Summary
כאן אנו מתארים שתי שיטות שאינן פולשני לשלוט כרוניות בפעילות עצבית באמצעות כימוגנטיקה בעכברים. טיפות עיניים שימשו כדי לספק clozapine N-תחמוצת (CNO) מדי יום. אנו מתארים גם שתי שיטות לניהול ממושך של CNO ב שתיית מים. מחייב התערבות מינימלית. בהפחתת הלחץ של בעלי החיים
Abstract
אסטרטגיות כימוגנטיות התפתחה ככלי אמין עבור שליטה מרחוק של פעילות עצבית. בין אלה, קולטני מעצב המופעל באופן בלעדי על ידי תרופות מעצב (ראסטות) הפכו את הגישה הפופולרית ביותר כימוגנטית בשימוש במדעי המוח המודרנית. רוב המחקרים מספקים את ליגו clozapine-N-תחמוצת (CNO) באמצעות הזרקת הצפק יחיד, אשר מתאים הפעלה חריפה/עיכוב של האוכלוסייה העצבית המיועד. יש, עם זאת, רק כמה דוגמאות של אסטרטגיות עבור אפנון כרונית של נוירונים מבוקרת ראסטות, רוב אשר מסתמכים על השימוש במערכות המסירה הדורשות התערבות כירורגית. כאן, אנו להרחיב על שתי אסטרטגיות שאינן פולשני עבור אספקת ליגו CNO כדי כרוני לתמרן את האוכלוסייה העצבית בעכברים. לא ניתן להשתמש ב-CNO באמצעות טיפות עיניים חוזרות (יומיות), או באופן כרוני דרך מי השתייה של בעל החיים. אלה שאינם פולשני התוצאה הפעלה איתנה של קולטני המעצב כי התעקש במהלך טיפולים CNO. השיטות המתוארות כאן מציעות חלופות עבור שליטה מתווכת כרונית של הפעילות העצבית ועשויה להיות שימושית עבור ניסויים שנועדו להעריך את ההתנהגות בחיות נעות בחופשיות, התמקדות בשיטות מסירה פחות פולשנית של CNO.
Introduction
פיתוחים טכניים בתחום מדעי המוח אפשרו למדענים לזהות ולשלוט באופן מדויק על הפעילות של אוכלוסיות נוירואליות מסוימות1. זה תרם כדי להבין טוב יותר את הבסיס של מעגלים עצביים והשפעתם על התנהגות בעלי חיים, כמו גם, תיקון הקימו דוגמות2,3. בין הכלים הללו רומן, אלקטרואופטיקה השיטות הגנטיות כימוגנטיות היו השפעה עמוקה לא רק על איכות של תגליות, אלא גם על הדרך ניסויים הם תוכנן ועוצב4. בכתב היד הנוכחי, אנו מתמקדים אסטרטגיות כימוגנטיות עבור שליטה על הפעלת הנוירונים באמצעות הנדסה קולטן-ligand אסטרטגיות. קולטני מעצבים המופעל באופן בלעדי על ידי תרופות מעצב (ראסטות) מייצגים את אחד הכלים הפופולריים כימוגנטי השלט רחוק של פעילות עצבית, כפי שנבדקו על ידי רוט 20165. הראסטות לנצל השתנה קולטני אצטילכולין שונה מופעלים במיוחד על ידי אינרטי, clozapine N-תחמוצת (CNO)6.
רוב המחקרים משתמשים ב-CNO על ידי זריקות הצפק (כותרת), אשר שולטת ביעילות על המינון והתזמון של הפעלת קולטנים מהונדסים בצורה חריפה. עם זאת, כאשר הפעלה חוזרת או כרונית של ראסטות נדרש, השימוש בזריקות כאלה מרובות להפוך לבלתי אפשרי. כדי לענות על בעיה זו, אסטרטגיות שונות עבור משלוח cno כרונית דווחו, כולל משאבות מושתלים7 ו בתוך הצינורית בתוך הבית8,9. על הרחבות שונות, כל האסטרטגיות האלה גורמות החיות מתח וכאב10, ודורשים התערבות כירורגית כי יכול להיות גם השפעה ישירה על התגובות התנהגותיות להיבדק11. כאן, אנו מתארים שלוש אסטרטגיות לא פולשני עבור משלוח CNO כרונית.
