Summary
Hier beschreiben wir zwei nicht-invasive Methoden zur chronischen Kontrolle der neuronalen Aktivität mit Chemogenetik bei Mäusen. Augentropfen wurden verwendet, um Clozapin-N-Oxid (CNO) täglich zu liefern. Wir beschreiben auch zwei Methoden für die längere Verabreichung von CNO im Trinkwasser. Diese Strategien zur chronischen neuronalen Kontrolle erfordern minimale Eingriffe, um den Stress der Tiere zu reduzieren.
Abstract
Chemogenetische Strategien haben sich als zuverlässige Werkzeuge für die Fernsteuerung der neuronalen Aktivität herauskristallisiert. Unter diesen, Designer-Rezeptoren ausschließlich durch Designer-Medikamente aktiviert (DREADDs) haben sich die beliebtesten chemogenetischen Ansatz in der modernen Neurowissenschaft verwendet. Die meisten Studien liefern das Ligand Clozapin-N-Oxid (CNO) mit einer einzigen intraperitonealen Injektion, die für die akute Aktivierung/Hemmung der gezielten neuronalen Population geeignet ist. Es gibt jedoch nur wenige Beispiele für Strategien zur chronischen Modulation von DREADD-kontrollierten Neuronen, von denen die meisten auf den Einsatz von Trägersystemen angewiesen sind, die einen chirurgischen Eingriff erfordern. Hier erweitern wir zwei nicht-invasive Strategien zur Bereitstellung des Liganden-CNO zur chronischen Manipulation der neuronalen Population bei Mäusen. CNO wurde entweder mit repetitiven (täglichen) Augentropfen oder chronisch durch das Trinkwasser des Tieres verabreicht. Diese nicht-invasiven Paradigmen führen zu einer robusten Aktivierung der Designerrezeptoren, die während der gesamten CNO-Behandlungen fortbestehen. Die hier beschriebenen Methoden bieten Alternativen zur chronischen DREADD-vermittelten Kontrolle der neuronalen Aktivität und können für Experimente nützlich sein, die entwickelt wurden, um das Verhalten bei frei beweglichen Tieren zu bewerten, wobei der Schwerpunkt auf weniger invasiven CNO-Bereitstellungsmethoden liegt.
Introduction
Technische Fortschritte auf dem Gebiet der Neurowissenschaften haben es Wissenschaftlern ermöglicht, die Aktivität bestimmter neuronaler Populationen genau zu identifizieren und zu kontrollieren1. Dies hat dazu beigetragen, die Grundlagen der neuronalen Schaltkreise und ihre Auswirkungen auf das Verhalten von Tieren besser zu verstehen, sowie die Überarbeitung etablierter Dogmen2,3. Unter diesen neuartigen Werkzeugen haben optogenetische und chemogenetische Strategien nicht nur die Qualität der Entdeckungen, sondern auch die Art und Weise, wie Experimente konzipiert und gestaltet werden, tiefgreifend beeinflusst4. Im vorliegenden Manuskript konzentrieren wir uns auf chemogenetische Strategien zur Steuerung der Aktivierung von Neuronen über entwickelte Rezeptor-Ligand-Strategien. Designerrezeptoren, die ausschließlich durch Designer-Medikamente (DREADDs) aktiviert werden, stellen eines der beliebtesten chemogenetischen Werkzeuge für die Fernsteuerung der neuronalen Aktivität dar, wie von Roth 20165überprüft. DREADDs verwenden modifizierte muscarinische Acetylcholin-Rezeptoren, die speziell durch eine inerte Liganligande aktiviert werden, Clozapin-N-Oxid (CNO)6.
Die meisten Studien verwenden CNO durch intraperitoneale (i.p.) Injektionen verabreicht, die effektiv steuert die Dosierung und Timing der technischen Rezeptoren Aktivierung in akuter Weise. Wenn jedoch eine repetitive oder chronische DREADD-Aktivierung erforderlich ist, wird die Verwendung mehrerer i.p.-Injektionen nicht mehr möglich. Um dieses Problem anzugehen, wurden verschiedene Strategien für die chronische CNO-Lieferung berichtet, einschließlich implantierter Minipumpen7 und intrakraniellen Kanülen8,9. In unterschiedlichem Ausmaß verursachen all diese Strategien Stress und Schmerzen10, und erfordern einen chirurgischen Eingriff, der auch einen direkten Einfluss auf die Zutest-Verhaltensreaktionen haben könnte11. Hier beschreiben wir drei nicht-invasive Strategien für die chronische CNO-Entbindung.
