Summary
Her beskriver vi to ikke-invasive metoder for å kronisk kontrollere neuronal aktivitet ved hjelp av chemogenetics i mus. Eye-DROPS ble brukt til å levere Clozapine-N-oksid (CNO) daglig. Vi beskriver også to metoder for langvarig administrering av CNO i drikkevann. Disse strategiene for kronisk neuronal kontroll krever minimalt inngrep redusere dyrs stress.
Abstract
Chemogenetic strategier har dukket opp som pålitelige verktøy for fjernkontroll av neuronal aktivitet. Blant disse, designer reseptorer utelukkende aktiveres av designer narkotika (DREADDs) har blitt den mest populære chemogenetic tilnærming som brukes i moderne nevrovitenskap. De fleste studier leverer ligand Clozapine-N-oksid (CNO) ved hjelp av en enkelt intraperitoneal injeksjon, som er egnet for akutt aktivering/hemming av den målrettede neuronal befolkningen. Det er imidlertid bare noen få eksempler på strategier for kronisk modulering av DREADD-kontrollerte neurons, de fleste som er avhengige av bruk av leveringssystemer som krever kirurgisk inngrep. Her utvider vi på to ikke-invasiv strategier for å levere ligand CNO å kronisk manipulere neural befolkningen i mus. CNO ble administrert enten ved hjelp av repeterende (daglig) øyedråper, eller kronisk gjennom dyrets drikkevann. Disse ikke-invasiv paradigmer resultere i robust aktivering av designer reseptorer som holdt gjennom CNO behandlinger. Metodene som er beskrevet her tilbyr alternativer for kronisk DREADD-mediert kontroll av neuronal aktivitet og kan være nyttig for eksperimenter utformet for å evaluere atferd i fritt bevegelige dyr, med fokus på mindre invasive CNO leveringsmetoder.
Introduction
Tekniske fremskritt innen nevrovitenskap har tillatt forskerne å presist identifisere og kontrollere aktiviteten til bestemte neuronal populasjoner1. Dette har bidratt til å bedre forstå grunnlaget for neuronal kretser og deres innvirkning på dyr atferd, samt revidere etablerte dogmer2,3. Blant disse romanen verktøy, optogenetic og chemogenetic strategier har hatt en dyp innvirkning ikke bare på kvaliteten av funn, men også på vei eksperimenter er unnfanget og designet4. I dagens manuskript fokuserer vi på chemogenetic strategier for å kontrollere aktiveringen av neurons via konstruerte reseptor-ligand strategier. Designer reseptorer utelukkende aktiveres av designer narkotika (DREADDs) representerer en av de mest populære chemogenetic verktøy for fjernkontroll av neuronal aktivitet, som gjennomgått av Roth 20165. DREADDs utnytte modifiserte muskarine acetylkolin reseptorer som er spesielt aktivert av en inert ligand, Clozapine-N-oksid (CNO)6.
De fleste studier bruker CNO administreres av intraperitoneal (IP) injeksjoner, som effektivt styrer dosering og timing av konstruerte reseptorer aktivering i en akutt måte. Imidlertid, når repeterende eller kronisk DREADD aktivisering er krevde, bruken av mangfoldig IP injeksjoner bli unfeasible. For å løse dette problemet, har ulike strategier for kronisk CNO levering er rapportert, inkludert implantert minipumps7 ogintrakraniell kanyler. Til ulike utvidelser, alle disse strategiene føre til at dyrene stress og smerte10, og krever en kirurgisk inngrep som kan også ha en direkte innvirkning på atferdsdata tiltak for å bli testet11. Her beskriver vi tre ikke-invasiv strategier for kronisk CNO levering.
