Summary
Qui descriviamo due metodi non invasivi per controllare cronicamente l'attività neuronale usando la chemiogenetica nei topi. Le gocce oculari sono state utilizzate per fornire ogni giorno clozapina-n-ossido (CNO). Descriviamo anche due metodi per una somministrazione prolungata di CNO nell'acqua potabile. Queste strategie per il controllo neuronale cronico richiedono un intervento minimo riducendo lo stress degli animali.
Abstract
Le strategie chemiogenetiche sono emerse come strumenti affidabili per il controllo remoto dell'attività neuronale. Tra questi, i recettori dei progettisti attivati esclusivamente da farmaci di design (DREADD) sono diventati l'approccio chemiogenetico più popolare utilizzato nelle neuroscienze moderne. La maggior parte degli studi fornisce il ligando clozapina-n-ossido (CNO) utilizzando una singola iniezione intraperitoneale, che è adatto per l'attivazione/inibizione acuta della popolazione neuronale mirata. Ci sono, tuttavia, solo alcuni esempi di strategie per la modulazione cronica dei neuroni controllati da DREADD, la maggior parte dei quali si basano sull'uso di sistemi di consegna che richiedono un intervento chirurgico. Qui, espandiamo su due strategie non invasive per fornire il Ligand CNO per manipolare cronicamente la popolazione neurale nei topi. Il CNO è stato somministrato sia utilizzando gocce oculari ripetitive (giornaliere), sia cronicamente attraverso l'acqua potabile dell'animale. Questi paradigmi non invasivi si traducono in una robusta attivazione dei recettori dei progettisti che persistevano in tutti i trattamenti CNO. I metodi qui descritti offrono alternative per il controllo mediato cronico danzico danzico dell'attività neuronale e possono essere utili per esperimenti progettati per valutare il comportamento in animali liberamente in movimento, concentrandosi su metodi di somministrazione CNO meno invasivi.
Introduction
I progressi tecnici nel campo delle neuroscienze hanno permesso agli scienziati di identificare e controllare con precisione l'attività di particolari popolazioni neuronali1. Questo ha contribuito a comprendere meglio la base dei circuiti neuronali e il loro impatto sul comportamento animale, così come, rivedendo i dogmi stabiliti2,3. Tra questi nuovi strumenti, le strategie optogenetiche e chemiogenetiche hanno avuto un profondo impatto non solo sulla qualità delle scoperte, ma anche sul modo in cui gli esperimenti sono concepiti e progettati4. Nel presente manoscritto, ci concentriamo sulle strategie chemiogenetiche per controllare l'attivazione dei neuroni tramite strategie ingegnerizzate recettore-ligando. Recettori di design attivati esclusivamente da farmaci di design (DREADDs) rappresentano uno degli strumenti chemiogenetici più popolari per il controllo remoto dell'attività neuronale, come esaminato da Roth 20165. I DREADD utilizzano recettori acetilline muscarinic modificati che sono specificamente attivati da un ligando inerte, clozapina-n-ossido (CNO)6.
Maggior parte degli studi utilizzano CNO somministrato da iniezioni intraperitoneali (i.p.), che controlla efficacemente il dosaggio e la tempistica dei recettori ingegnerizzati attivazione in modo acuto. Tuttavia, quando è necessaria l'attivazione ReREADD ripetitiva o cronica, l'uso di iniezioni multiple i.p. diventa irrealizzabile. Per risolvere questo problema, sono state segnalate diverse strategie per la consegna cNO cronica, tra cui minipumps7 impiantate e cannule intracraniche8,9. In misura diversa, tutte queste strategie causano agli animali stress e dolore10e richiedono un intervento chirurgico che potrebbe anche avere un impatto diretto sulle risposte comportamentali da testare11. Qui, descriviamo tre strategie non invasive per la consegna cNO cronica.