Zu diesem Zweck wurden Mäuse stereotaxisch in den Hippocampus mit einem Adeno-assoziierten Virus (AAV) injiziert, der eine technische Version des exzitatorischen M3-Muskarinrezeptors (hM3Dq) kodiert, der bei Aktivierung durch den Liganden CNO zum burstartigen Abfeuern von Neuronen6. Es wurde zuvor gezeigt, dass ein einzelner Augentropfen, der CNO enthält, effektiv eine robuste Aktivierung der DREADD-exemitten Neuronen12auslösen kann. Hier beschreiben wir eine modifizierte Methode zur wiederholten Abgabe von Augentropfen. Um eine chronische und nachhaltige Kontrolle der Designerrezeptoren zu erreichen, beschreiben wir als nächstes eine nicht-invasive Strategie, Um cNO an Mäuse durch das Trinkwasser zu liefern. Schließlich beschreiben wir ein alternatives Paradigma für die Bereitstellung von CNO im Trinkwasser während eines begrenzten Zeitfensters. Die Motoraktivität der Mäuse sowie das Trinkverhalten und der Konsum von süßen Kalorienlösungen beschränken sich meist auf den dunklen Teil des Hellen/Dunkel-Zyklus13,14. Daher haben wir ein Protokoll angenommen, das auf der Vorliebe der Maus für Saccharose basiert. Durch die Messung der Induktion des unmittelbar-frühen Gens c-Fos in AAV-infizierten Zellen, als Auslese für neuronale Aktivierung12,15, fanden wir heraus, dass diese CNO-Lieferstrategien DREADD-kontrollierte Neuronen über erweiterte Dauer.
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Protocol
Alle Tiere wurden nach den Richtlinien der Tierpflege- und Einsatzausschüsse des National Institute of Mental Health (NIMH) behandelt. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um den Schmerz und die Anzahl der verwendeten Tiere zu minimieren.
1. Adeno-assoziierte Virusinjektionen im Hippocampus
HINWEIS: Wilde männliche Mäuse mit gemischtem Hintergrund (B6/129 F1 Hybrid, 3 Monate alt) wurden für stereotaxisch mit einem AAV injiziert, der den M3-Muskarinrezeptor (hM3Dq) in den Hippocampus kodiert. Während des gesamten Experiments wurden Mäuse eingeschossig untergebracht, unter einem normalen 12 h Licht: 12 h dunkler (T24) Zyklus, mit Zugang zu Nahrung und Wasser ad libitum.
- Vor der Durchführung stereotaxic Operationen, reinigen und sterilisieren Sie den stereotaxic Rahmen und alle benötigten Instrumente.
HINWEIS: Chirurgische Vorhänge könnten verwendet werden, um ein steriles Feld zu erhalten und den Wärmeverlust der Maus zu reduzieren. - Tief anästhesieren die Maus mit Isofluran. Passen Sie dazu zunächst den Sauerstoffdurchflussmesser auf ca. 1,5 l/min an, und stellen Sie dann den Isofluran-Verdampfer auf ca. 3-5% für die Induktion und ca. 1-3% für die Wartung ein.
- Um sicherzustellen, dass das Tier vollständig bewusstlos ist, kneifen Sie die Pfote der Maus; das Tier richtig beästhetisiert wird, wenn die zuckende Reaktion auf Kneifen fehlt.
- Platzieren Sie die Maus auf einem Heizkissen, um die Stabilität der Körpertemperatur der Maus zu erhalten.
- Rasieren Sie die Oberseite des Kopfes und fixieren Sie den Kopf der Maus auf den stereotaxic Rahmen. Dann tragen Sie okuläreschutzige Schmiermittel auf die Augen, reinigen Sie die Oberfläche durch Schrubben mit Povidon-Jod und 70% Ethanol, und setzen Sie den Schädel mit einem sterilen Skalpell aus.