למטרה זו, עכברים היו stereotaxically הוזרק בהיפוקמפוס עם וירוס הקשורים adeno (AAV) קידוד גרסה מהונדסים של קולטן המוסקריאית M3 (hM3Dq) כי כאשר מופעל על ידי ליגו CNO מוביל את הירי כמו פרץ של נוירונים6. בעבר הוכח כי עין טיפה אחת המכילה CNO יכול לעורר ביעילות הפעלה חזקה של מעורר הנוירונים ביטוי12. כאן אנו מתארים שיטה שונה למסירה חוזרת של טיפות עיניים. כדי להשיג שליטה כרונית ומתמשכת של קולטני מעצבים, אנחנו הבאים לתאר אסטרטגיה לא פולשנית לספק CNO לעכברים דרך מי השתייה. לבסוף, אנו מתארים פרדיגמה חלופית לאספקת CNO במים לשתייה במהלך חלון זמן מוגבל. עכברים locomotor פעילות, כמו גם התנהגות השתייה ואת הצריכה של פתרונות קלוריק מתוק, מוגבלים בעיקר לחלק האפל של מחזור אור/כהה13,14. לכן, אימצנו פרוטוקול המבוסס על העדפת העכבר על סוכרוז. על ידי מדידת אינדוקציה של המוקדם מוקדם הגן c-Fos בתאים שנדבקו aav, כבדיקה עבור הפעלה עצבית12,15, מצאנו כי אלה cno אסטרטגיות מסירה מכבש להפעיל מבוקרת ראסטות הנוירונים על המורחבת שכים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל החיות טופלו בהתאם להנחיות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בוועדות הלאומיות של המכון הלאומי לבריאות הנפש (NIMH). כל המאמצים נעשו כדי למזער את הכאב ואת מספר החיות ששימשו.
1. adeno-הקשורים וירוס זריקות ההיפוקמפוס
הערה: סוג פראי עכברים זכרים של רקע מעורב (B6/129 F1 היברידית, 3 חודשים) היו עבור stereotaxically הוזרק עם קידוד AAV הקולטן המוסקריאית M3 (hM3Dq) לתוך ההיפוקמפוס. במהלך הניסוי כולו, העכברים היו ליחיד שוכנו, תחת אור רגיל 12 h: 12 h כהה (T24) מחזור, עם גישה למזון ולמים libitum המודעה.
- לפני ביצוע ניתוחים סטריאוטקאריים, לנקות ולעקר את המסגרת הסטריאוטקאית ואת כל המכשירים הדרושים.
הערה: וילונות כירורגיים יכול לשמש כדי לשמור על שדה סטרילי ולהפחית את אובדן החום של העכבר. - מורדם בצורה עמוקה. בעזרת העכבר כדי לעשות זאת, תחילה להתאים את מד זרימת החמצן ל כ 1.5 L/min, ולאחר מכן להתאים את מכשיר האידוי isof, כדי כ 3-5% האינדוקציה ו כ 1-3% עבור תחזוקה.
- כדי להבטיח כי בעל החיים הוא מודע לחלוטין, לצבוט את כף היד של העכבר; החיה מורדם כראוי כאשר התגובה מצמוץ לצבוט נעדר.
- מניחים את העכבר על משטח חימום כדי לשמור על יציבות טמפרטורת הגוף של העכבר.
- גלח את ראש הראש ותקן את ראש העכבר למסגרת הסטריאוטקאית. ואז, להחיל חומר סיכה המגן העינית על העיניים, לנקות את המשטח על ידי קרצוף עם povidone-יוד ו 70% אתנול, ולחשוף את הגולגולת באמצעות אזמל סטרילי.