For dette formålet, mus ble stereotaktiskt injisert i hippocampus med en adeno-assosiert virus (AAV) koding en utviklet versjon av eksitatoriske M3 muskarine reseptor (hM3Dq) at når den aktiveres av ligand CNO fører til burst-like avfyring av neurons6. Det ble tidligere vist at en enkelt øye-drop som inneholder CNO kan effektivt lokke fram en robust aktivering av DREADD-uttrykker neurons12. Her beskriver vi en modifisert metode for repeterende levering av øyedråper. For å oppnå kroniske og vedvarende kontroll av designeren reseptorer, vi neste beskriver en ikke-invasiv strategi for å levere CNO til mus gjennom drikkevannet. Til slutt beskriver vi et alternativ paradigme for å levere CNO i drikkevann i et begrenset tidsrom vindu. Mus Locomotor aktivitet, samt drikking atferd og inntak av Sweet kalori løsninger, er stort sett begrenset til den mørke delen av lys/mørk syklus13,14. Derfor vedtok vi en protokoll basert på musen preferanse for sukrose. Ved å måle induksjon av det umiddelbare genet c-Fos i AAV-infiserte celler, som en avlesning for neuronal aktivering12,15, fant vi ut at disse CNO leverings strategier robust aktivere DREADD-kontrollerte neurons over Extended Varigheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrene var håndterte i overensstemmelse med retningslinjene av det dyr bekymre og bruk komiteer av det nasjonal off av mental sunnhet (NIMH). Alle anstrengelser var innrettet til minimere lidelsen og antallet av dyrene anvendt.
1. Adeno-assosiert virus injeksjoner i hippocampus
Merk: Wild type mannlige mus av blandet bakgrunn (B6/129 F1 hybrid, 3 måneder gammel) var for stereotaktiskt injisert med en AAV koding M3 muskarine reseptor (hM3Dq) i hippocampus. Under hele eksperimentet, mus var singel-huset, under en vanlig 12 h lys: 12 h mørk (T24) syklus, med tilgang til mat og vann Ad lib.
- Før du utfører stereotaxic operasjoner, rengjør og sterilisere stereotaxic ramme og alle nødvendige instrumenter.
Merk: kirurgiske forheng kan brukes til å opprettholde et sterilt felt og redusere mus varmetap. - Dypt bedøve musen ved hjelp av isoflurane. For å gjøre dette, må du først justere oksygen strømningsmåleren til ca 1,5 L/min, og deretter justere isoflurane fordamper til ca 3-5% for induksjon og ca 1-3% for vedlikehold.
- For å sikre at dyret er helt bevisstløs, knip musa ' s Paw; dyret er riktig anesthetized når flinching respons å klype er fraværende.
- Plasser musen på en varmepute for å opprettholde stabiliteten av musen kroppstemperatur.
- Barbere toppen av hodet og fest hodet av musen til stereotaxic rammen. Deretter påføres øye beskyttende smøremiddel på øynene, rengjør overflaten ved å skrubbe med povidon-jod og 70% etanol, og utsett skallen ved hjelp av en steril skalpell.
- Kalibrer rammen til bregma punkt, og Drill deretter ved en midtre koordinat på 2,9 mm og en fremre-bakre koordinat-2,7 mm for å målrette mot hippocampus.
Merk: Hvis andre hjernen mål må injiseres, bestemme ønsket koordinater for injeksjon ved hjelp av Paxinos og Franklin Mouse Atlas16. - Straks hjernen utsettes, injiserer man ensidig injisere 90 nL på AAV ved rygg-ventrale dybde-3,0 mm i hippocampus ved hjelp av en microinjector og trakk microcapillary Pipetter (figur 1a).
Merk: se tabell over materialer for TITER av AAV som brukes i dette eksperimentet. For andre hjerneområder må du justere AAV-volumet for injeksjon etter behov. - På slutten av den kirurgiske prosedyren, lukke snittet med nylon sting og anvende aktuelle antibiotika til såret området.
- Administrere smertestillende (buprenorfin, 0,1 mg/kg) systemisk umiddelbart etter kirurgi, og 4-6 timer etter.