- Kalibrieren Sie den Rahmen auf den Bregma-Punkt, und bohren Sie dann auf eine medial-laterale Koordinate von 2,9 mm und eine vordere-hintere Koordinate -2,7 mm, um den Hippocampus anzugreifen.
HINWEIS: Wenn ein anderes Gehirnziel injiziert werden muss, bestimmen Sie die gewünschten Injektionskoordinaten mit dem Paxinos- und Franklin-Mausatlas16. - Sobald das Gehirn exponiert ist, injizieren Sie einseitig 90 nL des AAV in der dorsal-ventralen Tiefe von -3,0 mm im Hippocampus mit einem Mikroinjektor und gezogenen Mikrokapillarpipetten (Abbildung 1A).
HINWEIS: Siehe Materialtabelle für den in diesem Experiment verwendeten Titer von AAV. Passen Sie für andere Gehirnbereiche das AAV-Injektionsvolumen nach Bedarf an. - Am Ende des chirurgischen Eingriffs den Schnitt mit Nylonnähten schließen und topische Antibiotika auf die Wundstelle auftragen.
- Analgetika (Buprenorphin, 0,1 mg/kg) sofort nach der Operation und 4-6 Stunden nach der Operation systemisch verabreichen.
- Beginnend 4 Wochen nach der Injektion, unterwerfen Mäuse eines der im folgenden Abschnitt beschriebenen Paradigmen, um Neuronen, die den Erregerrezeptor des Designers exzessieren, chronisch zu kontrollieren.
2. Repetitive CNO-Lieferung mit Augentropfen
- Akklimatisieren Sie die Tiere mit der Handhabung durch Scruffing jede Maus 3 min täglich für 3-4 Tage vor der Verabreichung von Augentropfen.
- Clozapin-N-oxid (CNO, 5 mg) in 1 ml steriler 0,9%iger Salinelösung auflösen (Lagerlösung: 5 mg CNO/ml). Halten Sie die Lösung bei 4 °C gekühlt.
- Wägen Sie jede Maus, bevor Sie mit dem Experiment beginnen, um die Menge an Zuliefern von CNO zu bestimmen. Verwenden Sie 1-3 l Tropfen (pro Auge), um 1,0 mg CNO / kg Körpergewicht zu erreichen.
HINWEIS: Als Beispiel sollte eine 20 g Maus bilaterale (jeweils 2 l) Augentropfen erhalten. - Geben Sie die Augentropfen während der inaktiven (Licht-)Phase von Mäusen, 2 h, bevor die Lichter ausschalten(ZeitgeberZeit (ZT) 10). In Fällen, in denen CNO während der aktiven (dunklen) Phase von Mäusen abgegeben werden muss, stellen Sie sicher, dass dunkles rotes Licht für eine ordnungsgemäße Behandlung von Tieren auftritt.
HINWEIS: Es sollten Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um zu vermeiden, dass der zirkadiane (und helle/dunkle) Zyklus von Versuchstieren gestört wird.- Laden Sie mit einer P10-Mikropipette die erforderliche Menge (1-3 l) CNO-Lösung, um 1,0 mg CNO/kg zu erreichen.
HINWEIS: Verwenden Sie eine neue und sterile Pipettenspitze für jeden Augentropfen. In dieser Reihe von Experimenten wurden bilaterale Augentropfen von CNO durchgeführt; Wenn jedoch eine niedrigere CNO-Konzentration erforderlich ist, könnten auch einseitige Augentropfen angewendet werden. - Immobilisieren Sie die Maus über scruff.
- Die Lösung langsam vertreiben, bis sich ein stabiles Tröpfchen an der Pipettenspitze bildet.
- Bringen Sie das Tröpfchen vorsichtig in die Nähe der Hornhaut des Mausauges, bis die Lösung geliefert wird. Die Pipettenspitze sollte niemals das Mausauge kontaktieren.
- Lassen Sie die Maus los und legen Sie sie wieder in ihren Heimischenkäfig.
- Laden Sie mit einer P10-Mikropipette die erforderliche Menge (1-3 l) CNO-Lösung, um 1,0 mg CNO/kg zu erreichen.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang jeden Tag für 5 Tage.
