश्लेषण

  1. Perfuse चूहों intracardially के साथ 4% paraformaldehyde (पीएफए) या तो 2 या 6 ज पिछले दोहराव प्राप्त करने के बाद (5 दिन) CNO आँख ड्रॉप. जब CNO पीने के पानी के माध्यम से दिया जाता है, CNO + माउस के सक्रिय चरण के अंत में पानी के साथ पानी की जगह है, तो या तो 2 या 6 एच पोस्ट-CNO का उपयोग करने के बाद माउस perfuse.
    नोट: यदि प्रकाश जोखिम ब्याज के क्षेत्र में सी-Fos प्रेरण को प्रभावित कर सकता है, प्रयोगों के अंतिम दिन के दौरान लगातार अंधेरे में चूहों रखने के लिए, और भ्रम से पहले.
  2. ध्यान से मस्तिष्क बाहर विच्छेदन और 9-12h के लिए 4% पीएफए समाधान में डूब.
  3. पीएफए निर्धारण के बाद, एक 30% sucrose समाधान का उपयोग कर मस्तिष्क के ऊतकों cryoprotect (मस्तिष्क सिंक जब तक प्रतीक्षा करें), तो एक cryostat का उपयोग कर मस्तिष्क अनुभाग.
  4. कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए 1x पीबीएस, 10% गोजातीय सीरम एल्बुमिन, और 0.3% ट्राइटन एक्स-100 युक्त समाधान में कोरोनल मस्तिष्क वर्गों (35 डिग्री मी) को स्थानांतरित करें।
  5. लगातार आंदोलन के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक विरोधी सी-फोस (1:2500) एंटीबॉडी समाधान के साथ मस्तिष्क वर्गों इनक्यूबेट करें।
  6. 1x पीबीएस और 0.3% Triton X-100 युक्त एक समाधान के साथ प्रत्येक 5 मिनट के 3 washes के बाद, प्रकाश से दूर कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए एक Alexa-कंजुटेड माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500) समाधान के साथ नमूने इनक्यूबेट और निरंतर आंदोलन के साथ।
  7. एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर डिजिटल छवियों को प्राप्त. इकट्ठा और प्रक्रिया एक तस्वीर संपादन और विश्लेषण सॉफ्टवेयर (उदा., एडोब फोटोशॉप) के साथ छवियों पर कब्जा कर लिया।
  8. डेटा विश्लेषण के लिए, ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके AAV-infected क्षेत्र (MCherry(+) कक्षों की रूपरेखा और मापें, और प्रति क्षेत्र सक्रिय कक्षों की संख्या प्राप्त करने के लिए इस क्षेत्र में c-Fos(+) कक्षों की संख्या की मात्रा निर्धारित करें. प्रति जानवर 3 अलग वर्गों से प्राप्त परिणामों का मिश्रण.

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Representative Results

हमने देखा कि आंख की बूंदों का उपयोग कर दोहराए CNO वितरण सबसे संक्रमित न्यूरॉन्स में सी-फॉस अभिव्यक्ति का एक मजबूत प्रेरण प्राप्त (चित्र 1C),दिखा रहा है कि CNO वितरण की प्रभावशीलता दोहराव जोखिम के दौरान निरंतर है. इसके अलावा, सी-फॉस का एक महत्वपूर्ण प्रेरण CNO उपचार के बाद एकत्र किए गए नमूनों में देखा गया था, CNO जोखिम के बाद प्राप्त नमूनों की तुलना में 6 एच (चित्र1D-E),यह प्रदर्शित करता है कि CNO द्वारा प्रेरित परिवर्तन समय पर निर्भर हैं।

हम तो पीने के पानी के माध्यम से दिया पुरानी CNO उपचार की प्रभावशीलता मापा. हमने देखा कि जल की दैनिक खपत + सी एन ओ नियमित जल की कुल मात्रा की तुलना में काफी भिन्न नहीं थी (चित्र 2क) इसी प्रकार रात के दौरान भस्म किए जाने वाले जल + 1% सुक्रोज की मात्रा CNO (चित्र2B)के योग से प्रभावित नहीं हुई। इसके अतिरिक्त, सभी जंतुओं के प्रयोग में जल + CNO (चित्र 2C) तथा जल + सुक्रोज + CNO (चित्र 2D) दोनों की दैनिक खपत (5 दिन) में कोई अंतर नहीं पाया गया।

क्या हम CNO आँख-बूंदों का उपयोग कर पाया करने के लिए इसी तरह, सी-Fos के मजबूत प्रेरण 2 ज के बाद मनाया गया था, लेकिन नहीं 6 एच CNO का उपयोग पर (चित्र 2E-F).