- Begynnelsen 4 uker etter injeksjon, underlagt mus til noen av paradigmer beskrevet i følgende avsnitt for å kronisk kontroll neurons uttrykke designeren eksitatoriske reseptoren.
2. repeterende CNO levering ved hjelp av Eye-dråper
- Acclimate dyrene å handling av Scruffing hver musen 3 min daglig for 3-4 dager tidligere å administrasjonen av øye-oppgir.
- Løs opp Clozapine-N-oksid (CNO mg) i 1 mL steril 0,9% saltvannsoppløsning (lagerløsning: 5 mg CNO/mL). Oppbevar løsningen nedkjølt ved 4 ° c.
- Veie hver mus før du starter eksperimentet for å bestemme mengden av CNO som skal leveres. Bruk 1-3 μL dråpe (per øye) for å oppnå 1,0 mg CNO/kg kroppsvekt.
Merk: som et eksempel, en 20 g mus skal få bilaterale (2 μL hver) Eye-dråper. - Lever øyedråper under den inaktive (lys) fasen av mus, 2 h før lysene slås av (zeitgeber-tid (ZT) 10). I tilfeller der CNO må leveres i løpet av aktiv (mørk) fase av mus, sikre tilstedeværelsen av svakt rødt lys for riktig dyr håndtering.
Merk: forholdsregler bør iverksettes for å unngå å forstyrre døgn syklusen til forsøksdyr (og lys/mørke).- Ved hjelp av en P10-micropipette, Last den nødvendige mengden (1-3 μL) av CNO-løsningen for å oppnå 1,0 mg CNO/kg.
Merk: Bruk et nytt og sterilt pipette tips for hvert øye-drop. I dette settet med eksperimenter, bilaterale øyedråper av CNO ble utført; men hvis en lavere CNO konsentrasjon er nødvendig, ensidig øyedråper kan også anvendes. - Nakkens musen via scruff.
- Fjern langsomt oppløsningen til en stabil dråpe dannes på pipette spissen.
- Ta forsiktig dråpe dråpen nær hornhinnen i muse øyet til løsningen er levert. Pipette spissen bør aldri kontakte musen øyne.
- Slipp musa, plassere den tilbake i sitt hjem buret.
- Ved hjelp av en P10-micropipette, Last den nødvendige mengden (1-3 μL) av CNO-løsningen for å oppnå 1,0 mg CNO/kg.
- Gjenta denne prosedyren hver dag i 5 dager.
Merk: denne varigheten kan justeres i henhold til de eksperimentelle kravene. - For kontroll eksperimenter, bruk AAV/DREADD-injisert mus utsatt for humbug behandling (øye-dråper som bare inneholder saltoppløsning), og mus injisert med en tom vektor (f. eks AAV/mCherry) eksponert for den beskrevne CNO Eye-DROPS protokoll.
3. kronisk CNO-behandling levert gjennom drikkevann
- Lag små flasker med 50 mL (plast) koniske rør og gummipropp tuter; dekke med aluminiumsfolie for å unngå lys-mediert effekter på CNO stabilitet.
- Tre dager før du starter med CNO behandling, erstatte vanlige vannflasker med små flasker, som inneholder 10 mL vanlig vann, slik at mus til å acclimate til dem. Fest flaskene til burene ved hjelp av tape.
- Mål daglig vannforbruk for hver mus.
- Veie hver mus før du starter eksperimentet.
- Løs opp Clozapine-N-oksid (CNO mg) i 1 mL 0,9% steril saltoppløsning. Avkjøl lager løsningen ved 4 ° c.
- Bruk kroppsvekten og den gjennomsnittlige mengden vann som forbrukes for å definere konsentrasjonen av CNO-løsningen for å oppnå 1,0 mg CNO/kg (kroppsvekt).