HINWEIS: Diese Dauer kann entsprechend den experimentellen Anforderungen angepasst werden. - Für Kontrollexperimente verwenden Sie AAV/DREADD-injizierte Mäuse, die einer Scheinbehandlung unterzogen wurden (Augentropfen, die nur eine Salinlösung enthalten), und Mäuse, die mit einem leeren Vektor (z. B. AAV/mCherry) injiziert wurden, die dem beschriebenen CNO-Augentropfenprotokoll ausgesetzt sind.
3. Chronische CNO-Behandlung durch Trinkwasser
- Machen Sie kleine Flaschen mit 50 ml (Kunststoff) konischen Rohren und Gummistopfen aus; Abdeckung mit Aluminiumfolie, um lichtvermittelte Effekte auf die CNO-Stabilität zu vermeiden.
- Ersetzen Sie drei Tage vor Beginn der CNO-Behandlung normale Wasserflaschen durch kleine Flaschen, die 10 ml normales Wasser enthalten, damit sich Mäuse an sie akklimatisieren können. Befestibe die Flaschen mit Klebeband an den Käfigen.
- Messen Sie den täglichen Wasserverbrauch für jede Maus.
- Wägen Sie jede Maus, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
- Clozapin-N-oxid (CNO, 5 mg) in 1 ml 0,9% steriler Salinelösung auflösen. Kühlen Sie die Lagerlösung bei 4 °C.
- Verwenden Sie das Körpergewicht und die durchschnittliche Menge an Wasser verbraucht, um die Konzentration der CNO-Lösung zu definieren, um 1,0 mg CNO / kg (Körpergewicht) zu erreichen.
HINWEIS: Erwachsene männliche Mäuse (ca. 20 g Körpergewicht) verbrauchen 5 ml Wasser pro Tag (Abbildung2A). Um eine CNO-Konzentration von 1 mg CNO/kg zu erreichen, sollte daher eine CNO-Stammlösung von 6,4 l zu einem Endvolumen von 8 ml Wasser (Endkonzentration: 4 g CNO/ml) hinzugefügt werden. So ergibt die Dosis CNO für ein 20 g Tier, das 5 ml Wasser pro Tag trinkt, 1 mg CNO/kg. - Bestimmen Sie die optimale CNO-Dosis, die die maximale Wirksamkeit bei minimaler CNO-Konzentration anzeigt, indem Sie eine Reihe von Konzentrationen testen. Führen Sie eine Dosis-Wirkungs-Analyse durch, um die optimale CNO-Dosis für die Trinkwassermethode zu bestimmen.
HINWEIS: Für dieses Experiment wurden folgende CNO-Dosen getestet: 1,0 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,1 mg/ml und Saline. 1,0 mg CNO/kg wurde zuerst getestet, basierend auf i.p.- und Augentropfenprotokollen. - Füllen Sie die Flasche am 1. Tag mit 8 ml normalem Wasser und fügen Sie die erforderliche Menge CNO hinzu.
HINWEIS: Diese Menge Wasser ist genug für 24 h ad libitum WasserZugang für eine erwachsene männliche Maus. Wenn andere Nagetierarten verwendet werden, messen Sie zuerst die Menge des täglich verbrauchten Wassers, um das benötigte Volumen zu bestimmen. - Überwachen Sie den Zustand der Tiere während des gesamten Protokolls, um sicherzustellen, dass es keine Nebenwirkungen gibt, die durch Wasser + CNO-Verbrauch verursacht werden.
- Nach 24 h die Flaschen durch Frischwasser + CNO-Lösung ersetzen. Zeichnen Sie das am Vortag verbrauchte Volumen auf.
- Entsorgen Sie die Wasser+ CNO-Lösung, die nicht in Abfallbehältern verbraucht wurde. Entsorgen Sie Plastikflaschen und ersetzen Sie die Gummistopfen jeden Tag, nachdem sie gemäß den Richtlinien der Tieranlage desinsäuert wurden.
HINWEIS: Mischen Sie wässrige Abfälle nicht mit organischen Lösungsmitteln. Wenden Sie sich an den Chemical Disposal Service, um Anweisungen für die Lagerung und Abholung zu erhalten. - Ersetzen Sie die Flaschen jeden Tag für 5 Tage zur gleichen Zeit.
HINWEIS: Diese Dauer kann entsprechend den experimentellen Anforderungen angepasst werden. - Schließen Sie Kontrollgruppen ein, wie in Schritt 2.6 beschrieben.