अंत में, हम पीने के पानी के लिए जोड़ा CNO की खुराक प्रतिक्रिया मापा. ऐसा करने के लिए, चूहों को निम्नलिखित CNO खुराक के संपर्क में थे: 1.0 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.1 mg/ mL, saline. सभी मामलों में, जानवरों CNO जोखिम के बाद 2 एच perfused थे. हमने पाया कि CNO के लिए प्रभावशीलता की एक स्पष्ट सीमा है, जहां एक कम CNO खुराक (0.1 mg/mL) saline नियंत्रण की तुलना में सी-फॉस सक्रियण प्राप्त नहीं करता है, जबकि उच्च खुराक (0.25 मिलीग्राम/ एमएल, 0.5 मिलीग्राम/एमएल और 1.0 मिलीग्राम/एमएल) प्रेरित मजबूत और इसी तरह के सी-फोस प्रेरण () चित्रा 2G).

Figure 1
चित्र 1: आंख की बूंदों का उपयोग कर दोहराए CNO वितरण. (ए) एएवी/एचएम3डीक्यू-मचेरी को वयस्क (3 महीने की) पुरुष चूहों के हिप्पोकैम्पस में स्टीरियोटैक्सिक रूप से इंजेक्ट किया गया था। (बी) इंजेक्शन के चार सप्ताह बाद, सी एन ओ को लगातार 5 दिनों तक प्रतिदिन एक बार आंखों की बूंदों का उपयोग करके प्रशासित किया गया था। 1.0 मिलीग्राम CNO/ किलो की एक खुराक का इस्तेमाल किया गया था. (ग) अंत में, चूहों का बलिदान किया गया, और मस्तिष्क के ऊतकों का एएवी संक्रमित क्षेत्र (मचेरी-सकारात्मक कोशिकाओं, लाल) में सी-फॉस (हरा) इम्यूनोरेक्टिविटी के लिए परीक्षण किया गया। इंजेक्शन साइट के एक प्रतिनिधि कोरोनल अनुभाग और CNO-मध्यस्थ सी-फॉस सक्रियण दिखाया गया है। (घ) एएवी संक्रमित क्षेत्र में सी-फॉ सपॉजिट कोशिकाओं की संख्या को उन चूहों में मापा गया जो पिछले CNO प्रशासन के बाद 2 या 6 h थे। डेटा का अर्थ है - SEM. **p ;0.001; छात्र के टी-परीक्षण द्वारा (एन ] 2-3 चूहे). (ई) दो समूहों के लिए प्रतिनिधि छवियों को दिखाया गया है. स्केल बार: इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए 100 डिग्री सेल्सियस कृपया यहाँ क्लिक करें।

Figure 2
चित्र2: पुरानी CNO उपचार पीने के पानी के माध्यम से दिया. (क) नियंत्रण (जल) या उपचारित (जल + सीएनओ, खुराक: 1.0 मिलीग्राम CNO/kg) जंतुओं के बीच कुल तरल खपत में कोई अंतर नहीं पाया गया। डेटा का अर्थ है - SEM (n ] 13-14 चूहे). (ख) इसी प्रकार, सी एन ओ (1ण्0 मिलीग्राम/किलोग्राम) को जोड़ने के बाद जल की मात्रा में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया + 1 % सुक्रोज (6 ज समय खिड़की के दौरान) का उपभोग किया गया। डेटा का अर्थ है - SEM (n ] 5 चूहे). (ग) अलग-अलग चूहों के लिए जल + सी एन ओ (1.0 मिलीग्राम/किग्रा) की दैनिक खपत दर्शायी गई है। दैनिक उपभोग में कोई अंतर नहीं देखा गया। डेटा का अर्थ है - SEM (n ] 5 चूहे). (घ) अलग-अलग चूहों के लिए 1% सुक्रोज + सीएनओ (1.0 मिलीग्राम/किग्रा) की दैनिक तरल खपत (6 एच समय खिड़की के दौरान) दिखाया गया है। दैनिक उपभोग में कोई अंतर नहीं देखा गया। डेटा का अर्थ है - SEM (द ] 3 चूहे)। (ई) 2 या 6 एच पिछले CNO प्रशासन के बाद, चूहों बलिदान किया गया, और सी-फॉ सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या AAV संक्रमित क्षेत्र में मात्रा निर्धारित किया गया था. डेटा का अर्थ है - SEM. **p ;0.001; छात्र के टी-परीक्षण द्वारा (एन ] 5 चूहों). (च) मस्तिष्क कोरोनल वर्गों एएवी संक्रमित (मचेरी-सकारात्मक कोशिकाओं, लाल) क्षेत्र में सी-फोस (हरी) इम्यूनोरेक्टिविटी के लिए परीक्षण किया गया। प्रतिनिधि चित्र दिखाए जाते हैं. (छ) चार CNO खुराक (0.1, 0.25, 0.5, और 1.0 मिलीग्राम CNO/ डेटा का अर्थ है - SEM. **p ;0.001; ANOVA द्वारा, Tukey परीक्षण के बाद (एन $ 2 चूहों). स्केल बार: इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए 100 डिग्री सेल्सियस कृपया यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