- לכייל את המסגרת כדי ברז נקודה, ואז לקדוח בקואורדינטות המדילי-לרוחב של 2.9 מ"מ ו-האחורי הקדמי קואורדינטות-2.7 מ"מ כדי למקד את ההיפוקמפוס.
הערה: אם צריך להזריק מטרה מוחית אחרת, קבע את נקודות הציון הרצויות להזרקה באמצעות Paxinos ו-פרנקלין העכבר אטלס16. - לאחר חשיפת המוח, באופן חד-צדדי להזריק 90 nL של AAV ב-העומק הגייתי והגייתי של-3.0 מ"מ בהיפוקמפוס באמצעות מיקרומזרק ומשך פיפטות מיקרוקפילר (איור 1A).
הערה: ראה טבלה של חומרים עבור סיכוייו של aav בשימוש בניסוי זה. עבור אזורי מוח אחרים, להתאים את נפח AAV של הזרקה לפי הצורך. - בסוף ההליך כירורגי, לסגור את החתך עם תפרים ניילון להחיל אנטיביוטיקה אקטואלי לאתר הפצע.
- ניהול משככי כאבים (bu, 0.1 mg/ק"ג) מערכת באופן מיידי בעקבות הניתוח, ו 4-6 שעות לאחר.
- החל 4 שבועות לאחר ההזרקה, הנושא עכברים לכל התבניות המתוארות בסעיף הבא כדי לשלוט בנוירונים באופן כרוני לבטא את קולטן המעצב מעצב.
2. מסירת CNO חוזרות ונשנות באמצעות טיפות עיניים
- Acclimate החיות לטיפול על ידי בליטה כל העכבר 3 דקות מדי יום 3-4 ימים לפני הניהול של טיפות עיניים.
- התמוססות Clozapine-N-תחמוצת (CNO, 5 מ"ג) ב 1 מ ל סטרילי 0.9% תמיסת מלח (פתרון מניות: 5 מ"ג CNO/mL). שמור את הפתרון בקירור ב -4 ° c.
- שקול כל עכבר לפני תחילת הניסוי כדי לקבוע את כמות ה-CNO שיש להעביר. שימוש 1-3 μL שחרור (לכל עין) כדי להשיג 1.0 mg CNO/ק"ג משקל גוף.
הערה: כדוגמה, על העכבר 20 גרם לקבל הדו (2 μL כל אחד) טיפות עיניים. - העבר את טיפות העיניים במהלך השלב הלא פעיל (אור) של עכברים, 2 שעות לפני כיבוי האורות (זמן רב-זיגבר (ZT) 10). במקרים בהם יש להעביר את CNO במהלך השלב הפעיל (כהה) של עכברים, להבטיח נוכחות של אור אדום עמום לטיפול נאות בעלי חיים.
הערה: יש לנקוט אמצעי זהירות כדי להימנע מהפרעה במחזור העיגולים (ובאור/כהה) של חיות נסיוניות.- באמצעות P10 מיקרופיפטה, טען את הסכום הנדרש (1-3 μL) של פתרון CNO כדי להשיג 1.0 mg CNO/ק"ג.
הערה: השתמש בעצת צנרת חדשה וסטרילית עבור כל שטיפת עין. בקבוצת ניסויים זו בוצעו טיפות עיניים דו צדדיות של CNO; עם זאת, אם נדרש ריכוז CNO נמוך יותר, ניתן להחיל גם טיפות-עיניים חד-צדדיות. - השתק את העכבר דרך החוצה.
- מגרשים באיטיות את הפתרון עד לצורת droplet יציבה על קצה הפיפטה.
- הביאו בזהירות את ה-droplet קרוב לקרנית של עין העכבר עד למשלוח הפתרון. עצה הפיפטה לא צריכה ליצור קשר עם עין העכבר.
- שחרר את העכבר, הצבת אותו בחזרה בכלוב הבית שלו.
- באמצעות P10 מיקרופיפטה, טען את הסכום הנדרש (1-3 μL) של פתרון CNO כדי להשיג 1.0 mg CNO/ק"ג.