4. Eingeschränkte CNO-Behandlung mit Mäusen, die Saccharose bevorzugt
- 3 Tage vor Beginn der CNO-Behandlung eine kleine Flasche mit 10 ml Wasser + 1% Saccharose auf den Käfig legen, vorzugsweise weg von der ursprünglichen Wasserflasche.
HINWEIS: Verwenden Sie dieselben kleinen Flaschen, die in Schritt 3.1 beschrieben sind. - Setzen Sie Tiere während des letzten Teils ihrer aktiven Phase dem Wasser aus + 1% Saccharose aus (ZT 18 – 24). Nach dieser Belichtung die Flasche mit Wasser + Saccharose aus dem Käfig entfernen.
HINWEIS: Es können verschiedene Zeitfenster der CNO-Lieferung verwendet werden. Darüber hinaus könnten Mäuse unter einen invertierten Hell-Dunkel-Zyklus gestellt werden, bei dem das Licht in den Abendstunden eintritt, um die CNO-Lieferung zu erleichtern. - Messen Sie den täglichen Wasser + 1% Saccharoseverbrauch für jede Maus.
- Wägen Sie jede Maus, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
- Verwenden Sie das Körpergewicht und die durchschnittliche Menge an Wasser + 1% Saccharose verbraucht, um die Dosis der CNO-Lösung zu bestimmen, um 1,0 mg CNO / kg (Körpergewicht) zu erreichen.
HINWEIS: Die optimale CNO-Dosis, die die maximale Wirksamkeit bei minimaler CNO-Konzentration anzeigt, sollte getestet werden, wie in Schritt 3.6 erläutert. - Füllen Sie am 1. Tag Flaschen mit 5 ml Wasser + 1% Saccharose + CNO (1 mg CNO/ Kg) und legen Sie sie während des festgelegten Zeitfensters auf den Käfig (immer am gleichen Ort).
- Am Ende des zeitbeschränkten Zeitfensters die Flaschen entfernen und die Menge an Wasser + Saccharose + CNO verbrauchen messen.
HINWEIS: Materialien und Lösungen werden wie zuvor in Schritt 3.11 beschrieben desinfiziert oder verworfen. - Wiederholen Sie diesen Vorgang jeden Tag für 5 Tage.
HINWEIS: Diese Dauer kann entsprechend den experimentellen Anforderungen angepasst werden. - Schließen Sie eine Kontrollgruppe ein, wie in Schritt 2.6 beschrieben.
5. Datenanalyse
- Perfuse Mäuse intrakardinativ mit 4% Paraformaldehyd (PFA) entweder 2 oder 6 h nach Erhalt der letzten repetitiven (5. Tag) CNO Augentropfen. Wenn CNO durch Trinkwasser geliefert wird, ersetzen Sie CNO + Wasser mit Wasser am Ende der aktiven Phase der Maus, und durchdringen Sie dann die Maus nach 2 oder 6 h Post-CNO-Zugriff.
HINWEIS: Wenn die Lichtexposition die c-Fos-Induktion im Interessenbereich beeinträchtigen könnte, halten Sie Mäuse am letzten Tag der Experimente und vor der Perfusion in ständiger Dunkelheit. - Sezieren Sie das Gehirn vorsichtig aus und tauchen Sie in 4% PFA-Lösung für 9-12h.
- Nach der PFA-Fixierung, kryoprotect das Gehirngewebe mit einer 30% Saccharose-Lösung (warten, bis das Gehirn sinkt), dann abschnitt das Gehirn mit einem Kryostat.
- Übertragen Sie die koronalen Hirnabschnitte (35 m) in eine Lösung, die 1x PBS, 10% Rinderserumalbumin und 0,3% Triton X-100 für 1 h bei Raumtemperatur enthält.
- Inkubieren Sie die Hirnabschnitte mit einer Anti-c-Fos (1:2500) Antikörperlösung bei 4 °C über Nacht bei ständiger Rührung.
- Nach 3 Waschungen von jeweils 5 min mit einer Lösung, die 1x PBS und 0,3% Triton X-100 enthält, inkubieren Sie die Proben mit einem Alexa-konjugierten Sekundärantikörper (1:500) für 1 h bei Raumtemperatur weg vom Licht und mit konstanter Rührung.