A questo scopo, i topi sono stati iniettati stereotassicamente nell'ippocampo con un virus adeno-associato (AAV) che codifica una versione ingegneristica del recettore muscarinico M3 eccitatorio (hM3Dq) che quando attivato dal ligando CNO porta alla cottura a raffica di neuroni6. È stato precedentemente dimostrato che un singolo occhio contenente CNO può effettivamente suscitare una robusta attivazione di neuroni che esprimono DREADD12. Qui descriviamo un metodo modificato per la consegna ripetitiva di colliri. Per ottenere un controllo cronico e sostenuto dei recettori dei progettisti, descriviamo quindi una strategia non invasiva per fornire CNO ai topi attraverso l'acqua potabile. Infine, descriviamo un paradigma alternativo per fornire CNO in acqua potabile durante una finestra temporale limitata. L'attività locomotoria dei topi, così come il comportamento di bere e il consumo di soluzioni caloriche dolci, sono per lo più limitate alla parte scura del ciclo luce / scuro13,14. Pertanto, abbiamo adottato un protocollo basato sulla preferenza del topo per il saccarosio. Misurando l'induzione del gene immediatamente precoce c-Fos nelle cellule infettate da AAV, come lettura per l'attivazione neuronale12,15, abbiamo scoperto che queste strategie di erogazione CNO attivano in modo robusto i neuroni controllati da DREADD Durate.
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Protocol
Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida dei comitati per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto Nazionale di Salute Mentale (NIMH). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il dolore e il numero di animali utilizzati.
1. Iniezioni di virus associati ad Adeno nell'ippocampo
NOT: I topi maschi di tipo selvatico di sottofondo misto (B6/129 F1 ibrido, 3 mesi) erano per iniettati stereotassicamente con un AAV che codificava il recettore muscarinico M3 (hM3Dq) nell'ippocampo. Durante l'intero esperimento, i topi sono stati alloggiati in una sola casa, sotto un normale ciclo di 12 h luce: 12 h scuro (T24), con accesso al cibo e all'acqua ad libitum.
- Prima di eseguire interventi chirurgici stereotassici, pulire e sterilizzare il telaio stereotassico e tutti gli strumenti necessari.
NOTA: tende chirurgiche potrebbero essere utilizzate per mantenere un campo sterile e ridurre la perdita di calore del topo. - Anesizzare profondamente il topo usando l'isoflurane. Per fare questo, prima regolare il misuratore di flusso di ossigeno a circa 1,5 L / min, quindi regolare il vaporizzatore isoflurane a circa 3-5% per l'induzione e circa 1-3% per la manutenzione.
- Per garantire che l'animale sia completamente incosciente, pizzicare la zampa del topo; l'animale è adeguatamente anetizzato quando la risposta indietreggiata al pizzico è assente.
- Posizionare il mouse su una piastra di riscaldamento per mantenere la stabilità della temperatura corporea del mouse.
- Rasare la parte superiore della testa e fissare la testa del mouse al telaio stereotassico. Quindi, applicare lubrificante protettivo oculare sugli occhi, pulire la superficie strofinando con povidone-iodio e 70% etanolo, ed esporre il cranio con un bisturi sterile.
- Calibrare il telaio per il punto di bregma, quindi forare in una coordinata mediale-laterale di 2,9 mm e una coordinata anteriore-posteriore -2,7 mm per indirizzare l'ippocampo.
NOTA: Se è necessario iniettare altri bersagli cerebrali, determinare le coordinate desiderate per l'iniezione utilizzando l'atlante paxinos e Franklin16. - Una volta che il cervello è esposto, iniettare unilateralmente 90 nL dell'AAV alla profondità dorsale-ventrale di -3,0 mm nell'ippocampo utilizzando un microiniere e pipette microcapillari tirate (Figura 1A).
NOTA: Vedere Tabella dei materiali per il tessere di AAV utilizzato in questo esperimento. Per altre aree del cervello, regolare il volume AAV di iniezione in base alle esigenze. - Alla fine della procedura chirurgica, chiudere l'incisione con suture di nylon e applicare antibiotici topici al sito della ferita.
- Somministrare analgesici (buprenorphina, 0,1 mg/kg) sistemicamente subito dopo l'intervento chirurgico e 4-6 ore dopo.
- A partire da 4 settimane dopo l'iniezione, sottoporre i topi a uno qualsiasi dei paradigmi descritti nella sezione seguente per controllare cronicamente i neuroni che esprimono il recettore eccitatorio designer.