- חזור על הליך זה כל יום למשך 5 ימים.
הערה: משך זה ניתן להתאמה לפי הדרישות הנסיוניות. - לניסויים בבקרת, השתמש בעכברים AAV/ראסטות-מוזרק החשופים לטיפול המזויף (עין טיפות המכילות רק פתרון מלוחים), ועכברים שהוחדרו עם וקטור ריק (למשל, AAV/mCherry) חשופים לפרוטוקול CNO-טיפות עיניים מתוארים.
3. טיפול כרוני CNO מועבר דרך מי שתייה
- הפוך בקבוקים קטנים באמצעות 50 mL (פלסטיק) שפופרות חרוט ו גומי פקק מעצור; לכסות עם רדיד אלומיניום כדי למנוע כל השפעות אור בתיווך על יציבות CNO.
- שלושה ימים לפני תחילת הטיפול CNO, להחליף בקבוקי מים רגילים עם בקבוקים קטנים, המכיל 10 מ ל של מים רגילים, כדי לאפשר לעכברים לתקן אותם. אבטחו את הבקבוקים. לכלובים בעזרת קלטת
- למדוד את צריכת המים היומית עבור כל עכבר.
- שוקלים כל עכבר לפני תחילת הניסוי.
- התמוססות Clozapine-N-תחמוצת (CNO, 5 מ"ג) ב 1 מ"ל של 0.9% תמיסת מלח סטרילי. להכניס למקרר את פתרון המניה ב -4 ° c.
- השתמש במשקל הגוף ואת כמות הממוצע של מים נצרך להגדיר את הריכוז של פתרון CNO להשיג 1.0 mg CNO/ק"ג (משקל הגוף).
הערה: עכברים זכרים בוגרים (~ 20 גרם משקל גוף) צורכים ~ 5 מ ל של מים ליום (איור 2A). לכן, כדי להשיג ריכוז CNO של 1 מ"ג CNO/ק"ג, 6.4 μL של פתרון מלאי CNO להתווסף לנפח הסופי של 8 mL של מים (ריכוז סופי: 4 μg CNO/mL). כך, את המינון של CNO עבור 20 גרם חיה כי משקאות 5 מ"ל מים ליום תוצאות 1 מ"ג CNO/ק"ג. - לקבוע את מינון CNO האופטימלי המציג את האפקטיביות המקסימלית עם ריכוז CNO מינימלי על ידי בדיקת מגוון של ריכוזים. בצע ניתוח תגובה למינון כדי לקבוע את מינון CNO האופטימלי לשיטת מי השתייה.
הערה: מינונים CNO הבאים נבדקו עבור ניסוי זה: 1.0 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.1 mg/mL, ו תמיסת מלח. 1.0 mg CNO/ק"ג נבדק לראשונה, בהתבסס על כבלי ופרוטוקולים של טיפות עיניים. - ביום 1, למלא את הבקבוק עם 8 מ ל של מים רגילים ולהוסיף את הסכום הנדרש של CNO.
הערה: כמות המים הזאת מספיקה ל -24 שעות של גישה למים של מודעות פרסומת לעכבר גברי בוגר. במקרה של מינים אחרים מכרסמים משמשים, הראשון למדוד את כמות המים נצרך מדי יום כדי לקבוע את נפח הצורך. - לפקח על בריאות החיות ברחבי הפרוטוקול כדי להבטיח כי אין תופעות לוואי שליליות הנגרמות על ידי מים + צריכת CNO.
- לאחר 24 שעות, החליפו את הבקבוקים במים מתוקים + פתרון CNO. הקלט את אמצעי האחסון שנצרך במהלך היום הקודם.
- היפטר מהמים + פתרון CNO שלא נצרך במכולות פסולת. להשליך בקבוקי פלסטיק ולהחליף את הפקקים הגומי כל יום, לאחר החיטוי שלהם על פי הנחיות המתקן בעלי חיים.
הערה: אין לערבב פסולת ימית עם ממיסים אורגניים. צור קשר עם שירות סילוק כימיקלים לקבלת הוראות אחסון ואיסוף. - החליפו את הבקבוקים בו בכל יום במשך 5 ימים.