- Erhalten Sie digitale Bilder mit einem konfokalen Mikroskop. Zusammenstellen und verarbeiten Sie aufgenommene Bilder mit einer Fotobearbeitungs- und Analysesoftware (z. B. Adobe Photoshop).
- Um die AAV-infizierten Flächen (mCherry(+)-Zellen mithilfe der ImageJ-Software zu analysieren und zu messen, und quantifizieren Sie für die Datenanalyse die Anzahl der c-Fos(+)-Zellen innerhalb dieses Bereichs, um die Anzahl der aktivierten Zellen pro Fläche zu erhalten. Kombinieren Sie die Ergebnisse aus 3 separaten Abschnitten pro Tier.
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Representative Results
Wir beobachteten, dass eine wiederholte CNO-Lieferung mit Augentropfen eine robuste Induktion der c-Fos-Expression in den meisten infizierten Neuronen hervorrief (Abbildung 1C), was zeigt, dass die Wirksamkeit der CNO-Bereitstellung während der wiederholten Exposition aufrechterhalten wird. Darüber hinaus wurde eine signifikante Induktion von c-Fos in Proben beobachtet, die 2 h nach der CNO-Behandlung entnommen wurden, verglichen mit Proben, die 6 h nach CNO-Exposition(Abbildungen 1D-E) erhalten wurden, was zeigt, dass durch CNO induzierte Veränderungen zeitabhängig sind.
Anschließend haben wir die Wirksamkeit der chronischen CNO-Behandlung durch Trinkwasser gemessen. Wir stellten fest, dass sich der tägliche Wasserverbrauch + CNO nicht wesentlich von der Gesamtmenge des verbrauchten regulären Wassers unterscheidet (Abbildung2A). Ebenso wurde die Wassermenge + 1% Saccharose, die in der Nacht verbraucht wurde (6 h Zeitfenster), durch die Zugabe von CNO nicht beeinflusst (Abbildung 2B). Darüber hinaus wurden während des gesamten Versuchs für alle Tiere keine Unterschiede im täglichen Verbrauch (5 Tage) von Wasser + CNO (Abbildung 2C) und Wasser + Saccharose + CNO (Abbildung 2D) festgestellt.
Ähnlich wie bei CNO-Augentropfen wurde eine robuste Induktion von c-Fos nach 2 h, aber nicht 6 h beim CNO-Zugang beobachtet (Abbildungen 2E-F).
Schließlich haben wir die Dosisreaktion von CNO gemessen, das dem Trinkwasser zugesetzt wird. Dazu wurden Mäuse den folgenden CNO-Dosen ausgesetzt: 1,0 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,1 mg/ml, Saline. In allen Fällen wurden die Tiere 2 h nach CNO-Exposition durchsetzt. Wir stellten fest, dass es eine klare Wirksamkeitsschwelle für CNO gibt, bei der eine niedrige CNO-Dosis (0,1 mg/ml) keine C-Fos-Aktivierung im Vergleich zur Saline-Kontrolle hervorruft, während höhere Dosen (0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml und 1,0 mg/ml) eine robuste und ähnliche c-Fos-Induktion induzierten ( Abbildung 2G).