2. Consegna CNO ripetitiva con colliri oculari
- Acclimatare gli animali alla manipolazione scruffing ogni topo 3 min al giorno per 3-4 giorni prima della somministrazione di gocce oculari.
- Sciogliere Clozapine-N-ossido (CNO, 5 mg) in 1 mL di soluzione salina sterile 0.9% (soluzione di stock: 5 mg CNO/ mL). Mantenere la soluzione refrigerata a 4 gradi centigradi.
- Pesare ogni mouse prima di iniziare l'esperimento per determinare la quantità di CNO da consegnare. Utilizzare 1-3 goccia (per occhio) per raggiungere 1,0 mg CNO / kg peso corporeo.
NOTA: Ad esempio, un mouse da 20 g dovrebbe ricevere collirio bilaterali (2 x L ciascuno). - Consegnare gli occhi-drop durante la fase inattiva (leggera) dei topi, 2 h prima che le luci si spengono (tempo dizeitgeber (T) 10). Nei casi in cui il CNO deve essere consegnato durante la fase attiva (oscura) dei topi, garantire la presenza di luce rossa fioca per una corretta manipolazione animale.
NOTA: è necessario prendere precauzioni per evitare di interrompere il ciclo circadiano (e luce/scuro) degli animali sperimentali.- Utilizzando una micropipetta P10, caricare la quantità richiesta (1-3 l) della soluzione CNO per ottenere 1,0 mg CNO/ kg.
NOTA: Utilizzare una punta di pipetta nuova e sterile per ogni goccia d'occhio. In questa serie di esperimenti, sono stati eseguiti collidi bilaterali di CNO; tuttavia, se è richiesta una minore concentrazione di CNO, potrebbero essere applicati anche colliri oculari unilaterali. - Immobilizzare il mouse tramite scruff.
- Espellere lentamente la soluzione fino a quando una goccia stabile si forma sulla punta della pipetta.
- Portare con attenzione la goccia vicino alla cornea dell'occhio del topo fino a quando la soluzione viene consegnata. La punta della pipetta non deve mai contattare l'occhio del mouse.
- Rilasciare il mouse, rimettendolo nella sua gabbia di casa.
- Utilizzando una micropipetta P10, caricare la quantità richiesta (1-3 l) della soluzione CNO per ottenere 1,0 mg CNO/ kg.
- Ripetere questa procedura ogni giorno per 5 giorni.
NOTA: questa durata può essere regolata in base ai requisiti sperimentali. - Per gli esperimenti di controllo, utilizzare topi iniettati da AAV/DREADD sottoposti a trattamento fittizio (gocce oculari contenenti solo soluzione salina) e topi iniettati con un vettore vuoto (ad esempio, AAV/mCherry) esposto al protocollo CNO eye-drops descritto.
3. Trattamento CNO cronico erogato attraverso l'acqua potabile
- Fare piccole bottiglie con tubi conici 50 mL (plastica) e beccucci tappo di gomma; coprire con un foglio di alluminio per evitare effetti mediati dalla luce sulla stabilità CNO.
- Tre giorni prima di iniziare con il trattamento CNO, sostituire le bottiglie d'acqua regolari con piccole bottiglie, contenenti 10 mL di acqua regolare, per consentire ai topi di acclimatarsi. Fissare le bottiglie alle gabbie con del nastro adesivo.
- Misurare il consumo giornaliero di acqua per ogni mouse.
- Pesare ogni mouse prima di iniziare l'esperimento.
- Sciogliere Clozapine-N-ossido (CNO, 5 mg) in 1 mL di 0.9% soluzione salina sterile. Conservare in frigorifero la soluzione di riserva a 4 gradi centigradi.
- Utilizzare il peso corporeo e la quantità media di acqua consumata per definire la concentrazione di soluzione CNO per raggiungere 1,0 mg CNO/ kg (peso corporeo).