הערה: משך זה ניתן להתאמה לפי הדרישות הנסיוניות. - כלול קבוצות בקרה, כמתואר בשלב 2.6.
4. טיפול מוגבל CNO באמצעות העדפת עכברים עבור סוכרוז
- 3 ימים לפני שמתחילים בטיפול CNO, מניחים בקבוק קטן המכיל 10 מ ל של מים + 1% סוכרוז על הכלוב, רצוי הרחק מבקבוק המים המקורי.
הערה: השתמש באותם בקבוקים קטנים המתוארים בשלב 3.1. - לחשוף בעלי חיים למים + 1% סוכרוז במהלך החלק האחרון של השלב הפעיל שלהם (ZT 18 – 24). לאחר החשיפה הזאת, הסר את הבקבוק עם מים + סוכרוז מהכלוב.
הערה: ניתן להשתמש בחלונות זמן שונים של משלוח CNO. בנוסף, ניתן להציב עכברים תחת מחזור אור/כהות הפוך, שבו הופעת האור מתרחשת בשעות הערב כדי להקל על משלוח CNO. - מדוד את המים היומיים + 1% סוכרוז צריכת עבור כל עכבר.
- שוקלים כל עכבר לפני תחילת הניסוי.
- השתמש במשקל הגוף ואת הכמות הממוצעת של מים + 1% סוכות נצרך כדי לקבוע את המינון של פתרון CNO כדי להשיג 1.0 mg CNO/ק"ג (משקל הגוף).
הערה: מינון CNO האופטימלי המציג את האפקטיביות המירבית עם ריכוז CNO מינימלי צריך להיבדק, כפי שהוסבר בשלב 3.6. - ביום 1, בקבוקי מילוי עם 5 מ ל של מים + 1% סוכרוז + CNO (1 מ"ג CNO/ק"ג) ומניחים אותם על הכלוב (תמיד באותו מיקום) במהלך חלון הזמן הנחוש.
- בסוף חלון הזמן המוגבל, להסיר את הבקבוקים ולמדוד את כמות המים + סוכרוז + CNO נצרך.
הערה: חומרים ופתרונות מנוקה או נמחקים כפי שתוארו בשלב 3.11. - חזור על הליך זה כל יום למשך 5 ימים.
הערה: משך זה ניתן להתאמה לפי הדרישות הנסיוניות. - כלול קבוצת בקרה, כמתואר בשלב 2.6.
5. ניתוח נתונים
- עכברים מבשם ובעלי 4% פאראפורמלדהיד (בחצי השני) או 2 או 6 שעות לאחר קבלת האחרון החוזר (היום החמישי) CNO-ירידה העין. כאשר CNO מועבר דרך מי שתייה, להחליף CNO + מים עם מים בסוף השלב הפעיל של העכבר, ולאחר מכן מבשם את העכבר לאחר או 2 או 6 h post-CNO גישה.
הערה: אם חשיפה לאור יכולה להשפיע על אינדוקציה c-Fos בתחום העניין, שמרו על עכברים בחשיכה מתמדת במהלך היום האחרון של הניסויים, ולפני הפרזיה. - בזהירות לנתח את המוח החוצה ולטבול ב 4% הפתרון הכליייתי עבור 9-12h.
- לאחר קיבוע הלקופציה, הקפאה של רקמת המוח באמצעות פתרון של 30% סוכרוז (לחכות עד שהמוח שוקע), ואז לחלק את המוח באמצעות קריוסטט.
- להעביר את החלקים המוח ילתית (35 μm) לתוך פתרון המכיל 1x PBS, 10% בסרום פרה אלבומין, ו 0.3% טריטון X-100 עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
- מודיית את מקטעי המוח עם פתרון אנטי-c-Fos (1:2500) ב 4 ° c לילה עם עצבנות מתמדת.