DREADDs दूर से तंत्रिका गतिविधि17हेरफेर करने के लिए एक लोकप्रिय और प्रभावी दृष्टिकोण के रूप में उभरा है . CNO वितरण के लिए वैकल्पिक रणनीतियों के डिजाइन मोटे तौर पर विशिष्ट प्रयोगात्मक सेटिंग्स के लिए उपलब्ध विकल्पों के स्पेक्ट्रम में वृद्धि होगी. इसके अलावा, CNO के वितरण के लिए गैर इनवेसिव रणनीतियों प्रतिकूल दुष्प्रभाव है कि सीधे जानवर के स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकते हैं कम से कम परिणामों के किसी भी संभावित गलत अर्थ को कम. यहाँ, हम CNO वितरण के लिए दो गैर इनवेसिव रणनीतियों है कि DREADDs के एक मजबूत सक्रियण प्रदान (hM3DQ) और संभावनाओं की एक विस्तृत स्पेक्ट्रम की पेशकश वर्णित है. इसके अलावा, हम मानते हैं कि यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल भी न्यूरॉन हेरफेर के लिए विभिन्न DREADD वेरिएंट के लिए उपयोगी हो सकता है, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर muscarinic या opioid रिसेप्टर्स सहित.

दोहराव आंख-बूंदों का उपयोग CNO वितरण ठीक खुराक और CNO वितरण के समय को नियंत्रित करने के लिए शक्ति के संरक्षण, जबकि दोहराव intraperitoneal CNO इंजेक्शन के लिए एक दर्द रहित विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है. इसलिए, हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने की अनुशंसा करते हैं जब दोहराए गए DREADD सक्रियण की आवश्यकता है। नेत्र बूँदें भी CNO वितरण के लिए कम से कम महंगा विकल्प हैं, विशेष रूप से CNO का उपयोग कर प्रोटोकॉल के साथ तुलना में पीने के पानी में जोड़ा. CNO पीने के पानी के माध्यम से दिया, दूसरी ओर, किसी भी माउस से निपटने से बचने, DREADDS की एक पुरानी और निरंतर सक्रियण प्रदान करता है. यह उल्लेख है कि इस प्रोटोकॉल CNO वितरण के समय पर सटीक नियंत्रण का अभाव है महत्वपूर्ण है. एक तीसरा विकल्प, CNO युक्त एक sucrose समाधान के लिए समय-प्रतिबंधित पहुँच, दोनों प्रोटोकॉल के लाभ को जोड़ती है पहले से चर्चा की. इस रणनीति को एक ही समय में गैर इनवेसिव, दोहराव और प्रदर्शन करने के लिए आसान है. इसके अतिरिक्त, यह CNO के साथ पानी के लिए 24 एच का उपयोग के साथ तुलना में CNO वितरण के समय का एक बेहतर नियंत्रण प्रदान करता है. इस दृष्टिकोण की एक चेतावनी यह है कि यह केवल जानवरों के सक्रिय चरण के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है. हम अवरक्त कैमरों या CNO खपत के बारे में सटीक लौकिक जानकारी प्राप्त करने के लिए एक चाटना-ओ-मीटर प्रणाली के साथ संयोजन में पीने के पानी में CNO शामिल दोनों रणनीतियों का उपयोग करने की सलाह देते हैं और, इसलिए, DREADD सक्रियण.