NOTA: i topi maschi adulti (peso corporeo da 20 g) consumano 5 mL di acqua al giorno (Figura 2A). Pertanto, per ottenere una concentrazione di CNO di 1 mg CNO/ kg, 6,4 L di soluzione stock CNO devono essere aggiunti ad un volume finale di 8 mL di acqua (concentrazione finale: 4 g DiNO/ mL). Così, la dose di CNO per un animale da 20 g che beve 5 mL di acqua al giorno risulta in 1 mg CNO/ kg. - Determinare la dose ottimale di CNO che mostra la massima efficacia con concentrazione minima di CNO testando una gamma di concentrazioni. Eseguire un'analisi di risposta alla dose per determinare la dose ottimale di CNO per il metodo dell'acqua potabile.
NOTA: le seguenti dosi di CNO sono state testate per questo esperimento: 1,0 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,1 mg/mL e salina. 1,0 mg CNO/ kg è stato testato per la prima volta, sulla base di i.p. e protocolli di collirio. - Il primo giorno, riempire la bottiglia con 8 mL di acqua normale e aggiungere la quantità richiesta di CNO.
NOTA: Questa quantità di acqua è sufficiente per 24 h di accesso ad libitum acqua per un topo maschio adulto. Nel caso in cui vengano utilizzate altre specie di roditori, misurare in primo luogo la quantità di acqua consumata quotidianamente per determinare il volume necessario. - Monitorare la salute degli animali durante tutto il protocollo per assicurarsi che non ci siano effetti collaterali negativi causati dall'acqua - Consumo di CNO.
- Dopo 24 h, sostituire le bottiglie con acqua dolce e soluzione CNO. Registrare il volume consumato durante il giorno precedente.
- Smaltire l'acqua - Soluzione CNO che non è stata consumata in contenitori di rifiuti. Scartare le bottiglie di plastica e sostituire i tappi di gomma ogni giorno, dopo averli sanificati secondo le linee guida della struttura animale.
NOTA: Non mescolare i rifiuti acquosi con i solventi organici. Contattare il Servizio di smaltimento chimico per istruzioni su stoccaggio e ritiro. - Sostituire le bottiglie alla stessa ora ogni giorno per 5 giorni.
NOTA: questa durata può essere regolata in base ai requisiti sperimentali. - Includere i gruppi di controllo, come descritto nel passaggio 2.6.Include control groups, as described in step 2.6.
4. Trattamento limitato dell'OC con la preferenza dei topi per il saccarosio
- 3 giorni prima di iniziare con il trattamento CNO, mettere una piccola bottiglia contenente 10 mL di acqua , l'1% di saccarosio sulla gabbia, preferibilmente lontano dalla bottiglia d'acqua originale.
NOTA: utilizzare le stesse piccole bottiglie descritte nel passaggio 3.1. - Esporre gli animali all'acqua : 1% di saccarosio durante l'ultima parte della loro fase attiva (T 18 – 24). Dopo questa esposizione, togliere dalla gabbia la bottiglia con acqua e saccarosio.
NOTA: è stato possibile utilizzare intervalli di tempo diversi per la consegna CNO. Inoltre, i topi potrebbero essere collocati sotto un ciclo di luce/buio invertito, dove l'insorgenza della luce si verifica nelle ore serali per facilitare la consegna del CNO. - Misurare l'acqua giornaliera - 1% consumo di saccarosio per ogni mouse.
- Pesare ogni mouse prima di iniziare l'esperimento.
- Utilizzare il peso corporeo e la quantità media di acqua - 1% saccarosio consumato per determinare la dose di soluzione CNO per raggiungere 1.0 mg CNO / kg (peso corporeo).
NOTA: La dose ottimale di CNO che mostra la massima efficacia con concentrazione minima di CNO deve essere testata, come spiegato nel passaggio 3.6. - Il primo giorno, riempire le bottiglie con 5 mL di acqua , l'1% di saccarosio , CNO (1 mg CNO/ Kg) e posizionarle sulla gabbia (sempre nella stessa posizione) durante la finestra temporale determinata.
- Alla fine della finestra di tempo limitato, rimuovere le bottiglie e misurare la quantità di acqua - saccarosio - CNO consumato.
NOTA: i materiali e le soluzioni vengono sanificati o scartati come descritto in precedenza nel passaggio 3.11. - Ripetere questa procedura ogni giorno per 5 giorni.