Abbildung 1: Wiederholte CNO-Lieferung mit Augentropfen. (A) AAV/hM3Dq-mCherry wurde stereotaxisch in den Hippocampus von erwachsenen (3 Monate alten) männlichen Mäusen injiziert. (B) Vier Wochen nach der Injektion wurde CNO mit Augentropfen einmal täglich für 5 aufeinander folgende Tage verabreicht. Es wurde eine Dosis von 1,0 mg CNO/kg verwendet. (C) Schließlich wurden Mäuse geopfert und Hirngewebe auf c-Fos (grüne) Immunreaktivität im AAV-infizierten Bereich (mCherry-positive Zellen, rot) getestet. Ein repräsentativer koronaler Abschnitt der Injektionsstelle und die CNO-vermittelte c-Fos-Aktivierung wird angezeigt. (D) Die Anzahl der c-Fos-positiven Zellen im AAV-infizierten Bereich wurde an Mäusen gemessen, die nach der letzten CNO-Verabreichung 2 oder 6 h durchdrungen waren. Die Daten sind mittelwert. ***p < 0.001; durch Student es t-Test (n = 2-3 Mäuse). (E) Repräsentative Bilder für die beiden Gruppen werden gezeigt. Maßstabsleiste: 100 m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Chronische CNO-Behandlung durch Trinkwasser. (A) Es wurden keine Unterschiede beim Gesamtflüssigkeitsverbrauch zwischen kontrollierten (Wasser) oder behandelten (Wasser + CNO, Dosis: 1,0 mg CNO/kg) Tieren beobachtet. Die Daten sind mittelwert -SEM (n = 13-14 Mäuse). (B) Ebenso wurden keine signifikanten Unterschiede in der Menge des verbrauchten Wassers + 1 % Saccharose (während eines 6-h-Zeitfensters) nach Zugabe von CNO (1,0 mg/kg) beobachtet. Die Daten sind mittelwert -SEM (n = 5 Mäuse). (C) Der tägliche Verbrauch von Wasser + CNO (1,0 mg/kg) für einzelne Mäuse wird angezeigt. Es wurden keine Unterschiede im täglichen Verbrauch beobachtet. Die Daten sind mittelwert -SEM (n = 5 Mäuse). (D) Bei einzelnen Mäusen wird ein täglicher Flüssigkeitsverbrauch (während eines 6-stunden-Zeitfensters) von 1% Saccharose + CNO (1,0 mg/kg) angezeigt. Es wurden keine Unterschiede im täglichen Verbrauch beobachtet. Die Daten sind mittelwert -SEM (n = 3 Mäuse). (E) 2 oder 6 h nach der letzten CNO-Verabreichung wurden Mäuse geopfert, und die Anzahl der c-Fos-positiven Zellen wurde im AAV-infizierten Bereich quantifiziert. Die Daten sind mittelwert. ***p < 0.001; durch Student es t-Test (n = 5 Mäuse). (F) Hirnkoronatolabschnitte wurden auf c-Fos (grüne) Immunreaktivität im AAV-infizierten (mCherry-positiven Zellen, rot) Bereich getestet. Repräsentative Bilder werden angezeigt. (G) Es wurden vier CNO-Dosen verabreicht (0,1, 0,25, 0,5 und 1,0 mg CNO/kg), und die c-Fos-Induktion wurde gemessen. Die Daten sind mittelwert. ***p < 0.001; von ANOVA, gefolgt von Tukeys Test (n = 2 Mäuse). Maßstabsleiste: 100 m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
DREADDs haben sich als ein beliebter und effektiver Ansatzzur Fernmanipulation neuronaler Aktivität 17 herauskristallisiert. Die Entwicklung alternativer Strategien für die CNO-Bereitstellung wird das Spektrum der verfügbaren Optionen für spezifische experimentelle Einstellungen weitgehend erweitern. Darüber hinaus minimieren nicht-invasive Strategien für die Bereitstellung von CNO mögliche Fehlinterpretationen von Ergebnissen, indem sie nebenwirkungen, die sich direkt auf die Gesundheit des Tieres auswirken können, reduzieren. Hier haben wir zwei nicht-invasive Strategien für die CNO-Bereitstellung beschrieben, die eine robuste Aktivierung von DREADDs (hM3Dq) ermöglichen und ein breites Spektrum an Möglichkeiten bieten. Darüber hinaus glauben wir, dass die hier beschriebenen Protokolle auch für verschiedene DREADD-Varianten für neuronale Manipulation nützlich sein könnten, einschließlich gentechnisch veränderter Muscarin- oder Opioidrezeptoren.