Merk: voksne mannlige mus (~ 20 g kroppsvekt) bruker ~ 5 mL vann per dag (fig. 2a). For å oppnå en CNO-konsentrasjon på 1 mg CNO/kg, bør derfor 6,4 μL av CNO lagerløsning tilsettes et endelig volum på 8 mL vann (endelig konsentrasjon: 4 μg CNO/mL). Således, det dose av CNO for en 20 g dyr det drikker 5 mL vann per dag resultater inne 1 mg CNO/kilos. - Bestem den optimale CNO-dosen som viser maksimal effektivitet med minimal CNO-konsentrasjon ved å teste en rekke konsentrasjoner. Utfør en dose respons analyse for å bestemme den optimale CNO-dosen for drikke vanns metoden.
Merk: følgende CNO-doser ble testet for dette eksperimentet: 1,0 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,1 mg/mL, og saltvann. 1,0 mg CNO/kg ble først testet, basert på IP og øyedråper. - På dag 1, fyll flasken med 8 mL vanlig vann og tilsett den nødvendige mengden av CNO.
Merk: denne mengden vann er nok for 24 h av Ad lib vann tilgang for en voksen mannlig mus. I tilfelle andre gnagerarter brukes, må du først måle mengden vann som forbrukes daglig for å bestemme volumet som trengs. - Overvåke helsen til dyrene gjennom protokollen for å sikre at det ikke er noen ugunstige bivirkninger forårsaket av vann + CNO forbruk.
- Etter 24 h, erstatte flaskene med friskt vann + CNO løsning. Spill inn volumet som ble brukt forrige dag.
- Kast vann + CNO-oppløsningen som ikke ble brukt i Avfallsbeholdere. Kast plastflasker og erstatte gummi propper hver dag, etter desinfiserende dem i henhold til dyret anlegget retningslinjer.
Merk: ikke bland vandig avfall med organiske løsemidler. Kontakt den kjemiske avfalls tjenesten for instruksjoner om oppbevaring og henting. - Bytt flaskene på samme tid hver dag i 5 dager.
Merk: denne varigheten kan justeres i henhold til de eksperimentelle kravene. - Ta med kontroll grupper, som beskrevet i trinn 2,6.
4. begrenset CNO behandling med mus preferanse for sukrose
- 3 dager før du starter med CNO behandling, plassere en liten flaske som inneholder 10 mL vann + 1% Sukrose på buret, helst bort fra den opprinnelige vann flasken.
Merk: Bruk de samme små flaskene som beskrevet i trinn 3,1. - Utsett dyrene for vann + 1% sukrose i den siste delen av den aktive fasen (ZT 18 – 24). Etter denne eksponeringen, fjerne flasken med vann + sukrose fra buret.
Merk: ulike tidsvinduer for CNO-levering kan brukes. I tillegg mus kan plasseres under en invertert lys/mørk syklus, der utbruddet av lys oppstår i kveld timer for å lette CNO levering. - Mål daglig vann + 1% sukrose forbruk for hver mus.
- Veie hver mus før du starter eksperimentet.
- Bruk kroppsvekt og gjennomsnittlig mengde vann + 1% sukrose forbrukes for å bestemme dosen av CNO løsning for å oppnå 1,0 mg CNO/kg (kroppsvekt).
Merk: den optimale CNO-dosen som viser maksimal effektivitet med minimal CNO-konsentrasjon, bør testes, som forklart i trinn 3,6. - På dag 1, fyll flasker med 5 mL vann + 1% sukrose + CNO (1 mg CNO/kg) og plasser dem på buret (alltid på samme sted) under det fastsatte tidsvinduet.
- På slutten av begrenset tid vinduet, fjerne flaskene og måle mengden av vann + sukrose + CNO forbrukes.
Merk: materialer og løsninger blir renovert eller forkastet som beskrevet tidligere i trinn 3,11. - Gjenta denne prosedyren hver dag i 5 dager.
Merk: denne varigheten kan justeres i henhold til de eksperimentelle kravene. - Inkluder en kontrollgruppe, som beskrevet i trinn 2,6.