NOTA: questa durata può essere regolata in base ai requisiti sperimentali. - Includere un gruppo di controllo, come descritto nel passaggio 2.6.Include a control group, as described in step 2.6.
5. Analisi dei dati
- Perfusi topi intracardialmente con 4% paraformaldeide (PFA) 2 o 6 h dopo aver ricevuto l'ultimo ripetitivo (5o giorno) CNO eye-drop. Quando l'OC viene erogato attraverso l'acqua potabile, sostituire CNO e acqua con acqua alla fine della fase attiva del mouse, quindi perfondere il mouse dopo 2 o 6 h dopo l'accesso al CNO.
NOTA: Se l'esposizione alla luce può influenzare l'induzione di c-Fos nell'area di interesse, tenere i topi al buio costante durante l'ultimo giorno degli esperimenti e prima della perfusione. - Sezionare con attenzione il cervello e immergersi in 4% soluzione PFA per 9-12h.
- Dopo la fissazione PFA, crioproteggere il tessuto cerebrale utilizzando una soluzione di saccarosio 30% (attendere fino a quando il cervello affonda), quindi sezionare il cervello utilizzando un criostato.
- Trasferire le sezioni coronali del cervello (35 m) in una soluzione contenente 1x PBS, 10% di albumin del siero bovino e 0,3% Triton X-100 per 1 h a temperatura ambiente.
- Incubare le sezioni cerebrali con una soluzione anticorpale anti-c-Fos (1:2500) a 4 gradi centigradi durante la notte con agitazione costante.
- Dopo 3 fumi di 5 minuti ciascuno con una soluzione contenente 1x PBS e 0,3% Triton X-100, incubai i campioni con un anticorpo secondario coniugato ad Alexa (1:500) per 1 h a temperatura ambiente lontano dalla luce e con agitazione costante.
- Ottenere immagini digitali utilizzando un microscopio confocale. Assemblare ed elaborare le immagini acquisite con un software di fotoritocco e analisi (ad esempio, Adobe Photoshop).
- Per l'analisi dei dati, delineare e misurare l'area infettata dall'AAV (cellule mCherry () utilizzando il software ImageJ e quantificare il numero di celle c-Fos() all'interno di questa regione per ottenere il numero di celle attivate per ogni area. Combinare i risultati ottenuti da 3 sezioni separate per animale.
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Representative Results
Abbiamo osservato che la consegna ripetitiva di CNO mediante gocce oculari ha provocato una robusta induzione dell'espressione c-Fos nella maggior parte dei neuroni infetti (Figura1C), dimostrando che l'efficacia della consegna CNO è sostenuta durante l'esposizione ripetitiva. Inoltre, è stata osservata una significativa induzione di c-Fos nei campioni raccolti 2 h dopo il trattamento cNO, rispetto ai campioni ottenuti 6 h dopo l'esposizione al CNO (figura1D-E), dimostrando che i cambiamenti indotti dall'OC dipendono dal tempo.
Abbiamo quindi misurato l'efficacia del trattamento cNO cronico somministrato attraverso l'acqua potabile. Abbiamo osservato che il consumo giornaliero di acqua - CNO non era significativamente diverso rispetto al volume totale di acqua normale consumata (Figura 2A). Allo stesso modo, l'aggiunta di CNO (Figura2B)non è stata influenzata dall'aggiunta di acqua, ovvero l'1%, del saccarosio consumato durante la notte. Inoltre, durante l'esperimento non sono state riscontrate differenze nel consumo giornaliero (5 giorni) sia di acqua (Figura2C) che di acqua, saccarosio , CNO (Figura 2D).
Simile a quello che abbiamo trovato usando colliri oculari CNO, è stata osservata una robusta induzione di c-Fos dopo 2 h ma non 6 h sull'accesso CNO (Cifre 2E-F).
Infine, abbiamo misurato la risposta alla dose di CNO aggiunta all'acqua potabile. Per fare questo, i topi sono stati esposti alle seguenti dosi CNO: 1.0 mg/ mL, 0.5 mg/ mL, 0.25 mg/ mL, 0.1 mg/ mL, salina. In tutti i casi, gli animali sono stati perfusi 2 h dopo l'esposizione al CNO. Abbiamo scoperto che esiste una chiara soglia di efficacia per il CNO, dove una dose bassa di CNO (0,1 mg/mL) non provoca l'attivazione di c-Fos rispetto al controllo salino, mentre dosi più elevate (0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL e 1,0 mg/mL) indusse l'induzione robusta e simile di C-Fos ( Figura 2G).