Die CNO-Lieferung mit sich wiederholenden Augentropfen stellt eine schmerzlose Alternative zu sich wiederholenden intraperitonealen CNO-Injektionen dar, während gleichzeitig die Kraft zur präzisen Kontrolle der Dosierung und des Timings der CNO-Lieferung erhalten bleibt. Daher empfehlen wir die Verwendung dieses Protokolls, wenn eine sich wiederholende DREADD-Aktivierung erforderlich ist. Augentropfen sind auch die kostengünstigste Option für die CNO-Lieferung, insbesondere im Vergleich zum Protokoll mit CNO, das dem Trinkwasser zugesetzt wird. CNO, das durch Trinkwasser geliefert wird, hingegen verleiht eine chronische und nachhaltige Aktivierung von DREADDS, wodurch jegliche Maushandhabung vermieden wird. Es ist wichtig zu erwähnen, dass dieses Protokoll keine genaue Kontrolle über den Zeitpunkt der CNO-Bereitstellung hat. Eine dritte alternative, zeitlich begrenzte In- und Stelle des Zugangs zu einer CNO-Lösung, die CNO enthält, vereint die Vorteile beider zuvor diskutierter Protokolle. Diese Strategie ist gleichzeitig nicht-invasiv, repetitiv und einfach durchzuführen. Darüber hinaus bietet es eine bessere Kontrolle des Timings der CNO-Lieferung im Vergleich zu dem 24-Stunden-Zugang zu Wasser mit CNO. Ein Vorbehalt dieses Ansatzes ist, dass er nur während der aktiven Phase von Tieren verwendet werden kann. Wir empfehlen, beide Strategien mit CNO im Trinkwasser in Kombination mit Infrarotkameras oder einem Leck-O-Meter-System zu verwenden, um präzise zeitliche Informationen über den CNO-Verbrauch und damit die DREADD-Aktivierung zu erhalten.
Langfristige Auswirkungen von CNO, die durch Trinkwasser geliefert wurden, wurden zuvor berichtet. Wir haben erfolgreich eine chronische CNO-Behandlung (5 g/ml) an 14 aufeinanderfolgenden Tagen15 durchgeführt, um die Verhaltensfolgen der tonischen Aktivierung eines Thalamo-kortikalen Kreislaufs zu bewerten, der an der Stimmungskontrolle beteiligt ist. Alternativ wurde CNO, das im Trinkwasser in einer Konzentration von 40 mg/L bereitgestellt wird, verwendet, um die Aktivität von serotonergen Neuronen des dorsalen Raphe-Kerns18chronisch zu modulieren, während die Funktion der Pankreaszellen mit CNO kontrolliert wurde. in einer Konzentration von 0,25 mg/ml Wasser19. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass verschiedene CNO-Konzentrationen optimiert werden können, um DREADDs effektiv zu steuern. Hier fanden wir heraus, dass verschiedene Dosen von CNO, die dem Trinkwasser zugesetzt wurden, eine ähnliche c-Fos-Aktivierung auslösten, was darauf hindeutet, dass eine Dosis-Wirkungs-Analyse durchgeführt werden sollte, um die niedrigste und wirksame erforderliche CNO-Dosis zu definieren. Jüngste Studien haben gezeigt, daß CNO nicht vollständig pharmakologisch inert20ist; Darüber hinaus wurde auch nachgewiesen, dass die In-vivo-Aktivierung von DREADDs durch den CNO-Metaboliten Clozapin vermittelt wird, der mehrere endogene Targets21aufweist. Daher schlagen die Autoren vor, subschwellige Dosen von Clozapin anstelle von hohen CNO-Dosen zu verwenden. Obwohl wir die Wirksamkeit von Clozapin in den beschriebenen Methoden nicht bewertet haben, fanden wir heraus, dass die CNO-Konzentration reduziert werden konnte, ohne die neuronale Aktivierung signifikant zu reduzieren und somit Nebenwirkungen zu minimieren, die durch cNO-zu-Clozapin verursacht wurden. umwandlung.
Zusammenfassend stellen die hier vorgestellten Strategien potenzielle Systeme für die CNO-Bereitstellung dar, die leicht an eine Vielzahl von experimentellen Entwürfen angepasst werden können. Sie wurden als nicht-invasive Strategien konzipiert, die für die wiederholte oder chronische CNO-vermittelte Aktivierung von DREADD-kontrollierten Neuronen nützlich sein können, wodurch die Auswirkungen der CNO-Entbindung auf das Verhalten von Tieren reduziert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das intramurale Forschungsprogramm am National Institute of Mental Health (ZIA MH002964-02) unterstützt. Wir danken der Unterstützung des NIMH IRP Nagetier Behavioral Core (ZIC MH002952).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 inch |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5 mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 mL |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µL) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3 x 1012 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
References
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
- Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
- Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
- Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
- Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
- Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).
- LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. Neuroscience. 349, 229-238 (2017).
- Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
- Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
- MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