5. data analyse
- Perfuse mus intracardially med 4% paraformaldehyde (PFA) enten 2 eller 6 h etter å ha mottatt den siste repeterende (5. dag) CNO Eye-drop. Når CNO leveres gjennom drikkevann, erstatte CNO + vann med vann på slutten av musen er aktiv fase, deretter perfuse musen etter enten 2 eller 6 h post-CNO tilgang.
Merk: Hvis lyseksponeringen kan påvirke c-Fos induksjon i interesseområdet, bør du holde mus i konstant mørke den siste dagen av eksperimentene, og før - Forsiktig analysere hjernen ut og senk i 4% PFA løsning for 9-12h.
- Etter PFA fiksering, cryoprotect hjernevevet ved hjelp av en 30% sukrose løsning (vent til hjernen synker), deretter delen hjernen ved hjelp av en kryostaten.
- Overfør koronale hjernen seksjoner (35 μm) til en løsning som inneholder 1x PBS, 10% storfe serum albumin, og 0,3% Triton X-100 for 1 t ved romtemperatur.
- Ruge i hjernen med en anti-c-Fos (1:2500) antistoff løsning ved 4 ° c over natten med konstant omrøring.
- Etter 3 vasker av 5 minutter hver med en oppløsning som inneholder 1x PBS og 0,3% Triton X-100, ruge prøvene med en Alexa-bøyd sekundær antistoff (1:500) løsning for 1 t ved romtemperatur vekk fra lys og med konstant omrøring.
- Skaff digitale bilder med et konfokalmikroskopi mikroskop. Monter og behandle innspilte bilder med en bilderedigerings-og analyseprogramvare (for eksempel Adobe Photoshop).
- For dataanalyse, disposisjon og måle AAV-infiserte området (mCherry (+) celler) ved hjelp av ImageJ programvare, og kvantifisere antall c-Fos (+) celler i denne regionen for å få antall aktiverte celler per område. Kombiner resultatene innhentet fra 3 separate seksjoner per dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi observerte at repeterende CNO-levering ved hjelp av øyedråper elicited en robust induksjon av c-Fos-uttrykk i de fleste infiserte neurons (figur 1C), som viser at effektiviteten av CNO-leveringen opprettholdes under gjentatt eksponering. Videre ble det observert en signifikant induksjon av c-Fos i prøver som ble samlet inn 2 timer etter CNO behandling, sammenlignet med prøver som fikk 6 timer etter CNO eksponering (figur 1d-E), noe som viser at endringer indusert av CNO er tidsavhengige.
Vi målte deretter effektiviteten av den kroniske CNO-behandlingen som ble levert gjennom drikkevann. Vi observerte at det daglige forbruket av vann + CNO var ikke signifikant forskjellig sammenlignet med det totale volumet av vanlig vann konsumert (figur 2a). Tilsvarende mengden av vann + 1% sukrose konsumert i løpet av natten (6 h tid vindu) ble ikke påvirket av tilsetning av CNO (figur 2b). Videre, ingen forskjeller i det daglige forbruket (5 dager) av både vann + CNO (figur 2C) og vann + SUKROSE + CNO (figur 2D) ble funnet i hele eksperimentet for alle dyrene.
I likhet med det vi fant ved hjelp av CNO øyedråper, ble robust induksjon av c-Fos observert etter 2 timer, men ikke 6 timer ved CNO-tilgang (tall 2e-F).
Til slutt målte vi dose responsen av CNO lagt til drikkevann. For å gjøre dette, ble mus eksponert for følgende CNO-doser: 1,0 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,1 mg/mL, saltvann. I alle tilfeller var dyr perfusert 2 h etter CNO eksponering. Vi fant ut at det er en klar terskel for effektivitet for CNO, der en lav CNO-dose (0,1 mg/mL) ikke framprovosere c-Fos-aktivering sammenlignet med saltvanns kontroll, mens høyere doser (0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL og 1,0 mg/mL) indusert robust og lignende c-Fos induksjon ( Figur 2G).