Figura 1: consegna CNO ripetitiva con colli di occhio. (A) AAV/hM3Dq-mCherry è stato iniettato stereotaxamente nell'ippocampo di topi adulti (3 mesi). (B) Quattro settimane dopo l'iniezione, il CNO è stato somministrato utilizzando gocce oculari una volta al giorno per 5 giorni consecutivi. È stata utilizzata una dose di 1,0 mg CNO/kg. (C) Infine, i topi sono stati sacrificati, e il tessuto cerebrale è stato testato per l'immunoreattività c-Fos (verde) nell'area infetta dall'AAV (cellule mCherry-positive, rosso). Viene visualizzata una sezione coronale rappresentativa del sito di iniezione e l'attivazione c-Fos mediata dal CNO. (D) Il numero di cellule positive c-Fos nell'area infetta tramite AAV è stato misurato in topi perfusi 2 o 6 h dopo l'ultima somministrazione del CNO. I dati sono medi: SEM. tramite il test t dello Studente (n - 2-3 topi). (E) Vengono mostrate le immagini rappresentative dei due gruppi. Barra della scala: 100 m Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Trattamento CNO cronico somministrato attraverso l'acqua potabile. (A) Non sono state osservate differenze nel consumo totale di liquidi tra gli animali di controllo (acqua) o trattati (acqua e CNO, dose: 1,0 mg CNO/kg). I dati sono meschini : SEM (n - 13-14 topi). (B) Allo stesso modo, non sono state osservate differenze significative nel volume d'acqua, ovvero l'1 % di saccarosio consumato (durante un intervallo temporale di 6 ore), dopo l'aggiunta di CNO (1,0 mg/Kg). I dati sono meschini: SEM (n - 5 topi). (C) Viene mostrato il consumo giornaliero di acqua - CNO (1,0 mg/kg) per i singoli topi. Non sono state osservate differenze nel consumo giornaliero. I dati sono meschini: SEM (n - 5 topi). (D) Viene mostrato il consumo giornaliero di liquidi (durante una finestra temporale di 6 ore) dell'1% di saccarosio - CNO (1,0 mg/kg) per i singoli topi. Non sono state osservate differenze nel consumo giornaliero. I dati sono meschini: SEM (n - 3 topi). (E) 2 o 6 h dopo l'ultima somministrazione del CNO, i topi sono stati sacrificati e il numero di cellule positive c-Fos è stato quantificato nell'area infetta dall'AAV. I dati sono medi: SEM. tramite il test t dello Studente (n x 5 topi). (F) Le sezioni coronali cerebrali sono state testate per l'immunoreattività c-Fos (verde) nella regione infettata dall'AAV (cellule mCherry-positive, rosso). Vengono visualizzate le immagini rappresentative. (G) Sono state somministrate quattro dosi di CNO (0,1, 0,25, 0,5 e 1,0 mg CNO/kg) e è stata misurata l'induzione di c-Fos. I dati sono medi: SEM. di ANOVA, seguito dal test di Tukey (n x 2 topi). Barra della scala: 100 m Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I DREADD sono emersi come un approccio popolare ed efficace per manipolare da remoto l'attività neuronale17. La progettazione di strategie alternative per la consegna di CNO aumenterà ampiamente lo spettro delle opzioni disponibili per specifiche impostazioni sperimentali. Inoltre, le strategie non invasive per la consegna di CNO riducono al minimo qualsiasi potenziale interpretazione errata dei risultati riducendo gli effetti collaterali negativi che possono avere un impatto diretto sulla salute dell'animale. Qui, abbiamo descritto due strategie non invasive per la consegna cNO che conferiscono una robusta attivazione di DREADD (hM3Dq) e offrono un ampio spettro di possibilità. Inoltre, crediamo che i protocolli descritti qui potrebbero essere utili anche per diverse varianti DREADD per la manipolazione neuronale, compresi i recettori muscarinici o oppioidi geneticamente ingegnerizzati.