- לאחר 3 שוטף של 5 דקות כל אחד עם פתרון המכיל 1x PBS ו 0.3% טריטון X-100, הדגימה את הדגימות עם הנוגדן המשני אלקסה-מצובית (1:500) פתרון עבור 1 h בטמפרטורת החדר הרחק מן האור עם עצבנות תמידית.
- להשיג תמונות דיגיטליות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. להרכיב ולעבד תמונות שנתפסו עם עריכת תמונות וניתוח תוכנה (למשל, אדובי פוטושופ).
- לניתוח נתונים, חלוקה לרמות ולמדוד את האזור נגוע AAV ((+) באמצעות תוכנת ImageJ, ולכמת את מספר c-Fos (+) תאים בתוך אזור זה כדי להשיג את מספר התאים הפעילים לאזור. שלב את התוצאות שהתקבלו מ 3 סעיפים נפרדים לכל חיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הבחנו כי משלוח CNO חוזרים באמצעות טיפות עיניים מעורר אינדוקציה חזקה של ביטוי c-Fos בנוירונים הנגועים ביותר (איור 1C), מראה כי האפקטיביות של משלוח cno מתמשכת במהלך החשיפה חוזרים. יתר על כן, אינדוקציה משמעותית של c-Fos נצפתה דגימות שנאספו 2 h לאחר טיפול CNO, לעומת דגימות שהתקבלו 6 h לאחר חשיפה CNO (דמויות 1D-E), הוכחת כי שינויים המושרה על ידי cno הם תלויי זמן.
לאחר מכן מדדנו את האפקטיביות של הטיפול CNO כרונית נמסר דרך מי שתייה. הבחנו שצריכת המים היומית + CNO לא הייתה שונה באופן משמעותי בהשוואה לנפח הכולל של המים הרגילים הנצרכים (איור 2A). באופן דומה, כמות המים + 1% סוכות הנצרכת במהלך הלילה (6 h הזמן) לא הושפע התוספת של CNO (איור 2B). יתרה מזאת, אין הבדלים בצריכה היומית (5 ימים) של שני המים + CNO (איור 2C) והמים + סוכרוז + cno (איור 2c) נמצאו לאורך כל הניסוי לכל בעלי החיים.
בדומה למה שמצאנו באמצעות CNO העין טיפות, אינדוקציה חזקה של c-Fos נצפתה לאחר 2 h אבל לא 6 h על גישה CNO (דמויות 2E-F).
לבסוף, מדדנו את תגובת המינון של CNO הוסיף מים לשתייה. כדי לעשות זאת, עכברים נחשפו הבאים CNO מינונים: 1.0 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.1 mg/mL, תמיסת מלח. בכל המקרים, בעלי חיים היו מנוצלים 2 שעות לאחר חשיפת CNO. מצאנו כי יש סף ברור של יעילות עבור CNO, שם מינון CNO נמוך (0.1 mg/mL) אינו מעורר c-Fos הפעלה לעומת שליטה מלוחים, בעוד מינונים גבוהים יותר (0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL ו-ו1.0 mg/mL) המושרה חזק ודומה c-Fos אינדוקציה ( איור 2G).