Figur 1: repeterende CNO levering ved hjelp av øyedråper. (A) AAV/HM3Dq-mCherry ble stereotaktiskt injisert i hippocampus i voksen (3 måneder gammel) mannlige mus. (B) fire uker etter INJEKSJON ble CNO administrert ved bruk av øyedråper én gang daglig i 5 sammenhengende dager. Det ble brukt en dose på 1,0 mg CNO/kg. (C) til slutt ble mus ofret, og hjernevevet ble testet for C-Fos (grønn) immunoreactivity i det AAV-infiserte området (mCherry-positive celler, rød). En representativ koronale del av injeksjonsstedet og den CNO-mediert c-Fos-aktiveringen vises. (D) antall c-Fos positive celler i det AAV-infiserte området ble målt i mus som ble perfusert 2 eller 6 timer etter den siste CNO-administrasjonen. Data er gjennomsnittlig ± SEM. * * * p < 0,001; av student t-test (n = 2-3 mus). (E) representative bilder for de to gruppene vises. Scale bar: 100 μm Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: KRONISK CNO-behandling levert gjennom drikkevann. (A) ingen forskjeller i det totale væske forbruket ble observert mellom kontroll (vann) eller behandlet (vann + CNO, dose: 1,0 mg CNO/kg) dyr. Data er gjennomsnittlig ± SEM (n = 13-14 mus). (B) tilsvarende, ingen signifikante forskjeller ble observert i volumet av vann + 1% sukrose forbrukes (i løpet av en 6 h tid vindu), etter å ha lagt CNO (1,0 mg/kg). Data er gjennomsnittlig ± SEM (n = 5 mus). (C) daglig inntak av vann + CNO (1,0 mg/kg) for individuelle mus vises. Ingen forskjeller i det daglige forbruket ble observert. Data er gjennomsnittlig ± SEM (n = 5 mus). (D) daglig væske forbruk (i løpet av 6 timer vinduet) på 1% SUKROSE + CNO (1,0 mg/kg) for individuelle mus vises. Ingen forskjeller i det daglige forbruket ble observert. Data er gjennomsnittlig ± SEM (n = 3 mus). (E) 2 eller 6 timer etter den siste CNO-administrasjonen ble musene ofret, og antallet c-Fos-positive celler ble kvantifisert i det AAV-infiserte området. Data er gjennomsnittlig ± SEM. * * * p < 0,001; av student t-test (n = 5 mus). (F) hjerne koronale seksjoner ble testet for c-Fos (grønn) immunoreactivity i den AAV-infiserte (mCherry-positive celler, rød) regionen. Representative bilder vises. (G) fire CNO doser ble administrert (0,1, 0,25, 0,5 og 1,0 mg CNO/kg), og c-Fos-induksjon ble målt. Data er gjennomsnittlig ± SEM. * * * p < 0,001; av ANOVA, etterfulgt av Tukey ' s test (n = 2 mus). Scale bar: 100 μm Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DREADDs har dukket opp som en populær og effektiv tilnærming til eksternt manipulere neuronal aktivitet17. Utformingen av alternative strategier for CNO levering vil bredt øke spekteret av tilgjengelige alternativer for spesifikke eksperimentelle innstillinger. I tillegg ikke-invasiv strategier for levering av CNO minimere eventuelle feil tolkning av resultatene ved å redusere ugunstige bivirkninger som kan direkte påvirke dyrets helse. Her har vi beskrevet to ikke-invasiv strategier for CNO levering som gir en robust aktivering av DREADDs (hM3Dq) og tilbyr et bredt spekter av muligheter. Videre tror vi at protokollene beskrevet her kan også være nyttig for ulike DREADD-varianter for neuronal manipulasjon, inkludert genetisk modifiserte muskarine eller opioider reseptorer.