La consegna cNO con collirio ripetitivo rappresenta un'alternativa indolore alle iniezioni CNO intraperitive ripetitive, preservando al contempo la potenza per controllare con precisione il dosaggio e la tempistica della consegna CNO. Pertanto, si consiglia di utilizzare questo protocollo quando è necessaria l'attivazione Repetitive DREADD. Le gocce oculari sono anche l'opzione meno costosa per la consegna CNO, in particolare rispetto al protocollo che utilizza CNO aggiunto all'acqua potabile. Il CNO erogato attraverso l'acqua potabile, d'altra parte, conferisce un'attivazione cronica e sostenuta di DREADDS, evitando qualsiasi manipolazione del mouse. È importante ricordare che questo protocollo manca di un controllo preciso sui tempi di consegna del CNO. Una terza alternativa, l'accesso limitato nel tempo a una soluzione di saccarosio contenente CNO, combina i vantaggi di entrambi i protocolli precedentemente discussi. Questa strategia è allo stesso tempo non invasiva, ripetitiva e facile da eseguire. Inoltre, offre un migliore controllo della tempistica di consegna CNO rispetto all'accesso all'acqua di 24 h con CNO. Un avvertimento di questo approccio è che può essere utilizzato solo durante la fase attiva degli animali. Si consiglia di utilizzare entrambe le strategie che coinvolgono CNO in acqua potabile in combinazione con telecamere a infrarossi o un sistema lick-o-meter per ottenere informazioni temporali precise sul consumo di CNO e, quindi, l'attivazione DREADD.
Sono stati precedentemente segnalati effetti di lunga durata conferiti dall'OC erogati attraverso l'acqua potabile. Abbiamo applicato con successo un trattamento cronico CNO (5 g/ mL) durante 14 giorni consecutivi15 per valutare le conseguenze comportamentali dell'attivazione tonica di un circuito talamo-corticale coinvolto nel controllo dell'umore. In alternativa, il CNO fornito nell'acqua potabile ad una concentrazione di 40 mg/L è stato utilizzato per modulare cronicamente l'attività dei neuroni sierotonergici del nucleo del raphe dorsale18, mentre la funzione delle cellule pancreatiche è stata controllata utilizzando il CNO con una concentrazione di 0,25 mg/mL di acqua19. Combinati, questi risultati suggeriscono che diverse concentrazioni di CNO possono essere sintonizzate per controllare efficacemente i DREADD. Qui, abbiamo scoperto che diverse dosi di CNO aggiunte all'acqua potabile hanno suscitato un'attivazione c-Fos simile, suggerendo che dovrebbe essere eseguita un'analisi dose-risposta per definire la dose CNO più bassa ed efficace richiesta. Recenti studi hanno dimostrato che il CNO non è del tutto farmacologicamente inerte20; inoltre, è stato anche dimostrato che l'attivazione in vivo dei DREADD è mediata dalla clozapina dei metaboliti CNO, che ha diversi obiettivi endogeni21. Pertanto, gli autori suggeriscono di utilizzare dosi di sottosoglia di clozapina, invece di alte dosi di CNO. Anche se non abbiamo valutato l'efficacia della clozapina nei metodi descritti, abbiamo scoperto che la concentrazione di CNO potrebbe essere ridotta senza ridurre significativamente l'attivazione neuronale, e quindi, riducendo al minimo gli effetti collaterali causati dal CNO-to-clozapine Conversione.
In sintesi, le strategie qui presentate rappresentano potenziali schemi per la consegna di CNO che possono essere facilmente adattati a una varietà di progetti sperimentali. Sono state concepite come strategie non invasive che possono essere utili per l'attivazione ripetitiva o cronica mediata da CNO di neuroni controllati da DREADD, riducendo l'impatto della somministrazione di CNO sul comportamento animale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal programma di ricerca intramurale presso l'Istituto Nazionale di Salute Mentale (Istituto Nazionale di Salute Mentale). Ringraziamo il sostegno del NIMH IRP Rodent Behavioral Core(
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 inch |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5 mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 mL |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µL) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3 x 1012 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
References
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