איור 1: משלוח CNO חוזר ונשנה באמצעות טיפות עיניים. (א) aav/HM3Dq-mcherry הוזרק stereotaxically בהיפוקמפוס של מבוגר (בן 3 חודשים) עכברים זכרים. (ב) ארבעה שבועות לאחר הזרקה, cno היה מנוהל באמצעות טיפות עיניים פעם ביום עבור 5 ימים רצופים. מינון של 1.0 מ"ג CNO/ק"ג שימש. (ג) בסופו של דבר, עכברים הוקרבו, ורקמת המוח נבדק עבור C-Fos (ירוק) החיסונית באזור הנגוע aav (תאי דובדבן, אדום). חלק מייצג באתר ההזרקה והפעלת CNO-תיווך c-Fos מוצג. (ד) מספר התאים c-Fos חיוביים באזור נגוע aav נמדד בעכברים כי היו 2 או 6 h לאחר הממשל האחרון cno. נתונים הם משמעות ± SEM. * * * p < 0.001; על-ידי מבחן t של הסטודנט (n = 2-3 עכברים). (ה) תמונות מייצגות עבור שתי הקבוצות מוצגות. סרגל קנה מידה: 100 יקרומטר נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: טיפול כרוני CNO מועבר דרך מי שתייה. (א) אין הבדלים בצריכת הנוזלים הכוללת שנצפו בין שליטה (מים) או טיפול (מים + cno, מינון: 1.0 MG cno/ק"ג) בעלי חיים. נתונים מתכוונים ± SEM (n = 13-14 עכברים). (ב) באופן דומה, לא נצפו הבדלים משמעותיים בנפח המים + 1% סוכות צרכו (במהלך 6 שעות הזמן), לאחר הוספת cno (1.0 מ"ג/ק"ג). נתונים מתכוונים ± SEM (n = 5 עכברים). (ג) צריכת מים יומית + cno (1.0 מ"ג/ק"ג) עבור עכברים בודדים מוצג. לא נצפו הבדלים בצריכה היומית. נתונים מתכוונים ± SEM (n = 5 עכברים). (ד) צריכת הנוזלים היומית (במהלך 6 הזמן החלון) של 1% סוכרוז + cno (1.0 מ"ג/ק"ג) עבור עכברים בודדים מוצג. לא נצפו הבדלים בצריכה היומית. נתונים מתכוונים ± SEM (n = 3 עכברים). (ה) 2 או 6 שעות לאחר הממשל האחרון cno, עכברים הוקרב, ואת מספר התאים c-Fos חיוביים היה ככמת באזור הנגוע aav. נתונים הם משמעות ± SEM. * * * p < 0.001; על-ידי מבחן t של הסטודנט (n = 5 עכברים). (ו) המוח סעיפים מקורונאליות נבדקו עבור c-Fos (ירוק) החיסונית ב-aav-הנגועים (התאים האדומים-חיוביים, אדום) באזור. תמונות מייצגות מוצגות. (G) ארבעה cno מינונים היו מנוהלים (0.1, 0.25, 0.5, ו 1.0 MG cno/ק"ג), ואת אינדוקציה c-Fos נמדד. נתונים הם משמעות ± SEM. * * * p < 0.001; על ידי ANOVA, ואחריו מבחן של Tukey (n = 2 עכברים). סרגל קנה מידה: 100 יקרומטר נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדרדים התפתחה כגישה פופולרית ואפקטיבית לתפעול מרחוק פעילות עצבית17. העיצוב של אסטרטגיות חלופיות עבור מסירת CNO יהיה להגדיל בהרחבה את הספקטרום של אפשרויות הזמינות עבור הגדרות נסיוניות ספציפיות. בנוסף, אסטרטגיות שאינן פולשנית עבור המסירה של CNO למזער את כל הפרשנות הפוטנציאלית של תוצאות על ידי הפחתת תופעות לוואי שליליות יכול ישירות להשפיע על בריאות החיה. כאן, תיארנו שתי אסטרטגיות שאינן פולשנית עבור משלוח CNO המקנים הפעלה חזקה של ראסטות (hM3Dq) ומציעים ספקטרום רחב של אפשרויות. עוד, אנו מאמינים כי הפרוטוקולים המתוארים כאן עשוי גם להיות שימושי עבור משתנים ראסטות שונים עבור מניפולציה עצביים, כולל קולטנים מהונדסים גנטית או מאופטואיד.