पीने के पानी के माध्यम से वितरित CNO द्वारा प्रदान लंबे समय से स्थायी प्रभाव पहले सूचित किया गया. हम सफलतापूर्वक मूड नियंत्रण में शामिल एक thalamo-cortical सर्किट के टॉनिक सक्रियण के व्यवहार परिणामों का मूल्यांकन करने के लिए 14 लगातार दिनों15 के दौरान एक पुरानी CNO (5 डिग्री / एमएल) उपचार लागू किया है. वैकल्पिक रूप से, 40 मिलीग्राम/एल की सांद्रता में पीने के पानी में प्रदान की गई CNO का उपयोग लंबे समय से पृष्ठीय रैपे नाभिक के सीरोटोनर्जिक न्यूरॉन्स की गतिविधि को व्यवस्थित करने के लिए किया गया है18, जबकि अग्नाशयी जेड-कोशिकाओं के कार्य को CNO का उपयोग करके नियंत्रित किया गया था 0.25 मिलीग्राम/एमएल पानी19की एकाग्रता पर। संयुक्त, इन परिणामों का सुझाव है कि विभिन्न CNO सांद्रता को प्रभावी ढंग से DREADDs नियंत्रण tuned किया जा सकता है. यहाँ, हमने पाया कि CNO की विभिन्न खुराक पीने के पानी के लिए जोड़ा इसी तरह सी-Fos सक्रियण प्राप्त, सुझाव है कि एक खुराक प्रतिक्रिया विश्लेषण के लिए सबसे कम और प्रभावी CNO खुराक की आवश्यकता को परिभाषित किया जाना चाहिए. हाल के अध्ययनों से पता चला है कि CNO पूरी तरह से औषधीय अक्रिय20नहीं है; इसके अलावा, यह भी प्रदर्शित किया गया था कि DREADDs के in vivo सक्रियण CNO मेटाबोलाइट clozapine, जो कई अंतर्जात लक्ष्य21है द्वारा मध्यस्थता है. इसलिए, लेखकों clozapine के subthreshold खुराक का उपयोग करने का सुझाव, उच्च CNO खुराक के बजाय. हालांकि हम वर्णित तरीकों में clozapine की प्रभावशीलता का मूल्यांकन नहीं किया है, हमने पाया कि CNO एकाग्रता काफी न्यूरॉन सक्रियण को कम करने के बिना कम किया जा सकता है, और इसलिए, CNO-to-clozapine की वजह से साइड इफेक्ट को कम करने रूपांतरण.

संक्षेप में, यहाँ प्रस्तुत रणनीतियों CNO वितरण है कि आसानी से प्रयोगात्मक डिजाइन की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के लिए संभावित योजनाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं. वे गैर इनवेसिव रणनीति है कि दोहराव या पुरानी CNO के लिए उपयोगी हो सकता है के रूप में कल्पना की थी DREADD नियंत्रित न्यूरॉन्स के सक्रियण मध्यस्थता, पशु व्यवहार पर CNO वितरण के प्रभाव को कम करने.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय मानसिक स्वास्थ्य संस्थान (जियाए MH002964-02) में इंट्रामरल अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था। हम NIMH IRP Rodent व्यवहार कोर (जेडआईसी MH002952) के समर्थन का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA Sigma life science #A2153-100G Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis)
C57BL/6J mice The Jackson laboratory #000664 male mice, 3 months old
Capillaries Drummond Scientific Company #3-000-203-G/X Outer diameter: 1.14 inch
Clozapine-N-oxide Sigma #C0832 5 mg
Forane Baxter #NDC 10019-360-60 Isoflurane, USP
Microinjector III Drummond Scientific Company #3-000-207 Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector
Mounting media Invitrogen #P36930 Prolong Gold antifade reagent
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences #15710 16% aqueous solution (methanol free), 10 mL
Primary c-Fos Antibody Cell signaling technology #2250S c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µL)
rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry UNC Vector Core Titer: ~3 x 1012 vg/mL
rAAV5/hSyn-mCherry UNC Vector Core Titer: ~3x10e12 vg/mL
Secondary Antibody Invitrogen #A21206 Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml
Triton X-100 americanbio.com #AB02025-00100

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References

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Zhan, J., Komal, R., Keenan, W. T., Hattar, S., Fernandez, D. C. Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity. J. Vis. Exp. (150), e59439, doi:10.3791/59439 (2019).

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