CNO levering ved hjelp av repeterende øye-dråper representerer et smertefritt alternativ til repeterende intraperitoneal CNO injeksjoner samtidig bevare makten til nøyaktig kontroll dosering og timing av CNO levering. Derfor anbefaler vi at du bruker denne protokollen når gjentatt DREADD-aktivering er nødvendig. Eye-dråper er også det minst kostbare alternativet for CNO levering, spesielt sammenlignet med protokollen ved hjelp CNO lagt til drikkevannet. CNO levert gjennom drikkevann, på den annen side, gir en kronisk og vedvarende aktivering av DREADDS, unngår enhver mus håndtering. Det er viktig å nevne at denne protokollen mangler presis kontroll over tidspunktet for CNO levering. En tredje alternativ, Tidsbegrenset tilgang til en sukrose løsning som inneholder CNO, kombinerer fordelene med begge protokollene tidligere diskutert. Denne strategien er på samme tid ikke-invasiv, repeterende og enkel å utføre. I tillegg gir det en bedre kontroll over tidspunktet for CNO levering sammenlignet med 24 h tilgang til vann med CNO. En påminnelse om denne tilnærmingen er at den bare kan brukes under den aktive fasen av dyr. Vi anbefaler å bruke begge strategiene som involverer CNO i drikkevann i kombinasjon med infrarøde kameraer eller et slikke-o-meter system for å få presis Temporal informasjon om CNO forbruk og derfor DREADD aktivering.
Langvarige effekter gitt av CNO levert gjennom drikkevann ble tidligere rapportert. Vi har med hell brukt en kronisk CNO (5 μg/mL) behandling i løpet av 14 sammenhengende dager15 for å evaluere de atferdsmessige konsekvensene av tonic aktivering av en thalamo-kortikale krets involvert i humør kontroll. Alternativt, CNO gitt i drikkevannet ved en konsentrasjon på 40 mg/L har blitt brukt til å kronisk modulere aktiviteten av serotonerge neurons av rygg raphe nucleus18, mens funksjonen til bukspyttkjertelen β-celler ble kontrollert ved hjelp CNO ved en konsentrasjon på 0,25 mg/mL vann19. Kombinert, disse resultatene tyder på at ulike CNO konsentrasjoner kan stilles til å effektivt kontrollere DREADDs. Her fant vi at forskjellige doser av CNO lagt til drikkevann elicited lignende c-Fos-aktivering, noe som tyder på at en dose reaksjons analyse bør utføres for å definere den laveste og effektive CNO dosen som kreves. Nyere studier har vist at CNO er ikke helt farmakologisk inert20; i tillegg ble det også demonstrert at in vivo aktivering av DREADDs er formidlet av CNO metabolitten Clozapine, som har flere endogene mål21. Derfor forfatterne foreslår å bruke subthreshold doser av Clozapine, i stedet for høye CNO doser. Selv om vi ikke har evaluert effektiviteten av Clozapine i metodene som er beskrevet, fant vi at CNO konsentrasjon kan reduseres uten signifikant å redusere neuronal aktivisering, og derfor, minimere bivirkninger forårsaket av CNO-til-Clozapine Konvertering.
Oppsummert, strategiene som presenteres her representerer potensielle ordninger for CNO levering som lett kan tilpasses en rekke eksperimentelle design. De ble unnfanget som ikke-invasiv strategier som kan være nyttig for repeterende eller kronisk CNO-mediert aktivering av DREADD-kontrollerte neurons, redusere virkningen av CNO levering på dyr atferd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av intramural forskningsprogram ved nasjonalt Institutt for psykisk helse (ZIA MH002964-02). Vi vil gjerne takke støtte fra NIMH IRP gnagere Behavioral Core (ZIC MH002952).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 inch |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5 mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 mL |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µL) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3 x 1012 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
References
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
- Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
- Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
- Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
- Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
- Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).
- LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. Neuroscience. 349, 229-238 (2017).
- Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
- Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
- MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