משלוח CNO באמצעות טיפות עיניים חוזרות מייצגת חלופה ללא כאבים לזריקות הצפק חוזרות ונשנות של CNO תוך שמירה על הכוח לשלוט בדיוק במינון ובתזמון של משלוח CNO. לכן, אנו ממליצים להשתמש בפרוטוקול זה כאשר נדרשת הפעלה חוזרת של הדרברה. טיפות עיניים הן גם האופציה הזולה ביותר עבור משלוח CNO, במיוחד לעומת הפרוטוקול באמצעות CNO הוסיף מים השתייה. CNO נמסר דרך מי שתייה, מצד שני, מעביר הפעלה כרונית ומתמשכת של ראסטות, הימנעות כל טיפול בעכבר. חשוב לציין כי פרוטוקול זה חסר שליטה מדויקת על העיתוי של משלוח CNO. חלופה שלישית, גישה מוגבלת בזמן לפתרון סוכות המכיל CNO, משלבת יתרונות משני הפרוטוקולים שנדונו בעבר. אסטרטגיה זו היא באותו זמן לא פולשנית, חוזר ופשוט לבצע. בנוסף, הוא מציע שליטה טובה יותר על העיתוי של משלוח CNO לעומת הגישה 24 h למים עם CNO. אזהרה של גישה זו היא כי ניתן להשתמש בו רק במהלך השלב הפעיל של בעלי חיים. אנו ממליצים להשתמש בשתי האסטרטגיות הכרוכות ב-CNO ב שתיית מים בשילוב עם מצלמות אינפרא-אדום או מערכת ליקוק-o-meter כדי להשיג מידע זמני מדויק אודות צריכת CNO ולכן, הפעלת הדרברה.
השפעות ארוכות-טווח שהוענקו על ידי CNO מועברת באמצעות מי שתייה דווחו בעבר. יש לנו בהצלחה להחיל CNO כרונית (5 μg/mL) טיפול במהלך 14 ימים רצופים15 כדי להעריך את ההשלכות התנהגותיות של הפעלת טוניק של מעגל לטאמו-קליפת המין מעורב בקרת מצב רוח. לחילופין, CNO סיפק את מי השתייה בריכוז של 40 mg/L כבר שימש באופן כרוני לווסת את הפעילות של נוירונים מסרומים הנירמול הגרעין18, בעוד הפונקציה של הלבלב β-תאים נשלט באמצעות cno בריכוז של 0.25 מ"ג/מ"ל מים19. בשילוב, התוצאות האלה מרמזות כי ריכוזי CNO שונים ניתן לכוונן כדי לשלוט ביעילות הדרדים. כאן, מצאנו כי מינונים שונים של CNO הוסיף מים שתייה מעורר דומה c-Fos הפעלה, רומז כי ניתוח מינון תגובה יש לבצע כדי להגדיר את המינון CNO הנמוך והאפקטיבי הנדרש. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי CNO הוא לא לחלוטין פרמקואובולוגית20; בנוסף, היא הוכיחה גם כי הפעלה vivo של ראסטות מתווכת על ידי CNO מטבוליט clozapine, אשר יש מספר מטרות אנדוגני21. לכן, המחברים מצביעים על שימוש במינונים של סף משנה של clozapine, במקום מינונים גבוהה CNO. למרות שלא הערכנו את האפקטיביות של קלוזאפין בשיטות שתוארו, מצאנו כי ריכוז cno יכול להיות מופחת ללא הפחתת משמעותית הפעלה עצבית, ולכן, מזעור תופעות לוואי הנגרמות על ידי cno-ל-קלוזאפין המרה.
לסיכום, האסטרטגיות המוצגות כאן מייצגות ערכות פוטנציאליות עבור משלוח CNO שניתן להתאים בקלות למגוון של עיצובים ניסיוניים. הם היו מתוכנן כמו אסטרטגיות פולשני שעשוי להיות שימושי עבור חוזרים או כרוניים CNO בתיווך הפעלה של נוירונים מבוקרת ראסטות, הפחתת ההשפעה של משלוח CNO על התנהגות בעלי חיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו היתה נתמכת על ידי תוכנית המחקר התוך-ציור במכון הלאומי לבריאות הנפש (ZIA MH002964-02). היינו רוצים להודות לתמיכה של הליבה התנהגותית מכרסם NIMH (ZIC MH002952).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 inch |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5 mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 mL |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µL) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3 x 1012 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
References
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
- Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
- Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
- Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
- Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
- Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).
- LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. Neuroscience. 349, 229-238 (2017).
- Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
- Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
- MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
